Usando mudanças na transmissão de folhas para investigar movimento de cloroplasto em Arabidopsis thaliana
14 de julho de 2021
Muitas espécies de plantas alteram o posicionamento de cloroplastos para otimizar a absorção de luz. Este protocolo descreve como usar um instrumento simples e caseiro para investigar o movimento do cloroplasto nas folhas arabidopsis thaliana usando mudanças na transmissão da luz através de uma folha como proxy.
Este método mede mudanças na transmissão de luz das folhas como um proxy para o movimento do cloroplasto que influencia a absorção de luz de folhas em diferentes graus, dependendo de espécies, ambiente e mutações. Este dispositivo caseiro acessível torna possível quantificar as mudanças dinâmicas no movimento do cloroplasto de forma simples e semi-automatizada. Os dados complementam os estudos de microscopia.
É importante seguir de perto as instruções e tratar o instrumento com cuidado. Para começar, conecte o dispositivo de transmissão a uma fonte de alimentação estável e pressione o interruptor de alimentação do dispositivo para reiniciar o instrumento. Em seguida, conecte o iPad a uma fonte de energia estável.
Pressione o botão da tela inicial para ativar a tela e digite a senha para fazer login. Pressione o ícone de configurações, seguido pelo ícone de exibição e brilho. Em seguida, pressione o bloqueio automático e selecione nunca para garantir que a tela permaneça permanentemente para que o programa seja executado sem qualquer interrupção.
Em seguida, pressione o botão da tela inicial para retornar à tela principal. Depois de fechar todos os aplicativos, encontre e abra o aplicativo LeafSensor e insira as informações na tela verde que mostra texto e campos brancos. Certifique-se de que a palavra conectada seja vista na parte inferior da tela, indicando que o aplicativo está se comunicando com o dispositivo de transmissão.
Se a mensagem Adafruit NÃO Encontrada aparecer, verifique se o dispositivo está conectado e pressione novamente o botão de partida no dispositivo. Preencha os quatro primeiros campos na página do aplicativo para configurar as condições para um breve teste com clipes de folha abertos sem folhas. Comece nomeando o experimento no campo chamado nome do experimento, então escolha quantas intensidades diferentes de luz azul serão usadas no experimento digitando o número no campo chamado número de intensidades de luz, em seguida, digite as intensidades de luz azul para serem usadas selecionando um inteiro entre 0 e 3.000 e separe cada intensidade do próximo com uma círia no campo chamado intensidade azul.
Digite o tempo de cada intensidade de luz azul no campo chamado duração azul. Pressione o Experimento iniciar na seção intermediária da tela. Na parte inferior da tela, oito hífens com a mensagem Iniciar Experimento aparecerão.
Deixe o experimento funcionar até que os primeiros dados apareçam. Depois de garantir que nenhuma luz seja emitida do LED durante os primeiros dois minutos, observe a emissão de luz azul fraca por dois minutos e, em seguida, a emissão de luz azul forte por mais dois minutos. Observe também a luz vermelha intensa emitindo brevemente do LED uma vez por minuto durante esta sequência.
Verifique o status do Experimento Concluído indicado pela mensagem Experimento Terminado no inferior esquerdo da página do aplicativo e pressione o botão da tela inicial duas vezes. Deslize para fora do aplicativo e abra-o novamente. Reinicie o instrumento pressionando o botão liga/desliga para preparar o instrumento para uma corrida com folhas.
No escuro, usando apenas luz branca ou verde muito baixa, escolha uma folha larga da planta adaptada ao escuro para cobrir o LED. Prepare a tira de papel do filtro sobre o comprimento de um clipe de folha. Em seguida, faça um furo na parte superior da tira de papel do filtro para evitar cobrir o LED.
Coloque um papel de filtro umedecido na parte do clipe da folha que contém o LED. Remova o clipe de folha adaptado à escuridão da placa de Petri e, em seguida, coloque a folha na parte superior do papel filtro molhado de seu clipe de folha, garantindo que a superfície da folha adaxial esteja voltada para o LED. Em seguida, coloque a outra parte do clipe da folha com um transistor de foto na parte superior.
