Name: Reprogramação Direta de Fibroblastos de Rato em Melanócitos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Aprenda a reprogramação direta de fibroblastos de rato em melanócitos funcionais usando apenas três fatores de transcrição: Mitf, Sox10 e PAX3. Este método otimizado oferece maior eficiência e estabilidade para terapias de doenças de despigmentação como vitiligo.

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Este estudo foi parcialmente apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (82070638 e 81770621) e da Fundação de Ciência Natural da Província de Jiangsu (BK20180281).

Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Gestão e Uso de Animais laboratoriais da Universidade de Jiangsu (UJS-IACUC-AP-20190305010). Os experimentos foram realizados em estrita conformidade com as normas estabelecidas pela Associação de Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care International (AAALAC International). Não houve experimentos envolvendo humanos, por isso este trabalho não precisava de aprovação do comitê de ética em pesquisa humana. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre os reagentes.
1. Construção de um sistema concentrado de embalagem de lentivírus para fatores de transcrição
<ol><li>Produção do vírus concentrado (Figura 1A, B)<ol>
<li>Placa 1,5 × 10células HEK-293T em um prato de 60 mm e cultivar essas células com meio normal (ver Tabela 1) a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO2. NOTA: Se o vírus precisar ser embalado em lotes, um prato de cultura celular de 100 mm pode ser usado (para detalhes, consulte Tabela 2).</li>
		<li>Após 24 horas, certifique-se de que as células HEK-293T atingiram 80-90% de confluência no dia da transdução, e substitua o meio por 3,5 mL de DMEM (150 μL de DMEM por 1 cm2). Deixe as células a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO2 por 2 h. NOTA: O meio de substituição deve ser livre de soro, para que as células possam ficar "famintas" para uma melhor transfecção plasmíida.</li>
		<li>Prepare a mistura de plasmídeos (mix A) contendo 3 μg dos plasmídeos alvos de Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 ou Snai2; 1 μg da embalagem plasmid PMD2. G e 2 μg da embalagem plasmid PSPAX2. Coma o volume da mistura de A a 150 μL com DMEM sem soro. Prepare a mistura do reagente de transfecção (mix B) adicionando 12 μL do reagente de transfecção (o volume é o dobro da massa total de todos os plasmídeos), e compor o volume da mistura B a 150 μL com DMEM sem soro. NOTA: Ao preparar as misturas, é importante adicionar líquido lentamente para evitar bolhas de ar.</li>
		<li>Misture a mistura A e misture B depois de deixá-los ficar em pé por 5 minutos à temperatura ambiente. Incubar a mistura à temperatura ambiente por 20-30 min para formar o complexo de transfecção.</li>
		<li>Retire as células HEK-293T da incubadora, substitua o meio por DMEM + 2% FBS, adicione a mistura da etapa 1.1.4 dropwise e misture o líquido suavemente.</li>
		<li>Após 8h, troque o meio com 3,5 mL de meio normal. Depois de mudar o meio, colete o vírus sobrenante a cada 24h e 48 h.</li>
		<li>Misture os supernacantes do vírus coletados em dois pontos de tempo diferentes. Centrifugar a 200 × g por 5 min a 4 °C. Passe o supernatante através de filtros de 0,45 μm e colete-o em um tubo cônico estéril de 50 mL. NOTA: O vírus coletado às 24h pode ser armazenado a 4 °C e misturado com o vírus coletado às 48h.</li>
		<li>Concentre o vírus sobrenante por centrifugação a 6000 × g a 4 °C durante a noite (~16 h). Certifique-se de que a pelota do vírus é visível na parte inferior do tubo cônico após a centrifugação.</li>
		<li>Despeje o supernatante lentamente. Dissolva a pelota do vírus em um volume de meio normal que é 1/100do volume do vírus supernante. Usando uma micropipette P1000, pipeta para cima e para baixo suavemente até que uma mistura homogênea seja obtida. Divida o vírus concentrado em tubos de microcentrifuuagem conforme necessário. Armazenar a −80 °C. NOTA: O vírus está concentrado 100x com este método. O vírus concentrado (100x) pode ser armazenado por >1 ano a −80 °C. Evite o congelamento repetido e o descongelamento do vírus.</li>
	</ol></li>
	<li>Detecção de titulação de vírus concentrado (Figura 1C)<ol>
<li>Placa 1 × 10células HEK-293T em um poço de uma placa de 6 poços. Lembre-se de adicionar um bem como um controle negativo. Cultura essas células com meio normal a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO2.</li>
