Name: Isolamento e Seleção de Fungos Entomopatômicos de Amostras de Solo e Avaliação da Virulência Fúngica contra Pragas de Insetos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Aprenda a isolar fungos entomopatogênicos de amostras de solo usando Tenebrio molitor como isca. Este método combina triagem de patogenicidade, termotolerância e produção de conídios para selecionar isolados de alta virulência.

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Esta pesquisa foi apoiada pelo Grant 109-2313-B-005 -048 -MY3 do Ministério da Ciência e Tecnologia (MOST).

NOTA: Todo o fluxograma é mostrado na Figura 1.
1. Isolamento e seleção de potenciais fungos entomopatogênicos (EPF)
<ol><li>Coletar a amostra do solo<ol>
<li>Remova 1 cm do solo superficial e colete o solo dentro da profundidade de 5-10 cm usando uma pá de cada local de amostragem. NOTA:Os locais de amostragem seriam uma montanha, floresta ou áreas pouco povoadas para evitar a contaminação de cepas de EPF artificialmente pulverizadas. Certifique-se de que as áreas para a coleta de amostras de solo estejam cobertas com a identidade na superfície. Solo seco ou solo úmido não é adequado para este experimento.</li>
		<li>Regissua os detalhes de cada local de amostragem, incluindo GPS, elevação, tipo de campo, temperatura anual, precipitação anual, tempo de coleta (estação), tipo de solo e valor de pH.</li>
		<li>Colete 100 g da amostra do solo em um saco plástico e mantenha-o à temperatura ambiente se submá-lo ao protocolo de isolamento fúngico em laboratório dentro de 3h. NOTA: Se a amostra não puder ser usada dentro de 3h, armazene o solo à temperatura ambiente em condições escuras. Se o experimento não for realizado imediatamente, a amostra do solo pode ser armazenada a 4 °C por 1 semana até o início do protocolo18,19.</li>
	</ol></li>
	<li>Isca e isolar o EPF com minhoca (Tenebrio molitor)<ol>
<li>Coloque 100 g da amostra do solo em um copo plástico (diâmetro da tampa = 8,5 cm, altura = 12,5 cm), e depois coloque 5 minhocas na superfície do solo à temperatura ambiente no escuro por 2 semanas. NOTA: Outros tipos de recipientes de copo plástico também podem ser usados. Se os solos estiverem muito secos (rachados ou arenosos), pulverize ddH2O esterilizado (cerca de 5-10 mL) nos solos. O comprimento do corpo c.a. 2,5 cm (14th instar) de larvas T. molitor ajuda em telas de isolamento fúngico20.</li>
		<li>Observar e registrar as larvas diariamente para mortalidade e micose; manter as larvas mortas no copo até 2 semanas para isolamento fúngico. NOTA: O esporo de conidia fúngica nas amostras do solo se anexará às larvas de minhoca durante o processo acima. A micose fúngica será observada à medida que a hifa crescer a partir da membrana intersegmental, e então todo o corpo será coberto com o micélio. A esporulação começará após 7 dias e a cor da infecção fúngica mudará para a cor da massa conidia.</li>
		<li>Transfira os insetos mortos para um banco limpo e use um palito estéril para coletar a conidia. Listra-los em um quarto de força Sabouraud dextrose agar medium (1/4 SDA) placa (55 mm) no laboratório21. Incubar a placa de cultura a 25 °C durante 7 dias para obter a cultura primária dos fungos. NOTA: A placa 1/4 SDA é preparada da seguinte forma: Misture 1,5 g de caldo de dextrose Sabouraud e 3 g de ágar em 200 mL de H2O e, em seguida, esterilize por 20 min. Alíquota 1/4 SDA em cada placa de Petri de 55 mm antes da solidificação. As placas SDA solidificadas 1/4 são armazenadas a 4 °C até usar.</li>
		<li>Re-raiar cada fungo de cultura primária em uma placa SDA de 55 mm 1/4 em um fluxo laminar e incubar a placa de cultura a 25 °C por 7 dias para obter colônias únicas de fungos.</li>
		<li>Repita este re-isolamento ~2-3 vezes e observe sob microscopia leve para obter colônias fúngicas morfológicas únicas e puras. NOTA: Isole todo o EPF usando T. molitor-isca e armazene conforme descrito na seção a seguir. A separação, preservação, cultura pura e estonteamento devem ser realizadas em um fluxo laminar nas seções subsequentes.</li>
