Name: Síntese e Caracterização de nanopartículas poli-carregadas de mRNA (Beta Aminoesters) para fins de vacinação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Aprenda a sintetizar nanopartículas poliméricas de mRNA usando polímeros de beta aminoésteres para aplicações em vacinas. Este método simplificado permite encapsular ácidos nucleicos em uma única etapa com versatilidade.

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Os autores não têm nada a revelar nem conflitos de interesse.

Após o surto da pandemia Covid-19 no ano passado, a importância das vacinas em termos de controle de doenças infecciosas tem se manifestado como um componente crítico8. Os esforços de cientistas em todo o mundo permitiram a liberação para o mercado de muitas vacinas. Pela primeira vez na história, as vacinas mRNA demonstraram seu sucesso anteriormente hipótese, graças ao seu rápido design devido à sua capacidade de se adaptar a qualquer novo antígeno dentro de algunsmeses 5,</sup...

As doenças infecciosas têm representado uma grave ameaça a milhões de seres humanos em todo o mundo e ainda são uma das principais causas de morte em alguns países em desenvolvimento. A vacinação profilática tem sido uma das intervenções mais eficazes da sociedade moderna para prevenir e controlar doenças infecciosas1,2. Esses marcos críticos da ciênciana relevância do século 20 foram observados pela recente pandemia covid-19 mundial causada pelo vírus SARS-CoV-23. Reconhecendo a importância de ter vacinas eficientes para reduzir a disseminação da doença, os esforços cooperativos de todas as comunidades biomédicas resultaram com sucesso em muitas vacinas profiláticas no mercado em menos de um ano4.
Tradicionalmente, as vacinas eram compostas de vírus atenuados (virulência viva, reduzida) ou inativados (partículas de morte). No entanto, para algumas doenças sem margem para erros de segurança, partículas virais não são possíveis, e subunidades proteicas são usadas em vez disso. No entanto, as subunidades geralmente não permitem a combinação de mais de um epítope/antígeno, e os adjuvantes são necessários para aumentar a potência vacinal5,6. Portanto, a necessidade de novos tipos de vacinas é clara.
Como demonstrado durante a pandemia atual, novos candidatos à vacina com base em ácidos nucleicos podem ser vantajosos em termos de evitar processos longos de desenvolvimento e fornecer alta versatilidade ao produzir, ao mesmo tempo, uma imunização vital do paciente. É o caso das vacinas mRNA, que foram inicialmente projetadas como vacinas experimentais contra o câncer. Graças à sua capacidade natural de produzir respostas de células T específicas de antígeno3,5,6,7. Sendo mRNA a molécula que codifica a proteína antigênica, apenas mudando a mesma, a vacina pode ser rapidamente adaptada para imunizar outras variantes do mesmo microrganismo, cepas diferentes, outros microrganismos infecciosos, ou até mesmo se tornar um tratamento imunoterapêutico de câncer. Além disso, são vantajosos em termos de custos de produção em larga escala. No entanto, o mRNA tem um obstáculo significativo que dificulta sua administração nua: sua estabilidade e integridade estão comprometidas na mídia fisiológica, cheia de núcleos. Por essa razão, é necessário o uso de um portador nanométrico que o proteja e vetorize o mRNA para as células que apresentem antígeno2,8.
Neste contexto, os poli(aminoesters beta) (pBAE) são uma classe de polímeros biocompatíveis e biodegradáveis que demonstraram uma notável capacidade de complexo mRNA em partículas nanométricas, graças às suas cargas cationicas9,10,11. Estes polímeros são compostos de laços éster, o que facilita sua degradação por esterases em condições fisiológicas. Entre os candidatos à biblioteca do PBAE, aqueles funcionalizados com oligopeptídeos cáticos finais apresentaram maior capacidade de formar pequenas nanopartículas para penetrar eficientemente as células através da endocitose e transfectar o material genético encapsulado. Além disso, graças à sua capacidade de tampão, a acidificação do compartimento endosomo permite a fuga endossomal12,13. Ou seja, um tipo específico de pBAE, incluindo moieties hidrofóbicos em sua espinha dorsal (o chamado C6 pBAE) para aumentar sua estabilidade e combinação de oligopeptídeo final (60% de polímero modificado com uma tri-lysina e 40% do polímero com uma tri-histidina) que transfecta seletivamente células que apresentam antígenos após administração parenteral e produzem a apresentação de antígeno de encode mRNA seguido de imunização de camundongos foi publicado recentemente14 . Além disso, também foi demonstrado que essas formulações poderiam contornar uma das principais etapas de gargalo das formulações de nanomedicina: a possibilidade de congelá-las sem perder sua funcionalidade, o que permite a estabilidade a longo prazo em ambientes secos suaves15.
Nesse contexto, o objetivo do protocolo atual é disponibilizar o procedimento para a formação das nanopartículas de mRNA à comunidade científica, dando uma descrição das etapas críticas do protocolo e possibilitando a produção de vacinas eficientes para aplicações de prevenção de doenças infecciosas e tratamento de tumores.
O protocolo a seguir descreve o exercício completo para sintetizar poli (aminoestores beta) modificados por oligopeptídeos - polímeros OM-pBAE que serão usados ainda para síntese de nanopartículas. No protocolo, a formulação de nanopartículas também está incluída. Além disso, etapas críticas para o sucesso do procedimento e resultados representativos também são fornecidas para garantir que as formulações resultantes realizem os recursos de caracterização de controle de qualidade necessários para definir um resultado positivo ou negativo. Este protocolo é resumido na Figura 1.