Se necessário, use um elástico para segurar duas partes de clipe de folha juntas. Coloque o clipe da folha no respectivo barco e usando uma pipeta, encha os reservatórios com água, garantindo que a folha ou pelo menos o papel filtro toque a água para evitar a desidratação das folhas durante a corrida. Configure o aplicativo LeafSensor no iPad e digite EXPLORA1 no campo chamado nome do experimento.
Tipo 10 no campo chamado número de intensidades de luz. Em seguida, digite os números no campo chamado intensidade azul e duração azul. Pressione o Experimento de Início de Imprensa.
Após o primeiro minuto, observe os valores de saída apresentados. Se os valores estiverem distantes, verifique se as folhas foram colocadas corretamente nos clipes de folha. Quando a execução for concluída, os dados serão salvos automaticamente.
Depois de girar a tela na posição vertical, duas opções, salvamento e utilitários, aparecerão na tela. Pressione utilitários e, em seguida, a partir da lista dos arquivos salvos, selecione o arquivo EXPLORA1. Abaixo da lista de arquivos, o EXPLORA1 agora aparecerá em experimento selecionado.
Em seguida, pressione e-mail. Digite um endereço de e-mail e o arquivo EXPLORA1 será automaticamente anexado à mensagem e, em seguida, pressione Enviar. Os dados de transmissão percentual foram plotados contra o tempo que mostram que a transmissão de Arabidopsis thaliana diminuiu em baixas intensidades de luz, enquanto uma resposta de evasão foi induzida quando as intensidades de luz aumentaram ainda mais.
Os valores médios de transmissão percentual do tipo selvagem e mutante Arabidopsis thaliana folhas durante 19 horas de duração são mostrados. Quando as folhas foram expostas à luz azul baixa tanto em mutantes do tipo selvagem quanto de phot2, a queda rápida inicial na transmissão foi seguida por uma diminuição lenta, indicando que os cloroplastos estavam se movendo para a resposta de acumulação. Comparado ao tipo selvagem, phot1 mostrou uma resposta de acumulação reduzida.
Quando a intensidade da luz azul é aumentada stepwise após 11 horas, a transmissão percentual aumenta e os cloroplastos se movem para a resposta de evasão. Os graus de mudança na transmissão percentual em relação ao valor escuro, também chamado delta T, dependiam das intensidades exatas da luz azul. Os valores negativos indicam que as folhas apresentaram uma resposta de acumulação, enquanto os valores positivos indicam uma resposta de evasão.
A velocidade de mudança na transmissão é calculada como a inclinação da mudança na transmissão quando a luz é aumentada. No exemplo representativo, a velocidade de transmissão mudou durante as respostas iniciais quando a evasão foi acionada à medida que a intensidade da luz azul aumentava. Ao investigar as mudanças de transmissão em um mutante ou espécie não caracterizada, confirme como os valores de transmissão e as posições de cloroplasto se correlacionam com um estudo de microscopia.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método para investigar o movimento de cloroplastos em folhas de Arabidopsis thaliana mediante a medição de alterações na transmissão de luz. O instrumento construído em laboratório permite a quantificação semi-automatizada da dinâmica dos cloroplastos, complementando estudos por microscopia.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia vegetal
- Movimento de cloroplastos
- Otimização da absorção de luz
Contexto
- A posição dos cloroplastos afeta a absorção de luz nas plantas.
- Diferentes espécies e fatores ambientais influenciam o movimento dos cloroplastos.
- Compreender a dinâmica dos cloroplastos é essencial para a fisiologia vegetal.
- Este método oferece uma solução economicamente viável para pesquisadores.
Objetivo do Estudo
- Quantificar o movimento dos cloroplastos em resposta à luz.
- Fornecer um método simples para pesquisadores.
- Aprimorar a compreensão dos mecanismos de adaptação das plantas.
Métodos Utilizados
- Medição da transmissão de luz através das folhas.
- Uso de um dispositivo construído em casa para coleta de dados.
- Conexão a fontes de energia estáveis para funcionamento.
- Siga instruções específicas para obter resultados precisos.
Resultados Principais
- Foram quantificadas as mudanças dinâmicas no movimento dos cloroplastos.
- O método mostrou-se eficaz em diversas condições.
- Os resultados complementaram estudos existentes de microscopia.