	</ol></li>
	<li>Armazene os isolados do EPF<ol>
<li>Corte 3 dos blocos de ágar de 5 mm na borda de cada placa cultivada pura e pura isolada com um borer de rolha e coloque-o em um tubo de microcrédito de 1,5 mL como uma réplica. NOTA: São recomendadas três réplicas para cada isolado fúngico para o armazenamento das cepas EPF após o 2º teste de virulência. A identificação molecular também é recomendada se o espaço de armazenamento for limitado.</li>
		<li>Adicione 250 μL de solução surfactante de 0,03% (Tabela de Materiais) e 250 μL de 60% de glicerol no tubo de microcrédito de 1,5 mL usando uma micropipette; então, vórtice para 10 s.</li>
		<li>Sele o tubo de microcrédito de 1,5 mL com filme de parafina e pré-la em uma geladeira de -20 °C por 24 h. Em seguida, transfira os estoques fúngicos pré-cozidos para um refrigerador de -80 °C para criopreservação. NOTA: Foram utilizadas placas de cultura fúngica extra pura (além das amostras preservadas por criocultura) na seção 1.4.</li>
	</ol></li>
	<li>1ª tela de patogenicidade para isolados fúngicos<ol>
<li>Coloque cinco larvas T. molitor diretamente na superfície de cada placa de cultura fúngica pura a 25 °C.</li>
		<li>Observe e regise a micose e a mortalidade por 10 dias. Selecione o isolado fúngico para análise posterior. NOTA: Isolados fúngicos que causam 100% de mortalidade são selecionados para o 2º teste de virulência para confirmar sua virulência às larvas T. molitor . Alternativamente, o pesquisador pode ajustar os critérios conforme seu próprio estudo.</li>
	</ol></li>
	<li>2º teste de virulência de isolados fúngicos NOTA: Com base na 1ª tela de patogenicidade, recupere os isolados fúngicos selecionados a partir de -80 °C para o 2º teste de virulência. O objetivo do 2º teste de virulência é quantificar a patogenicidade dos isolados fúngicos selecionados após a 1ª rodada de triagem.<ol>
<li>Colher conidia de cada fúngico isolado por vórtice por 1 min e contar o número de conidia usando um hemótmetro.</li>
		<li>Ajuste a suspensão conidia a uma concentração de 1 x 107 conidia/mL em uma solução surfactante de 0,03% (Tabela de Materiais).</li>
		<li>Espalhe 10 μL da suspensão fúngica em placas 55 mm 1/4 SDA e cresça por 7 dias a 25 °C no escuro.</li>
		<li>Coloque cinco larvas T. molitor diretamente na superfície de cada placa de cultura fúngica pura (c.a. 6 x 107 conidia). Sele as placas com filme de parafina e incubar a 25 °C no escuro.</li>
		<li>Observe e regise a micose e a mortalidade por 10 dias.</li>
		<li>Repita o teste (da etapa 1,51 a 1,5,5) em triplicado para cada isolado fúngico. NOTA: Isolados fúngicos que causam 100% de mortalidade são selecionados para o 3º teste de virulência para confirmar sua virulência para atingir a praga.</li>
	</ol></li>
	<li>3º teste de virulência de isolados fúngicos para pragas alvo (Spodoptera litura como exemplo)<ol>
<li>Repetir as etapas 1.5.2 a 1.5.6 com isolados selecionados da 2ª virulência para testar a virulência contra praga alvo.</li>
		<li>Calcule o LT50 de cada isolado fúngico22. NOTA: O LT50 de cada isolado fúngico foi calculado através de modelos lineares generalizados (GLMs) utilizando o estúdio R (versão 3.4.1); a distribuição de erros quaseibinomiais e uma função de link de registro podem ser usadas para explicar a superdispersão.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Identificação molecular da EPF
<ol><li>Extração de DNA genômico fúngico<ol>
<li>Recolher c.a. 1 cm2 EPF da placa SDA de 7 dias 1/4.</li>
		<li>Extrair o DNA genômico fúngico usando um kit de extração de DNA genômico fúngico de acordo com as instruções do fabricante23 (Tabela de Materiais).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Amplificação pcr e sequenciamento de DNA<ol>
<li>Amplie a região de FUNGAL ITS por PCR da amostra de DNA21 usando o conjunto de primer PCR Master Mix (2x), ITS1F/ITS4R24 (Tabela 1) com o seguinte programa PCR: 94 °C por 1 min, e, em seguida, 35 ciclos de 94 °C para 30 s, 55 °C para 30 s e 72 °C para 1 min, seguido por uma extensão final de 7 min a 72 °C. NOTA: O conjunto de primer ITS1F/ITS4R é para identificação do nível do gênero.</li>
