Medindo flux de substrato mitocondrial em células o-permeabilizadas de permeabilized recombinante

Porque testa o flux de substrato mitocôndria que pode ser afetado com diferentes patologias ou tratamentos. Por exemplo, hoje vamos usá-lo para revelar a resposta das células cancerígenas ao tratamento com Metformina. Requer um número mínimo de células, tendo réplicas suficientes e controle adequado para cada material distinto.

O analisador é apenas para uso de pesquisa. Esta técnica pode identificar erros no metabolismo mitocondrial e pode ser usada para avaliar drogas de guerreiros que afetam mitocôndrias. Demonstrando o procedimento será Karolina Vaneckova uma estudante de graduação e técnica de pesquisa do meu laboratório.

Para começar as células A549 de sementes a uma densidade de 20.000 células por poço em colunas, de duas a 11 de uma micro-placa de cultura celular XF 96. Deixando as colunas um e 12 vazias como poços de fundo. Encha os poços em branco com um volume igual do meio de cultura celular, em seguida, incubar as células a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono para fixação celular.

Depois de três a quatro horas, adicione 100 microliters de meio de cultura celular nos Poços. Trate as colunas de grupo experimentais de 7 a 11 com um Metformin mililitro e o grupo controle com um volume igual de água destilada estéril e, em seguida, devolva a placa à incubadora. Para hidratar os sensores, pipeta 200 microliters de água estéril por poço na placa de utilidade.

Em seguida, devolva cuidadosamente o cartucho do sensor enquanto imergi o sensor na água. Incubar o cartucho em uma incubadora livre de dióxido de carbono a 37 graus Celsius até o dia seguinte. Ligue o analisador e a unidade de controle.

Inicie o software de controle de instrumentos e aquisição de dados e projete o protocolo de ensaio conforme descrito no manuscrito do texto. Sob definições de grupo, crie quatro estratégias de injeção onde a porta A difere de acordo com o substrato injetado e nomeie as estratégias após os substratos ou abreviaturas. Designe oligomicina à porta B, FCCP à mistura de antimicina de porta C e Rotenone A para porta D.Criar e nomear oito grupos, sob o mapa da placa, atribuir grupos aos Poços correspondentes.

Em seguida, salve o protocolo como um modelo pronto para usar. Deixe o interruptor do analisador ligado para permitir que a temperatura se estabilize durante a noite. No dia seguinte, descarte a água da placa de utilidade e adicione 200 microliters do calibrante pré-aquecido por poço na placa de utilidade.

Devolva o cartucho à incubadora sem dióxido de carbono até o momento do ensaio. Mantenha uma fonte de umidade dentro da incubadora e desligue ou reduza a velocidade do ventilador ao mínimo, para evitar a rápida evaporação do calibrador. Prepare cinco mililitros da solução de trabalho dos substratos e inibidores com solução de ensaio mitocondrial pré-aquecida duas vezes, 5%BSA e água estéril como descrito no manuscrito do texto.

Em seguida, carregue as portas injetoras com substrato e inibidores, conforme descrito no manuscrito fiscal. Para calibrar sob a guia de ensaio de execução, clique na execução inicial para iniciar o ensaio. Insira o cartucho de censura carregado e aguarde que a calibração seja concluída.

Prepare 20 mililitros de meio de ensaio, misturando duas vezes a solução de ensaio mitocondrial, água estéril e 5%BSA em um tubo de 50 mililitros. Adicione dois microliters de 10 micromolars recombinante perfringolysin O, para atingir uma concentração de um nanomolar. E suspenda a mistura com tubulação suave, evitando tremores e vórtices.

Incubar o tubo a 37 graus Celsius até usar. Use uma pipeta multicanal para lavar as células e os Poços vazios em branco duas vezes, usando solução PBS pré-aquecida de cálcio e magnésio. Descarte o PBS e adicione 180 microliters do meio de ensaio pré-aquecido para permeabilização celular.

Imediatamente após a permeabilização substitua a placa de utilidade do cartucho do sensor calibrado pela placa celular contendo células permeabilizadas e inicie a medição. O grupo de tratamento apresentou maior taxa de respiração induzida por succinato. A resposta das células A549 ao tratamento de Metformina foi maior que a hep G2. Para a respiração induzida pelo piruvato malato, as células A549 apresentaram aumento da indução em comparação com as células hep G2 entre cinco a 15 minutos.

Resultados semelhantes foram obtidos para respiração induzida por glutamato e respiração induzida por malato palmitoylcarnitine. Para atingir a concentração certa de substrato e inibidores. O volume certo deve ser carregado na porta direita.

Quando uma mudança em uma via metabólica de um determinado substrato é identificada, será necessário avaliar a função das enzimas e transportadores envolvidos nessa via.