<table><tbody><tr><td>Diacrilato de 1,4-butanodiol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>123048</td><td></td></tr><tr><td>1-hexilamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>219703</td><td></td></tr><tr><td>5-amino-1-pentanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>411744</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Panreac</td><td>141007</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo CD11b</td><td>BD</td><td>550993</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo CD86</td><td>Bioligend</td><td>105007</td><td></td></tr><tr><td>Hidroxído de cloro</td><td>Panreac</td><td>181023</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio-d</td><td>Sigma Aldrich</td><td>151823</td><td></td></tr><tr><td>Cys-His-His-His peptídeo</td><td>Ontores</td><td>Peptídeo</td> Cys-Lys-Lys personalizado <td></td></tr><tr><td></td><td>Ontores</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>reagente DEPC para água livre de Rnase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5758</td><td>Este reagente é importante para tratar a água MilliQ para remover quaisquer RNases dos tampões</td></tr><tr><td>Dietyl eter</td><td>Panreac</td><td>212770</td><td></td></tr><tr><td>dimetilsulfóxido</td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>mRNA EGFP</td><td>TriLink Technologies</td><td>L-7601</td><td></td></tr><tr><td>mRNA OVA</td><td>TriLink Tecnologias</td><td>L-7610</td><td></td></tr><tr><td>RiboGreen kit</td><td>ThermoFisher</td><td>R11490</td><td></td></tr><tr><td>acetato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71196</td><td></td></tr><tr><td>sacarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético</td><td>Sigma Aldrich</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>11570626</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;- camundongo AlexaFluor488 anticorpo</td><td>Abcam</td><td>Ab450105</td><td></td></tr><tr><td>EquipmentAnalisador de rastreamento de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>nanopartículas</td><td>Malvern Panalytical</td><td>NanoSight NS300</td><td></td></tr><tr><td>Espectrômetro de Ressonância Magnética Nuclear</td><td>Varian</td><td>400 MHz</td><td></td></tr><tr><td>ZetaSizer</td><td>Malvern Panalytical</td><td>Nano ZS</td><td>Para potencial zeta e determinação de tamanho hidrodinâmico</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight Software NTA</td><td>Malvern Panalytical</td><td>MAN0515-02-PT-00</td><td></td></tr><tr><td>NovoExpress Software</td><td>Agilent</td><td>Não especificado</td><td></td></tr><tr><td>Software ZetaSizer</td><td>Malvern Panalytical</td><td>DTS Aplicação</td><td>Para analisar a carga superficial e os tamanhos hidrodinâmicos</td></tr></tbody></table>

síntese e caracterização de nanopartículas poli-carregadas de mrna (beta aminoesters) para fins de vacinação

Synthesis and Characterization of mRNA-Loaded Poly(Beta Aminoesters) Nanoparticles for Vaccination Purposes