		<li>Sequenciar o PCR pelo serviço de sequenciamento comercial.</li>
		<li>Use a pesquisa NCBI BLAST para fungos semelhantes no banco de dados NCBI e selecione as espécies relativas do tipo fúngico para análise filogenética. NOTA: As espécies fúngicas pertencentes ao gênero de Metarhizium ou Beauveria devem ser identificadas ainda mais ao nível da espécie com tef-983F/tef-2218R primer set25 (passos repetidos 2.1.1 a 2.2.3). Para fungos que não pertencem aos gêneros Metarhizium ou Beauveria, outros marcadores moleculares podem ser usados para identificar as espécies, incluindo DNA lyase (APN2), beta tubulin (BTUB), RNA polymerase II maior subunidade (RPB1), RNA polymerase II segunda maior subunidade (RPB2) e porção de 3' do fator de alongamento de tradução 1 alfa (TEF)25,26 .</li>
	</ol>
</li>
	<li>Análise filogenética<ol>
<li>Use o software ClustalX 2.127 para alinhar as múltiplas sequências das etapas 2.2.2 e 2.2.3. Apare manualmente a região de sequências conservadas com GeneDoc28.</li>
		<li>Realize a análise filogenética pelo software MEGA729 com base nos métodos de evolução mínima (ME), Junção de Vizinhos (NJ) e probabilidade máxima (ML). NOTA: A execução dos três métodos pode ajudar a confirmar e concluir com precisão o status de classificação. Os isolados fúngicos rastreados pela 1ª tela de patogenicidade são usados para identificação molecular no nível do gênero. Os isolados fúngicos examinados pelo 2º teste de virulência são usados para a identificação molecular e morfológica do nível da espécie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Identificação morfológica da EPF
<ol><li>Observação da morfologia da colônia fúngica<ol>
<li>Use uma câmera para capturar o crescimento da colônia de cultura fúngica por 7 dias, e registrar o crescimento, forma (fofa, firme) e cor das colônias.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Observação de conidia e conidioforos<ol>
<li>Raspe conidia da colônia fúngica de cultura pura com um laço de inoculação e transfira os esporos para um escorregador de vidro com solução 0,1% Tween 80. Em seguida, cubra com um tapa-tampa para observação microscópica leve de conidia.</li>
		<li>Use um bisturi para cortar um bloco de 5 mm2 de ágar da cadeia de hignênicos na borda da colônia fúngica e, em seguida, transfira o bloco de ágar para um slide de vidro.</li>
		<li>Realize a limpeza da seguinte forma: Adicione a solução 0,1% Tween 80 no bloco de ágar com um conta-gotas de plástico e lave a maior parte do excesso de conidia usando pinças. Em seguida, cubra-o com um tapa-tampa para observação leve. NOTA: 0,1% Interpol 80 pode ser substituída por outra surfactante mais potente (Tabela de Materiais) dependendo de espécies fúngicas e hidroofobidade.</li>
		<li>Meça e regisse a largura e o comprimento das conidia e conidioforos para comparar as diferenças entre diferentes isolados fúngicos.</li>
		<li>Use o teste ANOVA da Welch e o teste Games-Howell (teste pós-hoc) para analisar a largura e o comprimento conidiais de cada cepa usando o estúdio R (versão 3.4.1). NOTA: A análise de dados de caracteres morfológicos pode ser ajustada por casos. Os isolados fúngicos selecionados com o 3º teste de virulência são utilizados para a caracterização fisiológica e o ranking ECN nas seções 4 e 5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Investigação de produtividade conidial e termotolerância
<ol><li>Ensaio de produção conidial<ol>
<li>Cultura o fúngico selecionado isolar em 1/4 SDA médio a 25 ± 1 °C no escuro por 10 dias.</li>
		<li>Prepare 1 mL da suspensão conidial do isolado fúngico em solução surfactante de 0,03% e ajuste para 1 x 107 conidia/mL conforme descrito acima.</li>
		<li>Solte três gotículas de 10 μL de suspensão conidial on1/4 SDA e incubar a 25 °C no escuro por 7, 10 e 14 dias para contar a esporulação de fungos. NOTA: 10 μL é o melhor volume para coletar o bloco de 5 mm com esporulação fúngica uniforme após o crescimento fúngico por 7-14 dias.</li>
