Ensaio de proteção de enzimas melhorada para estudar a internalização staphylococcus aureus e eficácia intracelular de compostos antimicrobianos
8 de setembro de 2021
Este protocolo tem como objetivo descrever como estudar a extensão da internalização do Staphylococcus aureus e sua capacidade de sobreviver dentro da célula hospedeira humana, bem como a eficácia intracelular de compostos antimicrobianos.
O ensaio de proteção de enzimas permite estudar a extensão da internalização do Estafilococo áureo e sua capacidade de sobreviver dentro de células aderentes, bem como a eficácia do composto antimicrobiano. O ensaio de proteção de enzimas melhorado simplifica muito o manuseio técnico e permite recuperar bactérias internalizadas de células e células fracamente aderentes em suspensão. Demonstrando o procedimento estará Josselin Rigaill, médica médica e doutoranda do meu laboratório.
Dois dias antes do ensaio de infecção, as células epiteliais A549 seed a uma densidade de 2,0 vezes 10 para as quintas células por mililitro por poço de uma placa de 24 poços e incubar as células por 48 horas a 36 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono, até atingirem 100% de confluência. No dia do ensaio, remova e descarte o meio de cultura gasto dos três poços dedicados à contagem das células A549, e adicione um mililitro de meio completo de infecção contendo cinco microgramas por mililitro de Hoechst 33342 e um micrograma por mililitro de iodeto de propidium. Incubar as células por 30 minutos, então, usando um microscópio de fluorescência de campo largo, contar o número de células e calcular a viabilidade celular.
Para preparar a suspensão bacteriana, dispense 25 mililitros de meio completo de infecção em um tubo, e pré-ataque a 36 graus Celsius. Em seguida, ajuste a suspensão staphylococcus aureus para um OD de 0,5 em um meio completo de infecção usando um medidor de densidade celular, em seguida, prepare 20 mililitros de suspensão bacteriana para inoculação celular diluindo a cultura em um meio completo de infecção para obter um MOI de um de acordo com o número de células por poço. Em seguida, usando um plater espiral automático, determine a carga staphylococcus aureus da suspensão bacteriana diluída a ser usada para a etapa de inoculação celular, e incubar as placas de ágar por 18 a 24 horas a 36 graus Celsius.
No dia seguinte, conte o número de colônias com um contador de colônias para calcular o MOI preciso para cada cepa testada. Antes da inoculação celular, observe cada poço da placa de 24 poços por microscopia de baixa ampliação para garantir que as células estejam saudáveis e crescendo como esperado, depois remova e descarte o meio de cultura celular gasta da placa de 24 poços e adicione 500 microliters da suspensão bacteriana a cada poço contendo células 100% confluentes. Incubar as células por duas horas a 36 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono.
Para quantificar as bactérias intracelulares com o ensaio de proteção enzimático melhorado, prepare o tampão de 4x lysis, 2%Triton X-100, trippsin-EDTA e estoque de lysostaphin em soluções de trabalho como mencionado no manuscrito do texto. Em seguida, prepare 6,25 mililitros de meio completo de infecção suplementado com linsstalfina adicionando seis mililitros de infecção completa de meio a 250 microliters da solução de trabalho de lysostaphin. Em seguida, adicione 250 microliters do meio completo de infecção suplementados com linfofina em cada poço e agitar suavemente a placa girando a placa à mão.
Para permitir que a linfotaphina mate as bactérias extracelulares, incubar as células por uma hora a 36 graus Celsius em dióxido de carbono de 5%, e inativar a linfotina adicionando 10 microlitradores de proteinase K a 20 microgramas por mililitro em cada poço e incubando as células por dois minutos à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 250 microliters de tampão de 4x lysis para lise as células por choque osmótico, e incubar as células por 10 minutos a 36 graus Celsius. Após a incubação, pipeta a célula lise para cima e para baixo várias vezes para garantir que as células estejam totalmente líricas e homogeneizadas, em seguida, use um plater espiral automático para determinar a carga staphylococcus aureus de cada poço e incubar as placas de ágar por 18 a 24 horas a 36 graus Celsius.
No dia seguinte, conte o número de colônias com um contador de colônias para calcular a carga intracelular staphylococcus aureus de cada poço. A internalização de duas cepas de Staphylococcus aureus por células epiteliais A549 é retratada aqui. Utilizando o ensaio de proteção enzimática que inclui lavagens para remover a lisostaphina, as cargas intracelulares médias foram de 4,46 e 0,49 log cfu por mililitro para o tipo selvagem SF8300 e o mutante isogênico sem os genes fnbA e B, respectivamente.
Utilizando o melhor ensaio de proteção enzimática que usa proteinase K para inativar a linsstalfina, as cargas foram de 4,53 e 0,56 log cfu por mililitro, respectivamente. A atividade intracelular de vancomicina, rifampicina e levofloxacina contra Staphylococcus aureus medido usando ensaio de proteção enzimeta é retratada aqui. As cargas intracelulares médias foram de 4,57 log cfu por mililitro para controle, 4,51 para vancomicina, 3,03 para rifampicina e 2,91 para levofloxacina.
Lavagens intensivas para remover a enzima tendem a desprender as células mais infectadas, o que pode dar resultados imprecisos e apoiar o uso do protocolo melhorado. O ensaio de proteção de enzimas melhorado facilita o estudo da internalização do Staph aureus com organoide, e pode ser facilmente adaptado em sistema de triagem de alto conteúdo que é usado pela colocação
Visão Geral
Este estudo tem como foco compreender a internalização de Staphylococcus aureus em células hospedeiras humanas e seus mecanismos de sobrevivência dentro dessas células. Além disso, avalia a eficácia de diversos compostos antimicrobianos contra esta bactéria utilizando um ensaio enzimático de proteção aprimorado.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Patogênese microbiana
- Resposta antimicrobiana
- Dinâmica de internalização celular
Contexto
- Staphylococcus aureus representa desafios clínicos significativos devido à sua capacidade de sobreviver dentro das células hospedeiras.