		<li>Adicione 0,1 μL ou 0,2 μL de vírus concentrado fluorescente (100x) a cada poço após 24 horas, e adicione 4 ng/μL do reagente de transfecção polimérica cationic a cada poço. Cerca de 8-12 h após a infecção, substitua o meio por meio normal. NOTA: Para garantir a precisão e eficiência da detecção de fluorescência, a taxa de infecção deve ser de 10 a 30%. Adicionar 0,1 μL ou 0,2 μL do vírus concentrado fluorescente pode manter a eficiência da infecção dentro desta faixa. O titulador de vírus concentrado pode atingir 1 × 108 unidades transdutoras (TU)/mL pelo menos.</li>
		<li>Aproximadamente 48 horas após a infecção, lave o prato com 1 mL de soro fisiológico estéril tamponado (PBS) para remover células mortas.</li>
		<li>Trypsinize essas células usando 250 μL de 0,05% de trypsin-EDTA por poço em uma placa de 6 poços para 1 min à temperatura ambiente. Centrifugar a 200 × g por 5 min a 4 °C e, em seguida, remover o sobrenatante.</li>
		<li>Resuspenque a pelota celular em 1 mL de PBS, adicione a suspensão a um tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL e detecte a eficiência da infecção da fluorescência do vírus (proteína fluorescente verde, GFP+) usando citometria de fluxo.</li>
		<li>Calcule o titulador concentrado do vírus usando a seguinte fórmula: 105 (volume celular) × taxa de infecção (GFP+%)/volume de vírus adicionado (0,1 μL ou 0,2 μL).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Reprogramação direta de fibroblastos para melanócitos (Figura 2A)
<ol><li>Cubra um poço de uma placa de cultura celular de 6 poços com 1 mL de solução de gelatina de 0,1% à temperatura ambiente por 15-30 min. Certifique-se de que o poço está completamente coberto com a solução de gelatina de 0,1%. Aspire a solução de gelatina de 0,1% após o revestimento. NOTA: Prepare 0,1% solução de gelatina (100 mL) da seguinte forma: 0,1 g de gelatina em pó é dissolvido em 100 mL de água ultrapura em uma garrafa de vidro autoclaved e depois armazenado a 4 °C por no máximo 2 meses.</li>
	<li>Placa 5 × 104 MEFs em um poço de uma placa de 6 poços revestida com 0,1% de gelatina (como na etapa 2.1), e cultivar essas células com meio normal a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO2 durante a noite.</li>
	<li>Após 24 h, confirme que os MEFs atingiram 40-50% de confluência. Substitua o meio por meio normal.</li>
	<li>No dia 0, retire o vírus concentrado do congelador e derreta o vírus no gelo. Calcule o volume do vírus a ser adicionado usando eq. (1). Adicione o vírus concentrado para os seis fatores de transcrição, Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 e Snai2 (ver Tabela de Materiais) a cada poço de acordo com o volume calculado, e depois adicione 4 μg/mL do agente de transfecção polimérica cáfônica. Número celular (5 × 104) × 30 (multiplicidade de infecção, MOI)/titulante de vírus (1)</li>
	<li>No dia 1, 8-12 h após a infecção, remova o meio contendo o vírus e substitua-o por um meio normal fresco, adicionando 0,5 μg/mL puramicina para tela de linhas celulares infectadas estáveis.</li>
	<li>No dia 2, 48 h após a infecção, substitua gradualmente o meio supernante pelo meio de reprogramação. Primeiro, altere 1/4 do volume médio total e adicione 3 μM CHIR99021.</li>
	<li>Do dia 3 ao dia 7, dependendo da condição das células, altere o meio substituindo-se por uma maior proporção de meio de reprogramação (ver Tabela 1) gradualmente, e mude para meio de reprogramação completa dentro de 5 dias. NOTA: Durante este período, a puromicina e CHIR99021 devem ser utilizadas todos os dias. Muitas células mortas aparecerão no primeiro e segundo dia de mudança do meio de reprogramação. Isso é normal à medida que as células gradualmente se adaptam à transformação. Portanto, o meio precisa ser alterado gradualmente para garantir a proliferação saudável das células.</li>
	<li>Para passar as células, adicione 500 μL de 0,05% de trypsin-EDTA para digerir as células por 3 minutos à temperatura ambiente. Quando ~60% das células flutuarem para cima, pare a digestão adicionando meio normal 2x o volume da enzima digestiva. Colete a suspensão celular em um tubo cônico estéril de 15 mL, centrífuga a 200 × g por 5 min a 4 °C, remova o supernasce, resuspenque a pelota celular com o meio de reprogramação e coloque as células em um prato estéril de 60 mm a uma densidade de 3 × 104/cm2. Cultume essas células a 37 °C em uma incubadora umidificada de 5% de CO2 . NOTA: Do dia 8 ao dia 21, essas células são subculturadas a cada 3-5 dias e cultivadas em pratos estéreis de 60 mm para expandir. Eles podem ser cultivados para alcançar pelo menos a passagem 5.</li>
