Fluorescência-Ativada Célula Desarmamento-Radiolige Tecido Tratado (FACS-RTT) para determinar a origem celular do sinal radioativo

Este protocolo é complementar à imagem in vivo. Permite quantificação de nível celular e celular de radiotracers, que é uma escala diferente da obtida in vivo. A principal vantagem dessa técnica é sua sensibilidade e a resolução celular dada pelo uso de radioligands e a triagem celular.

Ligue a câmera e carregue o software operacional. Clique no botão de palco Home XYZ para executar o homing. Configure o experimento composto por uma aquisição de varredura de 10 minutos.

Defina o modo Passo para multar e o modo de aquisição para o Listmode para registrar todo o espectro de emissões. Configure a cama e certifique-se de que o sistema de aquecimento, o sensor de respiração e a anestesia estejam funcionais e seguros. Então, coloque um fantasma onde a cabeça do animal será posicionada.

Defina a área de varredura deslizando os cursores para as três dimensões com a ajuda das três imagens na parte inferior da tela. Certifique-se de que o volume de varredura do fantasma e do animal é o mesmo. Inicie a varredura fantasma para calibração subsequente com os parâmetros previamente estabelecidos.

Certifique-se de trabalhar em um ambiente adequado, autorizado para experimentos envolvendo radioatividade. Incubar 100 microgramas de tributylin precursor em 100 microliters de ácido acético com iodeto de sódio e cinco microliters de ácido paracético de 37% a 70 graus Celsius por 20 minutos em um termociclador posicionado em um porta-luvas. Diluir a reação usando 50% de acetonitrila na água para atingir um volume de 500 microliters.

Injete os 500 microliters da reação diluída em uma coluna de fase inversa. Isole o CLINDE com um HPLC linear de 5 a 95% de ACN em ácido fosfórico de sete milimolares por 10 minutos. Diluir o isolado na água para atingir um volume final de 10 mililitros e, em seguida, injetar a reação diluída em uma coluna de concentração.

Elute o CLINDE da coluna com 300 microlitadores de etanol absoluto e, em seguida, evaporar o etanol incubando-o em uma centrífuga de vácuo à temperatura ambiente por 40 minutos. Diluir o resíduo contendo o CLINDE em 300 microlitres de soro fisiológico para criar uma solução de estoque. Após medir sua radioatividade, diluir a solução de estoque em soro fisiológico para obter uma solução de 0,037 megabecquerel em 500 microlitres.

Estabeleça as curvas de calibração com compostos de referência fria e resolva a equação de regressão linear:Y igual a AX mais B para obter coeficientes A e B. X representa a massa de composto frio, e Y representa a área sob as curvas. Verifique a área sob a curva do radioligand, medindo a absorção ultravioleta a 450 nanômetros com base na curva de calibração e na área sob a curva do radioligand.

Estimar a massa e medir a atividade do radioligand. Certifique-se de que a atividade específica é maior que 1.000 gigabecquerel por micromole. Clique no botão Atualizar imagem para atualizar a posição animal.

Defina a área de varredura deslizando os cursores com a ajuda das três imagens na parte inferior da tela para as três dimensões. Configure o experimento em uma varredura de 60 minutos constituindo 60 quadros de um minuto. Reutilize todos os outros parâmetros configurados inicialmente.

Injete 500 microliters do radiotracer radioativo e depois lave o tubo com 300 microliters de cloreto de sódio estéril de 0,9%. Simultaneamente, clique em Iniciar a aquisição para iniciar a varredura. Abra o software de reconstrução de varredura e, em seguida, abra o conjunto de dados, procurando o arquivo de parâmetros de nome do arquivo criado na pasta da varredura.

Selecione o isótopo de interesse. Observe que o parâmetro do modo de lista permite a seleção de vários isótopos nesta etapa. Defina os diferentes parâmetros de reconstrução, como o tamanho do voxel, número de subconjuntos e iterações como descrito no manuscrito.

Selecione o formato de saída como NIFTI e selecione Iniciar a reconstrução do SPECT. Use uma espátula de metal plano e uma lâmina de barbear para dissecar as regiões de interesse do cérebro. Coloque os tecidos em um tubo de centrífuga de dois mililitros e pese o tecido obtido.