		<li>Use o borer de cortiça para desconectar 5 mm do bloco de ágar do centro da colônia e transferir para 1 mL de solução surfactante de 0,03% (Tabela de Materiais) em um tubo de micro centrífugas de 1,5 mL em cada ponto de tempo.</li>
		<li>Vórtice o tubo a 3.000 rpm à temperatura ambiente por 15 minutos e use um hemótmetro para contar o número de conidia. NOTA: A fórmula utilizada para a contagem é o número de conidia por 25 quadrados da menor célula (tamanho = 0,025 mm2; profundidade da câmara = 0,1 mm): Total Não de conidia em 5 praças ÷ 80 × (4 × 106)</li>
		<li>Repita três vezes para cada isolado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ensaio de termotolerância<ol>
<li>Cultura o fúngico selecionado isolar em 1/4 SDA médio a 25 ± 1 °C no escuro por 10 dias.</li>
		<li>Prepare 1 mL da suspensão conidial do isolado fúngico em solução surfactante de 0,03% e ajuste para 1 x 107 conidia/mL conforme descrito acima.</li>
		<li>Vórtice a suspensão conidial e aqueça-a em um banho seco de 45 °C por 0, 30, 60, 90 e 120 min. Solte três gotículas de 5 μL da suspensão conidial em 55 mm 1/4 SDA médio em cada ponto após a exposição ao calor e incubar a 25 ± 1 °C por 18 h. NOTA: Evite espalhar as gotículas fúngicas para poder se concentrar melhor na área.</li>
		<li>Conte o número de esporos de conidia germinados com cinco campos selecionados aleatoriamente sob microscopia leve de 200x para determinar a taxa de germinação.</li>
		<li>Execute três réplicas para cada isolado.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Classificação de número de conidia eficaz (ECN)
<ol><li>Cálculo da ECN NOTA: Obtenha os dados de produção conidial e termotolerância de cada cepa fúngica potencial antes de calcular o ECN21 total.<ol>
<li>Calcule a troca de dobras (FC) da produção conidial em cada ponto de tempo: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62882/62882eq01.jpg"> onde, x = ponto de tempo para coleta de dados; ncp = número de conidia após cada dia de crescimento; e I = número inicial de conidia semeada.</li>
		<li>Calcule o número de conidia sob o tratamento de estresse em cada ponto de tempo usando a seguinte fórmula: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62882/62882eq02.jpg"> Onde, y = o ECN do ponto de tempo em tratamento; TT0 = a taxa de germinação da conidia não submetida ao estresse térmico (= taxa de germinação de 0 min tratamento térmico); TTz = coeficiente de estresse é a taxa de germinação conidia em diferentes momentos de tratamento térmico (z).</li>
		<li>Calcule o ECN total usando a seguinte fórmula: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/62882/62882eq03.jpg">
</li>
		<li>Compare a ECN de cada cepa fúngica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Análise de componentes principais (PCA) de cepas fúngicas NOTA:A análise do PCA confirma o ranking da ECN e ajuda na compreensão da correlação entre os valores do caráter fisiológico. Compare os valores ECN e selecione isolados EPF com valores de ECN mais elevados.</li>
	<li>Use o software R para criar PCA codificando: #Input arquivo de dados PCA a = read.table ("PCA.csv",sep=',',cabeçalho=T)<ol>
<li># Processamento de dados amostrais row.names(a) &lt;- c("NCHU-9", "NCHU-11", "NCHU-64", "NCHU-69", "NCHU-95", "NCHU-113") X=row.names(a) df&lt;- a[2:11]</li>
		<li>cálculo #PCA pca &lt;-prcomp(df, centro = TRUE, escala = TRUE) vars &lt;- (pca$sdev)^2 pc1_percent = vars[1] / soma(vars) pc2_percent = vars[2] / soma(vars) valor = pca$x</li>
		<li>#Output arquivo de visualização PCA png (arquivo = 'pca.png', altura = 2000, largura = 2000, res = 300) NOTA: Utilize de 7 a 14 dias de produção conidial e todos os dados de termotolerância para executar a análise de componentes principais (PCA) para confirmar o ranking da ECN.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selecione as cepas fúngicas de melhor desempenho com base na ECN ou PCA e realize o teste de virulência de pragas-alvo para novas pesquisas.</li>
</ol>