</ol>3. Otimização para reprogramação direta e identificação
<ol><li>Triagem para os fatores de transcrição otimizados<ol>
<li>Repita as etapas 2.1-2.7, reduzindo um dos seis fatores de transcrição de cada vez. Infecte os MEFs com o vírus com combinações de cinco fatores de transcrição.</li>
		<li>Sete dias após a infecção, extrair o RNA dessas células16 e analisar os níveis de expressão de seus genes melanócitos usando PCR de transcrição reversa (RT-PCR)17 para testar os fatores de transcrição com maior impacto na conversão para melanócitos, removendo-os um a um (Figura 3A).</li>
		<li>Use os três principais fatores de transcrição que afetam a conversão para melanócitos para infectar os MEFs. Repetir as etapas 2.1-2.7. NOTA: Sete dias após a infecção, os genes melanocíticos devem ser detectáveis nessas células transformadas (Figura 3B). As informações de primer para caracterização de iMels estão incluídas na Tabela 3.</li>
	</ol></li>
	<li>Identificação de melanócitos induzidos (iMels)<ol>
<li>Use a coloração de imunofluorescência18 para verificar se os iMels expressam proteínas melanocíticas, incluindo TYRP-1 e DCT (Figura 4A).</li>
		<li>Mancha específica de melanina 3,4-dihidroxyfenylalanina (DOPA) (Figura 4B)<ol>
<li>Prepare 4% paraformaldeído (10 mL) da seguinte forma: dissolver 0,4 g de pó de paraformaldeído em 10 mL PBS. Coloque a solução em forno a 56 °C por 2h para promover a dissolução. NOTA: A solução pode ser mantida a 4 °C por no máximo um mês.</li>
			<li>Cultura os iMels em um prato de 30 mm e lavar o prato duas vezes com PBS pré-aquecido. Adicione 1 mL de 4% de paraformaldeído para fixar as células por 20 minutos, e lave o prato 3 vezes com PBS.</li>
			<li>Prepare 0,1% solução de mancha DOPA (10 mL) pouco antes de usar dissolvendo 0,01 g de pó L-DOPA em 10 mL de PBS. Coloque a solução em um banho de água a 37 °C por 30 min; sacudi-lo várias vezes para promover a dissolução.</li>
			<li>Adicione 1 mL de solução de coloração DOPA recém-preparada de 0,1%. Incubar em forno a 37 °C por 2-5 h. Se não houver partículas marrom-pretas, continue a incubar a 37 °C por mais 2 h, mas não por >5 h. Verifique as amostras a cada 30 minutos.</li>
			<li>Lave o prato 3 vezes com PBS por 1 min cada vez. Manche o núcleo com 1 mL de solução de coloração de hematoxilina por 2 min.</li>
			<li>Para armazenamento a longo prazo, desidratar as amostras usando 95% de etanol por 3 min e depois 100% etanol por 5 min. Sele o prato com xileno e bálsamo neutro.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Mancha masson-fontana específica de melanina (Figura 4B)<ol>
<li>Placa iMels em um prato de 30 mm e fixar as células com 4% de paraformaldeído por 20 min; lave o prato 3 vezes com PBS.</li>
			<li>Adicione 1 mL de solução A (solução prata amônia) do kit de coloração Masson-Fontana (ver Tabela de Materiais), coloque o prato em uma caixa escura e coloque a caixa escura em um forno a 56 °C por 15-40 min. NOTA: Se as partículas marrom-pretas não forem visíveis após 15 minutos no forno, devolva as amostras ao forno de 56 °C para continuar incubando, mas não por >40 min. Um pouco de água pode ser adicionada à caixa escura para evitar a secagem.</li>
			<li>Solução aspirada A e lave o prato 5-6 vezes com água destilada, 1-2 min cada vez.</li>
			<li>Adicione 1 mL de solução B (solução hipo) do kit de coloração Masson-Fontana, e deixe o prato em temperatura ambiente por 3-5 min.</li>
			<li>Aspirar solução B e lavar o prato com água da torneira 3 vezes, 1 min cada vez.</li>
			<li>Adicione 1 mL de solução C (corante vermelho neutro) do kit de coloração Masson-Fontana, e deixe o prato em temperatura ambiente por 3-5 min.</li>
			<li>Aspirar solução C e lavar o prato 3 vezes com água destilada, 1 min cada vez.</li>
			<li>Adicione 1 mL de 100% de etanol para desidratação rápida, e aspire o etanol após 3 min. NOTA: As amostras manchadas podem ser armazenadas por muito tempo após a vedação com xileno e bálsamo neutro.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Ezzedine, K., Eleftheriadou, V., Whitton, M., van Geel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitiligo%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Vitiligo.</a> Lancet. 386 (9988), 74-84 (2015).</li>