Coloque as amostras em um tubo de centrífuga de dois mililitros com um mililitro de HBSS sem cálcio e magnésio e, em seguida, centrífuga a 300 vezes G por dois minutos à temperatura ambiente e remova o sobrenatário sem perturbar a pelota. Adicione 1.900 microliters de enzima misture um e incuba-o por 15 minutos a 37 graus Celsius enquanto agita os tubos por inversão a cada cinco minutos. Adicione 30 microliters de enzima mistura dois.

Agitar suavemente com uma pipeta de 1.000 microliter para frente e para trás 30 vezes. Em seguida, incubar a mistura por 15 minutos a 37 graus Celsius enquanto agita os tubos por inversão a cada cinco minutos. Misture suavemente para frente e para trás com uma pipeta de 200 microliter e, em seguida, uma pipeta de 10 microliter antes de incubar a mistura por 10 minutos a 37 graus Celsius para dissociar os tecidos.

Filtre as células com um coador de células de 70 micrômetros e adicione 10 mililitros de HBSS sem cálcio e magnésio. Centrifugar a 300 vezes G por 10 minutos em temperatura ambiente e remover o supernatante sem perturbar a pelota. Para o esgotamento da mielina, resuspenque a pelota com 400 microliters de tampão de remoção de mielina e adicione 100 microliters de contas de remoção de mielina antes de incubar por 15 minutos a quatro graus Celsius.

Adicione cinco mililitros de tampão de remoção de mielina e centrífuga 300 vezes G por 10 minutos em temperatura ambiente. Adicione 500 microliters de tampão de remoção de mielina e coloque as pelotas suspensas na coluna do campo magnético. Lave a coluna com um mililitro de tampão de remoção de mielina quatro vezes.

Centrifugar a 300 vezes G por dois minutos à temperatura ambiente e remover o sobrenatante sem perturbar a pelota. Vórtice brevemente para dissociar as células e adicionar cinco microliters de Fc Block CD32. Adicione 100 microliters da mistura de anticorpos primários de interesse e incubar por 20 minutos a quatro graus Celsius.

Centrifugar a 350 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius e remover o supernatante sem perturbar a pelota. Borrida os tubos de cabeça para baixo em papel macio. Vortex o tubo brevemente, em seguida, adicione 100 microliters da mistura de anticorpos secundários e incubar por 15 minutos a quatro graus Celsius.

Adicione um mililitro de tampão de remoção de mielina e repita a centrifugação. Descarte o supernatante e borre os tubos de cabeça para baixo em papel macio. Resuspenque as células em 250 microliters de PBS estéreis e proceda diretamente à triagem celular.

O escaneamento in vivo SPECT de ratos do tipo selvagem mostrou maior ligação de CLINDE no local da injeção de lipopólise do que na região contra-lateral do cérebro. As amostras ex vivo que foram submetidas à fluorescência ativaram tecido radioligand tratado de células, ou FACS-RTT, revelaram a presença de um maior número de sítios de ligação CLINDE apenas em microglia, mostrando que a origem celular do sinal CLINDE no lado ipsilateral do cérebro era microglia. O aumento da proteína translocadora, ou ligação TSPO, aos 12 meses em ratos TgF344-AD foi restrito aos astrócitos.

Em ratos de 24 meses de idade, o aumento da ligação TSPO foi observado devido a alterações astróciticas e microgliais. Em ratos TgF344-AD mais antigos, os astrócitos estriais apresentaram uma densidade 5HT2AR reduzida quando comparados com o tipo selvagem. Uma superexpressão cortical de TSPO foi observada tanto em astrócitos quanto em microglia de sujeitos da AD em comparação com controles com correspondência etária quando o FACS-RTT foi realizado em amostras pós-morte humanas.

Ao trabalhar com radioatividade, siga a instrução de proteção por rádio e use equipamentos de proteção pessoal adequados. Em seguida, após o procedimento, certifique-se de descontaminar o ambiente de trabalho. A quantificação proteica e a análise da expressão genética podem ser facilmente feitas após este procedimento em populações celulares isoladas.