Os autores declaram que não há conflito de interesse envolvido neste trabalho.

Fungos entomopatômicos (EPF) têm sido usados para o controle de insetos. Existem vários métodos para isolar, selecionar e identificar EPF30,31,32. Comparando os diferentes tipos de métodos de isca de insetos, a anisopliae Beauveria bassiana e Metarhizium foram comumente encontradas em iscas de insetos6,12,13,14.</...

Atualmente, os fungos entomopatômicos (EPF) são amplamente utilizados no controle microbiano de pragas agrícolas, florestais e horticulturais. As vantagens do EPF são suas amplas faixas de hospedagem, boa adaptabilidade ambiental, natureza ecológica, e que pode ser usada com outros produtos químicos para mostrar o efeito sinérgico para o manejo integrado de pragas1,2. Para a aplicação como agente de controle de pragas, é necessário isolar um grande número de EPF de insetos doentes ou do ambiente natural.
A amostragem desses organismos de seus hospedeiros ajuda na compreensão da distribuição geográfica e da prevalência da EPF em hospedeiros naturais3,4,5. No entanto, a coleta de insetos infectados fúngicos são geralmente limitadas por fatores ambientais e populações de insetos no campo4. Considerando que os hospedeiros de insetos morrerão após a infecção pelo EPF e, em seguida, cairão no solo, o isolamento do EPF das amostras do solo pode ser um recurso estável3,6. Por exemplo, saprophytes são conhecidos por usar o hospedeiro morto como seu recurso para o crescimento. A isca do solo e os sistemas médios seletivos têm sido amplamente utilizados para detectar e isolar o EPF do solo3,4,7,8,9,10.
No método médio seletivo, a solução de solo diluído é banhada em um meio contendo antibióticos de amplo espectro (por exemplo, clorofenicol, tetraciclina ou estreptomicina) para inibir o crescimento de bactérias2,3,9,11. No entanto, foi relatado que esse método pode distorcer a diversidade e densidade da cepa e pode causar uma super ou subestimação de muitas comunidades microbianas6. Além disso, as cepas isoladas são menos patogênicas e competem com saprofitos durante o isolamento. É difícil isolar a EPF da solução de solo diluída3. Em vez de usar um meio seletivo, o método de isca do solo isola o EPF dos insetos mortos infectados, que podem ser armazenados por 2-3 semanas, fornecendo assim um método de separação EPF mais eficiente e padrão3,4,7,6. Como o método é fácil de operar, pode-se isolar uma variedade de cepas patogênicas a um baixo custo4. Portanto, é amplamente utilizado por muitos pesquisadores.
Ao comparar os diferentes tipos de sistemas de isca de insetos, Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae são as espécies EPF mais comuns que são encontradas em insetos pertencentes à Hemiptera, Lepidoptera, Blattella e Coleoptera6,12,13,14. Entre essas iscas de insetos, Galleria mellonella (ordem Lepidoptera) e Tenebrio molitor (ordem Coleoptera) mostram maiores taxas de recuperação de Beauveria e Metarhizium spp., quando comparados com outros insetos. Portanto, G. mellonella e T. molitor são comumente usados para isca de insetos. Ao longo dos anos, o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA) estabeleceu uma Biblioteca EPF (Coleção de Serviços de Pesquisa Agrícola de culturas EPF, ARSEF) que contém uma grande variedade de espécies, incluindo 4081 espécies de Beauveria spp., 18 espécies de Clonostachys spp., 878 espécies de Cordyceps spp., 2473 espécies de Metarhizium spp., 226 espécies de Purpureocillium spp., e 13 espécies de Pochonia spp. entre outras15. Outra Biblioteca EPF foi construída pelo Laboratório de Pesquisa em Entomologia (ERL) da Universidade de Vermont, nos Estados Unidos, por 30 anos. Inclui 1345 cepas de EPF dos Estados Unidos, Europa, Ásia, África e Oriente Médio16.
Para controlar pragas locais ou de invasão em Taiwan, é necessário o isolamento e a seleção de EPF indígenas. Portanto, neste protocolo, modificamos e descrevemos o procedimento do método de isca do solo e o combinamos com o sistema isca de inseto (minhoca, Tenebrio molitor)17. Com base neste protocolo, foi criada uma biblioteca da EPF. Foram realizadas duas rodadas de triagem (quantificação da inoculação) para os isolados preliminares da EPF. Os isolados do EPF apresentaram patogenicidade aos insetos. As cepas potenciais foram submetidas a identificações morfológicas e moleculares e posteriormente analisadas pelo ensaio termotolerância e produção conidial. Além disso, também foi proposto um conceito de número de conidia eficaz (ECN). Utilizando a fórmula ECN e a análise de componentes principais (PCA), as cepas potenciais foram analisadas sob pressão ambiental simulada para concluir o processo de criação e triagem da biblioteca do EPF. Posteriormente, foram testadas patogenicidades de cepas promissoras de EPF para a praga alvo (por exemplo, Spodoptera litura). O protocolo atual integra dados de termotolerância e produção conidial na fórmula ECN e análise pca, que podem ser utilizados como um sistema de classificação padrão para pesquisas relacionadas ao EPF.