- Compreender sua internalização pode orientar estratégias de tratamento contra infecções.
- Métodos anteriores podem apresentar limitações na quantificação precisa da internalização bacteriana.
Métodos Utilizados
- Ensaio aprimorado de proteção enzimática para estudar a internalização bacteriana
- Células epiteliais A549 como modelo de células hospedeiras
- Técnicas de microscopia de fluorescência, tratamento com lisostafina e contagem de colônias
Resultados Principais
- Cargas intracelulares médias de Staphylococcus aureus foram quantificadas de forma significativa utilizando o ensaio aprimorado.
- Eficiência variada de compostos antimicrobianos, com vancomicina apresentando maior atividade intracelular.
- O protocolo modificado facilitou uma medição mais precisa da internalização bacteriana.
Conclusões
- O estudo apresenta um método eficaz para quantificar a sobrevivência de Staphylococcus aureus em células hospedeiras.
- Esta pesquisa oferece informações essenciais para o desenvolvimento de estratégias de tratamento contra infecções bacterianas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A quantificação precisa da carga bacteriana intracelular é fundamental para avaliar a eficácia antimicrobiana em células fagocíticas não profissionais, onde ensaios tradicionais podem subestimar a persistência do patógeno. O ensaio aprimorado de proteção enzimática supera limitações técnicas na recuperação de bactérias internalizadas de células fracamente aderentes ou em suspensão, aumentando a confiabilidade na triagem antimicrobiana em estágios iniciais. Isso contribui para a desmistificação mecanicista ao permitir a medição consistente da atividade de compostos contra Staphylococcus aureus intracelular, orientando decisões de otimização de fármacos líderes.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar a contribuição dos fatores de virulência na internalização e sobrevivência intracelular, apoiando a validação de alvos para estratégias anti-infecciosas.
- Valor Operacional: Fornece um método reprodutível para comparar cepas isogênicas, esclarecendo os determinantes genéticos da persistência do patógeno.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera leituras quantitativas de UFC intracelulares para avaliar a eficácia de compostos contra Staphylococcus aureus internalizado.
- Valor Operacional: Elimina etapas de lavagem que causam destacamento celular, melhorando a robustez do ensaio em modelos aderentes e em suspensão, incluindo organoides.
- Valor Científico: Facilita a adaptação para triagem de alto conteúdo ao simplificar as etapas de lise e recuperação, aumentando a produtividade no perfilamento de agentes antimicrobianos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Apoia a modelagem relevante para doenças utilizando células fagocíticas não profissionais aderentes e sistemas de organoides tridimensionais para imitar nichos intracelulares.
- Valor Operacional: Permite a continuidade da identificação de alvos até a avaliação pré-clínica, fornecendo uma métrica padronizada de carga bacteriana intracelular.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio insere-se no continuum de descoberta de agentes antimicrobianos, conectando a validação do alvo à triagem fenotípica e à avaliação de eficácia pré-clínica mediante a quantificação da carga de patógenos intracelulares como um ponto final farmacodinâmico essencial.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre interações hospedeiro-patógeno e mecanismos de virulência por meio de passos controlados de MOI e proteção com lisostafina.
- Triagem: Fornece medidas reprodutíveis e quantitativas de UFC intracelulares que permitem a comparação de compostos antimicrobianos em diferentes condições.
- Análises: Gera resultados em log UFC/mL que permitem às equipes classificar a atividade intracelular de compostos e avaliar efeitos de tempo de morte ou tratamento pós-infecção.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se a fluxos de trabalho pré-clínicos ao fornecer uma métrica de eficácia intracelular transponível, aplicável a células primárias e modelos de organoides.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma de infecção intracelular reutilizável, adaptável a múltiplos patógenos e tipos celulares além do Staphylococcus aureus.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista na ação antimicrobiana ao distinguir efeitos extracelulares de intracelulares.
- Valor Operacional: Padroniza a recuperação de bactérias intracelulares, minimizando a variabilidade devido à perda celular durante o processamento.
- Valor Estratégico: Melhora decisões de prosseguimento ou interrupção ao revelar compostos com atividade intracelular real, reduzindo o risco de falhas em estágios avançados.
- Impacto sobre o Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos com base em dados de eficácia intracelular, melhorando a eficiência do capital em programas anti-infecciosos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura celular, cálculo da multiplicidade de infecção e manipulação de patógenos anaeróbicos ou facultativos.
- Depende do acesso a lisostafina, proteinase K, tampões de lise e placa espiral para quantificação precisa de UFC.
- Necessita padronização da MOI, tempo de exposição à lisostafina e protocolos de inativação entre laboratórios.
- A adaptação a células primárias ou modelos tridimensionais pode exigir otimização da penetração da lisostafina e das condições de lise.
- Limitação prática: a duração do ensaio excede 24 horas, o que pode restringir campanhas de triagem em ultra-alto rendimento.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:41
Determination of Cell Density and Viability
1:33
Preparation of the Bacterial Suspension
2:32
Cell Inoculation
3:03
Quantification of Intracellular Bacteria with Improved Enzyme Protection Assay (iEPA)
4:44
Results: Intracellular Staphylococcus aureus Load in Epithelial Cells
5:54
Conclusion