- O cuidado com o instrumento é essencial para dados confiáveis.
Conclusões
- O método é uma ferramenta valiosa para o estudo da dinâmica dos cloroplastos.
- Permite pesquisas semi automatizadas e acessíveis.
- Estudos futuros podem expandir os achados relacionados à absorção de luz.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo fornece um método semiautomatizado e economicamente viável para quantificar o movimento de cloroplastos em folhas de plantas mediante a medição de alterações na transmissão de luz. Ele permite a triagem em alto rendimento de mutantes e respostas ambientais que afetam a eficiência fotossintética, apoiando a validação precoce de alvos em sistemas de bioprodução baseados em plantas. A abordagem complementa a microscopia ao fornecer dados quantitativos e dinâmicos adequados para a redução de riscos mecanicistas na engenharia de vias fotossintéticas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses fotossintéticas mediante a correlação entre alterações na transmissão e o posicionamento de cloroplastos sob diferentes condições de luz.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de genes envolvidos em cascatas de sinalização do sensoriamento luminoso ao movimento em Arabidopsis thaliana.
- Valor Preditivo: Quantifica respostas de acúmulo e de evitação por meio de métricas Delta T, auxiliando no triagem fenotípica de mutantes fotossintéticos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do ensaio: Gera dados quantitativos padronizados de transmissão em diversas intensidades de luz azul para avaliação fenotípica reprodutível.
- Escalabilidade: O instrumento de construção própria permite testes paralelos de amostras de folhas sob regimes controlados de luz, aumentando a produtividade do screening.
- Reutilização da plataforma: Permite o monitoramento contínuo da dinâmica dos cloroplastos em resposta a perturbações químicas ou ambientais durante experimentos prolongados.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Continuidade Translacional: Relaciona mecanismos de percepção da luz ao reposicionamento funcional de cloroplastos, contribuindo para modelos preditivos de eficiência fotossintética.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Permite a análise dos fenótipos de mutantes phot1 e phot2 para esclarecer os papéis de cada componente nas vias de transdução de sinal.
- Sistema com Relevância para Doenças: Oferece um sistema escalável para estudar o comportamento dos cloroplastos em condições de estresse relevantes para a produtividade agrícola e a produção de biomassa.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta que vai do teste de hipóteses sobre alvos à triagem fenotípica, especialmente para características relacionadas à utilização da luz e ao desempenho fotossintético em sistemas de plataformas vegetais.
- Biologia da Descoberta: Testa hipóteses sobre os mecanismos de movimento de cloroplastos mediante a quantificação de alterações na transmissão em resposta a aumentos graduais da luz.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos reprodutíveis (porcentagem de transmissão, Delta T, velocidade de transmissão) que permitem comparações entre genótipos e condições de tratamento.
- Análise: Oferece cálculos de velocidade de transmissão e Delta T baseados na inclinação para quantificar respostas dinâmicas e apoiar a análise comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta mutantes moleculares a resultados funcionais na fotossíntese, apoiando o avanço ajustado ao risco na otimização de linhagens.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para estudos longitudinais da dinâmica de cloroplastos sob diferentes exposições ambientais ou químicas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista na sinalização fotossintética ao fornecer indicadores quantitativos e dinâmicos para a localização de cloroplastos.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade por meio do registro semi-automatizado de dados e operação estável do instrumento.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar ou não avançar no desenvolvimento de linhagens ao associar perturbações genéticas a fenótipos fotossintéticos mensuráveis.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos fotossintéticos com base em perfis quantificados de respostas de evitação e acúmulo.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em fisiologia vegetal e mecanismos fotossintéticos para interpretar as alterações de transmissão no contexto biológico.
- Depende de fontes de energia estáveis e conectividade funcional entre o iPad e o aplicativo LeafSensor para aquisição contínua de dados.
- Necessita de protocolos padronizados de preparação das folhas e adaptação no escuro para garantir comparabilidade de referência entre as medições.
- Envolve manuseio cuidadoso do dispositivo caseiro de transmissão para manter a precisão do sensor e a consistência do LED.
- Limita-se a alterações relativas de transmissão; a determinação da posição absoluta dos cloroplastos exige microscopia complementar para validação.