<table><tbody><tr><td>Ágar Grau bacteriológico</td><td>BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd.</td><td>AGR001</td><td>Adequado na maioria das aplicações de cultura celular/molecular, biologia.</td></tr><tr><td>AGAROSE, Grau de Biotecnologia</td><td>BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd.</td><td>AGA001</td><td>Para eletroforese de DNA.</td></tr><tr><td>BioGreen Safe DNA Gel Buffer</td><td>BIOMAN</td><td>SDB001T</td><td></td></tr><tr><td>Broca de cortiça de latão</td><td>Dogger</td><td>D89A-44001</td><td></td></tr><tr><td>Canon beijo x2</td><td>Canon</td><td>EOS 450D</td><td>Para registro de morfologia de colônia de tensão</td></tr><tr><td>Incubadora de temperatura constante</td><td>Yihder Co., Ltd.</td><td>LE-509RD</td><td>Manutenção de fungos.</td></tr><tr><td>Mini-Centrífuga cubee</td><td>GeneReach</td><td>MC-CUBEE</td><td></td></tr><tr><td>DigiGel 10 Sistema de Imagem Digital em Gel</td><td>TOPBIO</td><td>DGIS-12S</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F2 0.2 a 2 &micro; Pipeta L</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642010</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F2 1 a 10 &micro; Pipeta L</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642030</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F2 10 a 100 &micro; Pipeta L</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642070</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F2 100 a 1000 &micro; L Pipeta</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642090</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F2 2 a 20 &micro; Pipeta L</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642060</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F2 20 a 200 &micro; L Pipeta</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642080</td><td></td></tr><tr><td>GeneAmp Sistema de PCR 9700</td><td>Applied Biosystems</td><td>4342718</td><td></td></tr><tr><td>GenepHlow Gel/PCR Kit</td><td>Incubadora de Banho Seco Geneaid</td><td>DFH100</td><td></td></tr><tr><td>Genius</td> Major <td>Science</td><td>MD-01N</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro Graduado Personalizado A 100mL</td><td>SIBATA</td><td>SABP-1195906</td><td>Meça o volume de reagentes.</td></tr><tr><td>Contador de contagem manual</td><td>SDI</td><td>NO.1055</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>bioman</td><td>AP-0650010</td><td>Calcule o número de esporos</td></tr><tr><td>Alça de inoculação</td><td>Dogger</td><td>D8GA-23000</td><td></td></tr><tr><td>tampa</td><td>IDEAHOUSE</td><td>RS92004</td><td></td></tr><tr><td>Micro vidro de cobertura</td><td>MUTO PURE CHEMICALS CO., LTD</td><td>24241</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imagem microscópica</td><td>SAGE VISION CO.,LTD</td><td>SGHD-3.6C</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio</td><td>DOGGER</td><td>DG75001-07105</td><td></td></tr><tr><td>Mupid-2plus DNA Gel Eletroforese</td><td>ADVANCE</td><td>AD110</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio óptico Nikon</td><td>SAGE VISION CO., LTD</td><td>Eclipse CI-L</td><td></td></tr><tr><td>Copo de plástico</td><td>IDEAHOUSE</td><td>CS60016</td><td></td></tr><tr><td>Presto Mini gDNA Yeast Kit</td><td>Geneaid</td><td>GYBY300</td><td>Kit de extração de DNA genômico fúngico</td></tr><tr><td>Caldo de dextrose Sabouraud (meio líquido Sabouraud)</td><td>HiMedia Leading BioSciences Company</td><td>M033</td><td>Usado para o cultivo de leveduras, bolores e microrganismos acidúricos.</td></tr><tr><td>Lâmina de bisturi No.23</td><td>Swann-Morton</td><td>310</td><td></td></tr><tr><td>Cabo de bisturi No.4</td><td>AGARWAL SURGICALS</td><td>SSS -FOR-01-91</td><td></td></tr><tr><td>Pá</td><td>Save & Safe</td><td>A&nbsp;-1580242&nbsp;-00</td><td></td></tr><tr><td>Silwet L-77</td><td>bioman(phytotech)</td><td>S7777</td><td>Surfactante</td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 17 Microcentrífuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002403</td><td></td></tr><tr><td>Pinças de Aço</td><td>SIPEL ELECTRONIC SA</td><td>GG-SA</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri Estéril</td><td>BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd.</td><td>1621</td><td>Recipientes cilíndricos rasos com tampas ajustadas, especificamente para uso em microbiologia ou cultura de células.</td></tr><tr><td>ThermoCell MixingBlock</td><td>BIOER</td><td>MB-101</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>164-21775</td><td></td></tr><tr><td>TwinGuard ULT Freezer</td><td>Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd.</td><td>MDF-DU302VX-80</td><td>&deg; C armazenada.</td></tr><tr><td>Armário vertical tipo piso</td><td>Chih Chin</td><td>BSC-3</td><td>Cultura operacional fúngica.</td></tr><tr><td>Vortex Genie II</td><td>Scientific</td><td>SIG560</td><td></td></tr><tr><td>Sacos de armazenamento com zíper</td><td>Salvar e Safe</td><td>A&nbsp;-1248915&nbsp;-00</td><td></td></tr><tr><td>100 bp DNA Ladder</td><td>Geneaid</td><td>DL007-20</td><td></td></tr><tr><td>&deg; C Freezer</td><td>FRIGIDAIRE</td><td>Frigidaire</td> <td>FFFU21M1QW-20&deg; C e reagentes experimentais armazenados.</td></tr><tr><td>2X SuperRed PCR Master Mix</td><td>FERRAMENTAS</td><td>TE-SR01</td><td></td></tr><tr><td>50X TAE Buffer</td><td>BIOMAN</td><td>TAE501000</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e seleção de fungos entomopatômicos de amostras de solo e avaliação da virulência fúngica contra pragas de insetos