A vacinação tem sido um dos maiores sucessos da sociedade moderna e é indispensável no controle e prevenção de doenças. As vacinas tradicionais eram compostas de inteira ou frações do agente infeccioso. No entanto, os desafios permanecem, e novas tecnologias de vacinação são obrigatórias. Nesse contexto, o uso do mRNA para fins de imunização mostrou um desempenho aprimorado, como demonstrado pela aprovação rápida de duas vacinas de mRNA que previnem a infecção pelo SARS-CoV-2. Além do sucesso na prevenção de infecções virais, as vacinas mRNA também podem ser usadas para aplicações terapêuticas de câncer.
No entanto, a instabilidade do mRNA e sua rápida liberação do corpo devido à presença de núcleos torna sua entrega nua não possível. Neste contexto, as nanomedicinas, e especificamente as nanopartículas poliméricas, são sistemas críticos de entrega de mRNA. Assim, o objetivo deste artigo é descrever o protocolo de formulação e teste de um candidato à vacina mRNA com base nas nanopartículas poliméricas proprietárias. A síntese e caracterização química dos polímeros poli(beta aminoesters) utilizados, sua complexidade com mRNA para formar nanopartículas, e sua metodologia de liofilização serão discutidas aqui. Este é um passo crucial para diminuir os custos de armazenamento e distribuição. Finalmente, serão indicados os testes necessários para demonstrar sua capacidade de transfetál de in vitro e células dendríticas de modelo maduros. Este protocolo beneficiará a comunidade científica que trabalha na vacinação devido à sua alta versatilidade que permite que essas vacinas previnem ou curem uma grande variedade de doenças.

Síntese e caracterização do polímero O procedimento de síntese OM-pBAE é dado na Figura 2. Como mostra a Figura 2A, o primeiro passo para obter o OM-pBAE é sintetizar o C6-pBAE adicionando as aminas (1-hexilamina e 5-amino-1-pentanol, razão 1:1) ao diacrilato (1,4-diacrilate butanediol). Esta reação é realizada a 90 °C por 20 h e com agitação constante. Posteriormente, uma solução de oligopeptídeos é adicionada a uma solução de polímero C6 ob...

Aqui, um protocolo simples é apresentado para a produção de nanopartículas mRNA baseadas em polímeros poli (beta aminoester), fáceis de serem adaptados alterando o mRNA encapsulado. O fluxo de trabalho para sintetizar os polímeros, as nanopartículas e sua caracterização essencial in vitro também são descritos. Também é acrescentada uma prova de conceito em relação à imunização.

Síntese e Caracterização de nanopartículas poli-carregadas de mRNA (Beta Aminoesters) para fins de vacinação

Vaccination has been one of the major successes of modern society and is indispensable in controlling and preventing disease. Traditional vaccines were ...