Isolation and Selection of Entomopathogenic Fungi from Soil Samples and Evaluation of Fungal Virulence against Insect Pests

Os fungos entomopatômicos (EPF) são um dos agentes de controle microbiano para o manejo integrado de pragas. Para controlar pragas locais ou invasivas, é importante isolar e selecionar ePF indígena. Por isso, o método de isca de solo combinado com o sistema isca de inseto (minhoca, Tenebrio molitor) foi utilizado neste estudo com algumas modificações. Os EPF isolados foram então submetidos ao teste de virulência contra a praga agrícola Spodoptera litura. Além disso, as cepas potenciais de EPF foram submetidas a identificações morfológicas e moleculares. Além disso, foram realizados ensaios de produção conidia e termotolerância para as promissoras cepas de EPF e comparadas; esses dados foram substituídos ainda na fórmula do número efetivo de conidia (ECN) para classificação laboratorial. O sistema de isca-míope do solo e a fórmula ECN podem ser melhorados substituindo espécies de insetos e integrando mais fatores de estresse para a avaliação da comercialização e aplicação do campo. Este protocolo fornece uma abordagem rápida e eficiente para a seleção da EPF e melhorará a pesquisa sobre agentes de controle biológico.

Isolamento e seleção de potenciais fungos entomopatômicos (EPF) Utilizando o método de construção da biblioteca de fungos entomopatômicos mediados pelo Tenebrio molitor (EPF), o número de fungos sem atividade de matança de insetos seria excluído; assim, a eficiência de isolamento e seleção de EPF poderia ser em grande parte aumentada. Durante a aplicação deste método, foram registradas as informações dos locais de amostragem, amostras de solo e as taxas de ge...

Aqui apresentamos um protocolo baseado no sistema de isca mealworm (Tenebrio molitor)-isca que foi utilizado para isolar e selecionar fungos entomopatômicos (EPF) a partir de amostras de solo. Uma fórmula eficaz de número de conidia (ECN) é usada para selecionar EPF tolerante ao alto estresse com base em características fisiológicas para controle microbiano de pragas no campo.

Isolamento e Seleção de Fungos Entomopatômicos de Amostras de Solo e Avaliação da Virulência Fúngica contra Pragas de Insetos

Entomopathogenic fungi (EPF) are one of the microbial control agents for integrated pest management. To control local or invasive pests, it is important ...

O método de isolamento de fungos entomopatômicos é importante para o desenvolvimento de agentes de controle microbiano. Este protocolo pode ser usado para isolar e selecionar isolados fúngicos entomopatômicos de alta virulência das amostras do solo. Esta técnica inclui três pinos de triagem de patogenicidade e combina o ensaio de produção de termotolerância e conidia para fazer o ranking efetivo de números conidia.O método pode ajudar a selecionar alta virulência e prometendo novos isolados fúngicos entomopatômicos para comercialização. Este protocolo se concentra no controle biológico, também poderia ser usado para descobrir os isolados fúngicos entomopatômicos para estudar a interação entre pragas e fungos entomopatômicos. Demonstrando o procedimento serão Yao-Chia Liu e Nian-Tong Ni, estudante de mestrado do meu laboratório.Comece com a coleta da amostra do solo removendo um centímetro do solo superficial e, em seguida, coletando o solo dentro da profundidade de cinco a 10 centímetros de cada local de amostragem usando uma pá. Após o registro dos detalhes de cada local de amostragem, colete e mantenha 100 gramas de amostra de solo em um saco plástico à temperatura ambiente para

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nematóides entomopatogênicos são vermes que vivem no solo que parasitam uma grande variedade de insetos. Demonstramos métodos de amostragem utilizados para o isolamento destes nematóides do solo utilizando duas técnicas: a iscagem inseto ea armadilha Branco modificado, para a recuperação de nematóides de amostras de solo e cadáveres de insetos infectados, respectivamente.