Este protocolo é significativo porque demonstra como preparar nanopartículas poliméricas, ácidos nucleicos encapsulados em um passo simples. As principais vantagens dessa técnica, são a versatilidade, pois pode ser aplicada a diferentes ácidos nucleicos e tipos celulares. O uso de procedimentos simples para preparação de partículas, como tubulação para cima e para baixo, e a possibilidade de ampliar a estabilidade das nanopartículas e condições do tambor por liofilização.No processo estarão Laura Olmo, Coral Garcia-Fernandez, Maria Stampa Lopez-Pinto e Maria Navalon-Lopez, doutoranda do nosso laboratório e Marta Diaz-Caballero, pós-doutora do nosso laboratório. Para formação de poliplexes, descongele os polímeros previamente preparados, peptídeo C6, ésteres de poli beta amino e vórtice da solução. Depois de tubos a mistura de polímero para cima e para baixo, prepare uma solução de 12,5 milimiliar em acetato de sódio.Vortex a solução e esperar por 10 minutos. Em seguida, prepare mRNA a 0,5 miligramas por mililitro e misturado por pipetação. Vórtice a solução de polímero novamente, em seguida, misture a solução de material genético na solução de polímero em uma proporção de um para um em um tubo de micro centrífugas e incubar o tubo a 25 graus Celsius por 30 minutos em um Thermoblock.Após a incubação precipitar a mistura com uma a duas água livre de RNase adicionando a amostra a um tubo de micro centrífugas contendo a água, em seguida, para incluir os excipientes, adicione um monte de 20 mililitros e 4% solução de sacarose no mesmo volume que a mistura de ésteres mRNA e poli beta amino, e misturado por pipetação. Para lyofilização depois de congelar a solução de poliplex a menos 80 graus Celsius por uma hora, realize a secagem primária e, em seguida, armazene imediatamente os poliplexes a menos 20 graus Celsius para evitar a reidratação. Para a ressuspensão poliplex, remova as nanopartículas liofilizadas do congelador de menos 20 graus Celsius e adicione rapidamente a quantidade correspondente de água hidrogenada profunda para reestrugar o sólido e alcançar a concentração desejada.Pipeta suavemente até a ressuspensão total e uma vez dissolvida, pipeta para cima e para baixo vigorosamente evitando bolhas. Após 24 horas de transfecção para avaliação qualitativa por microscopia de fluorescência, coloque a placa de 96 poços contendo as células Hela transfecidas no microscópio e comece a visualizar usando o objetivo de 10 vezes. Primeiro, aplique um balanço de branco para criar uma referência de fundo para o software e, em seguida, adquira uma imagem para sobrepor-a com a imagem de fluorescência durante a análise.Altere o modo microscópio para modo de reflexão e mova a roda do filtro para o laser azul para visualizar o EGFP. Em seguida, adquira imagens para todas as condições ou poços que empregam o mesmo tempo de exposição. Para avaliação quantitativa por citometria de fluxo, lave as células Hela transfeccionadas em uma placa de poço 96 usando 100 microliters de PBS por poço.Depois de aspirar o PBS a 25 microliters de trippsina por poço e incubar a 37 graus Celsius por cinco minutos. Uma vez que as células sejam separadas, adicione a mídia previamente recuperada para inativar a trippsina e, em seguida, fixe as células adicionando 31,25 microliters de 10% formalina por poço e incubando por 20 minutos. Em seguida, ligue o citômetro de fluxo e o software, em seguida, configure as condições adequadas para o experimento, incluindo o tipo de volume de amostra de placa e outros parâmetros, como agitação e lavagem entre amostras.Configure os parâmetros apropriados para quantificar a porcentagem de células transfectadas positivamente, visualizando primeiro os dados de fluxo na luz dispersa dianteira versus luz dispersa lateral para distinguir as células dos detritos. E então plotando outra dispersão, comparando a amplitude versus altura ao portão e discriminar células individuais. Um dia antes da transfecção, placa 10.000 JAWS II células por poço em uma placa de 96 poços para incubação durante a noite.No dia seguinte, transfem as células com 0,6 microgramas de mRNA por poço e incubam a placa por 24 horas em uma incubadora de ar seco a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, lave as células que permanecem no poço com 25 microliters de PBS. Depois de aspirar o PBS em 25 microlitrais de trippsina e incubar a placa por cinco minutos a 37 graus Celsius para desprender as células.Pare a reação de trypsin adicionando a mídia recuperada anteriormente no correspondente bem. Em seguida, centrifuse a placa, aspire a mídia e fixe as células adicionando 50 microliters de PBS e 2,5% formalina por poço seguido pela incubação da placa a quatro graus Celsius por 20 minutos, centrifugar a placa. Em seguida, adicione 50 microliters de PBS e 3%BSA por poço e incubadora por 30 minutos a quatro graus Celsius.Após a incubação centrifugar a placa novamente, em seguida, adicione 50 microliters do anticorpo ovalbumin do rato em PBS e 3%BSA e incubadora por 30 minutos a quatro graus Celsius. Repita o passo de centrifugação e lave as células com 50 microliters de PBS. Depois de aspirar o PBS, adicione os anticorpos secundários e incubar por uma hora a quatro graus Celsius.Após a incubação, repita as etapas de centrifugação e lavagem. Em seguida, resuspengue as células e 100 microlitres de PBS e 2,5% de formalina para análise de citometria de fluxo. Caracterização fisioquímica de nanopartículas encapsuladoras de GRNA de GFP frescas e liofilizadas não mostram diferenças significativas no tamanho e no índice de poli dispersão.A microscopia eletrônica de transmissão dos poliplexes confirma a formação de nanopartículas esféricas e mono dispersas de aproximadamente 50 nanômetros de diâmetro. Os dados de eficiência de encapsulamento de um peptídeo Lego e poliplexes poli amino éster modificados encapsulando GFP, ou ovalbumin não mostram diferenças significativas dependendo do tipo de mRNA. Uma análise qualitativa da expressão EGFP, 24 horas após a transação na linha celular JAWS II é mostrada aqui.Quantitativamente comparado ao controle negativo. A porcentagem de células positivas de GFP é significativamente maior e comparável a um controle positivo realizado com um reagente de transfecção clássica. O oligopeptida carregada ovalbumin mRNA e as nanopartículas poli-beta amino ér modificadas podem ativar células dendríticas, como visto pela expressão significativamente maior dos marcadores de membrana CD11b e CD86 em células transfeinadas em comparação com células não transfetadas.Nossa plataforma de vacinação baseada no uso do mRNA como princípio ativo, bem como nossos polímeros proprietários podem ser adaptados para serem usados em profilaxia, bem como em terapêuticas contra o câncer. Podemos usar nossa tecnologia para destacar essa contribuição na imunoterapêutica do câncer. uma vez que podemos encapsular antígenos associados ao tumor em nossas nanopartículas e fazer uma mudança nos tratamentos de câncer.