Amostragem do solo e isolamento de nematóides entomopatogênicos (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Aqui, relatamos os diferentes estágios envolvidos no desenvolvimento baseado no conhecimento de um efetivo microssecticida, incluindo o isolamento, identificação, triagem e seleção do fungo entomopatogênico "melhor ajustado", Metarhizium anisopliae , para controle de pragas de insetos na agricultura .

Desenvolvimento de<em&gt; Metarhizium anisopliae</em&gt; Como um Mycoinsecticide: do isolamento ao desempenho do campo

Colônias fúngicas entomopatômicas são isoladas de amostras de solo tropical usando isca tenebrio , isca de Galleria , bem como meio artificial seletivo, ou seja, ágar de dextrose de batata enriquecido com extrato de levedura suplementado com clorofenicol, tiaabzolendae e ciclohexmida (meio CTC).

Comparação de métodos para isolar fungos entomopatômicos de amostras de solo

Aqui apresentamos um protocolo para obtenção de fungos entomopatogênicos de uma broca florestal e uma forma substitutiva de avaliar suas atividades entomopatogênicas usando um inseto modelo coleóptero. Este método é eficiente e conveniente para explorar recursos fúngicos entomopatogênicos de pragas de insetos perfuradores de madeira em florestas naturais.

Isolamento, Identificação Comportamental e Avaliação de Patogenicidade de Fungos Entomopatogênicos de uma Broca da Madeira Florestal

Este vídeo mostra um procedimento para isolar protoplastos intactos a partir de tecidos de 14 dias de idade, mudas de Arabidopsis. Dado que o protoplastos isolados permanecem intactos por pelo menos 96h e são isoladas de mudas, em vez de um mês de idade plantas maduras, esse procedimento agiliza ensaios exigindo protoplastos intactos.

Isolamento de Protoplastos de tecidos de 14 dias de idade, mudas de Arabidopsis thaliana</em

Problemas no processamento de amostras biológicas para observação de microscopia eletrônica de varredura incluem colapso celular, tratamento de amostras de microambientes úmidos e destruição celular. Protocolos de baixo custo e relativamente rápidos, adequados para a preparação de amostras desafiadoras, como meristemas florais, cistos de oomicetos e fungos (Agaricales), são compilados e detalhados aqui.

Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) Protocolos para a Problemática da planta, oomiceto e amostras fúngicas

Este relatório descreve um protocolo de preparação de amostras e condições específicas de imagem para a realização de tomografia eletrônica de transmissão de varredura de espécimes biológicos espessos.

Preparação e observação de amostras biológicas Grosso por Scanning Transmission Electron Tomografia

Este protocolo para marcação imunofluorescente de proteínas de vírus de plantas e proteínas de insetos vetores em intestinos de insetos excisados pode ser usado para estudar interações entre vírus e insetos vetores, funções de proteínas de insetos e mecanismos moleculares subjacentes à transmissão de vírus.

Marcação por imunofluorescência de vírus de plantas e proteínas de insetos vetores em intestinos de Hemiptera

Fungos entomopatômicos ganharam importância como agentes de controle biológico de pragas de insetos agrícolas. Neste estudo, a produção em massa de um número suficiente de propagules infecciosos resilientes de isolados sul-africanos tanto de Metarhizium robertsii quanto de M. pinghaense para aplicação comercial contra pragas de insetos foi realizada com sucesso utilizando produtos agrícolas de grãos.

Produção em massa de Fungos Entomopatômicos, Metarhizium robertsii e Metarhizium pinghaense, para Aplicação Comercial Contra Pragas de Insetos

Este protocolo é um método eficaz e rápido de cultivo de leveduras e o molde Aspergillus fumigatus de grandes conjuntos de amostras de solo em apenas 7 dias. Os métodos podem ser facilmente modificados para acomodar uma gama de mídias de incubação e temperaturas conforme necessário para experimentos.

Isolamento de Leveduras culturais e moldes de solos para investigar estrutura populacional fúngica

Aprenda a isolar fungos entomopatogênicos de amostras de solo usando Tenebrio molitor como isca. Este método combina triagem de patogenicidade, termotolerância e produção de conídios para selecionar isolados de alta virulência.

Isolamento e Seleção de Fungos Entomopatômicos de Amostras de Solo e Avaliação da Virulência Fúngica contra Pragas de Insetos

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