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Bioengenharia

Este vídeo demonstra um método para gerar uma vacina candidata de mRNA usando nanopartículas poliméricas. O polímero catiônico interage com o mRNA carregado negativamente, formando poliplexos. A formação de poliplexos estabiliza o mRNA, tornando-o um candidato potencial para futuras vacinas de mRNA em aplicações imunoterapêuticas.

Formulação de nanopartículas carregadas de mRNA para fins de vacinação

Um protocolo para a análise de nanopartículas de seguimento (NTA) e de alto rendimento de citometria de fluxo para avaliar as nanopartículas poliméricas entrega de genes é descrito. NTA é utilizada para caracterizar a distribuição do tamanho de partícula das nanopartículas e a distribuição de partículas por plasmídeo. De alto rendimento de citometria de fluxo permite a avaliação da eficácia de transfecção quantitativo para uma biblioteca de biomateriais de entrega de genes.

Avaliação de Entrega Gene Polimérico Nanopartículas por Análise Nanoparticle Rastreamento e alta capacidade de Citometria de Fluxo

Nanomateriais fornecem mecanismos versátil de entrega terapêutico controlado para tanto a ciência básica e aplicações de translação, mas sua fabricação muitas vezes requer perícia que não está disponível em laboratórios mais biomédicos. Aqui, apresentamos os protocolos para a fabricação escalável e carregamento terapêutico de diversas nanocarriers Self montado usando flash nanoprecipitation.

Montagem rápida, escalável e carregamento de proteínas bioativas e Imunoestimuladores em diversas Nanocarriers sintéticas através de Flash Nanoprecipitation

Aqui descrevemos um protocolo para a geração de nanoliposomes catiônico, o qual se baseia o método seco-filme e pode ser usado para o cofre e entrega eficiente do in vitro transcrito de RNA mensageiro.

Geração de Nanoliposomes catiônica para a entrega eficiente de In Vitro transcrito de RNA mensageiro

Um método detalhado é fornecido aqui descrevendo a purificação, o redobramento, e a caracterização de nanopartículas de proteína Self-montagem (SAPNs) para o uso no desenvolvimento da vacina.

Produção de E. coli-expressa auto-montagem de nanopartículas de proteína para vacinas que requerem Trimeric epitope apresentação

O presente protocolo descreve a bioengenharia de vesículas de membrana externa como uma plataforma de vacina "Plug-and-Display", incluindo produção, purificação, bioconjugação e caracterização.

Uma plataforma de vacina de nanopartículas "plug-and-display" baseada em vesículas de membrana externa exibindo o domínio de ligação ao receptor SARS-CoV-2

Uma nanopartícula de peptídeo-poloxamina auto-montada (PP-sNp) é desenvolvida usando um dispositivo de mistura microfluida para encapsular e fornecer RNA de mensageiro transcrito in vitro . O mRNA/PP-sNp descrito poderia transfetar eficientemente células cultivadas in vitro.

Transfecção eficiente de mRNA transcrito in vitro em células cultivadas usando nanopartículas de peptídeo-poloxamina

Aqui, apresentamos métodos detalhados para a preparação e avaliação da vacina tumoral em nanoemulsão auto-montada nasal in vitro e in vivo.

Preparação, características, toxicidade e avaliação da eficácia da vacina contra tumores em nanoemulsão automontada nasal in vitro e in vivo

Este método descreve a encapsulação do antígeno da raiva em micropartículas poliméricas biodegradáveis com propriedades estruturais e materiais que permitem a liberação pulsátil após um atraso pré-determinado. A avaliação ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) do antígeno recuperado do núcleo da partícula confirma a presença de glicoproteína intacta do vírus trimérico da raiva através da fabricação de partículas.

Fabricação de Micropartículas Poliméricas Pulsáteis Encapsulando o Antígeno Rábico

O presente protocolo prepara e avalia as propriedades físicas, a resposta imune e o efeito protetor in vivo de uma nova vacina adjuvante em nanoemulsão.

Avaliação da Resposta Imune de uma Vacina Adjuvante em Nanoemulsão Contra a Infecção por Staphylococcus aureus Resistente à Meticilina (MRSA)

Aprenda a sintetizar nanopartículas poliméricas de mRNA usando polímeros de beta aminoésteres para aplicações em vacinas. Este método simplificado permite encapsular ácidos nucleicos em uma única etapa com versatilidade.

Síntese e Caracterização de nanopartículas poli-carregadas de mRNA (Beta Aminoesters) para fins de vacinação

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