<li>Picardo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitiligo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Vitiligo.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 1, 15011(2015).</li>
<li>Speeckaert, R., van Geel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitiligo%3A+An+update+on+pathophysiology+and+treatment+options%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Vitiligo: An update on pathophysiology and treatment options.</a> American Journal of Clinical Dermatology. 18 (6), 733-744 (2017).</li>
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<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+transcription+factor-mediated+reprogramming+to+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (3), 183-193 (2016).</li>
<li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cell-based+cell+therapy-promise+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cell-based cell therapy-promise and challenges.</a> Cell Stem Cell. 27 (4), 523-531 (2020).</li>
<li>Xu, J., Du, Y., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+lineage+reprogramming%3A+strategies%2C+mechanisms%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications.</a> Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).</li>
<li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 375-386 (2010).</li>
<li>Gascón, S., Masserdotti, G., Russo, G. L., Götz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+neuronal+reprogramming%3A+achievements%2C+hurdles%2C+and+new+roads+to+success%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct neuronal reprogramming: achievements, hurdles, and new roads to success.</a> Cell Stem Cell. 21 (1), 18-34 (2017).</li>
<li>Atkinson, P. J., Kim, G. S., Cheng, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+cellular+reprogramming+and+inner+ear+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Biological+Therapy%22%5BJournal%5D)">Direct cellular reprogramming and inner ear regeneration.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (2), 129-139 (2019).</li>
<li>Kurita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+reprogramming+of+wound-resident+cells+generates+skin+epithelial+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo reprogramming of wound-resident cells generates skin epithelial tissue.</a> Nature. 561 (7722), 243-247 (2018).</li>
<li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+mouse+and+human+fibroblasts+to+functional+melanocytes+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors.</a> Nature Communications. 5, 5807(2014).</li>
<li>Fehrenbach, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+tumorigenic+potential+upon+transdifferentiation+from+keratinocytic+into+melanocytic+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Loss of tumorigenic potential upon transdifferentiation from keratinocytic into melanocytic lineage.</a> Scientific Reports. 6, 28891(2016).</li>
<li>Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+streamlined+protocol+for+extracting+RNA+and+genomic+DNA+from+archived+human+blood+and+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle.</a> Analytical Biochemistry. 474, 25-27 (2015).</li>
<li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse-transcription+PCR+%28RT-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reverse-transcription PCR (RT-PCR).</a> Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).</li>
<li>Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence staining.</a> Current Protocols in Cell Biology. 69 (1), 1-7 (2015).</li>
<li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-viral+vectors+for+gene-based+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Non-viral vectors for gene-based therapy.</a> Nature Reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

A qualidade do vírus é crucial para o sucesso da reprogramação direta aos melanócitos neste protocolo. O método de embalar e concentrar vírus neste protocolo é simples e fácil de repetir e não conta com nenhum outro reagente concentrado auxiliar. Este protocolo pode ser seguido com sucesso na maioria dos laboratórios. Para garantir a qualidade do vírus concentrado, os seguintes pontos precisam de atenção especial. Um deles é o estado celular do HEK-293T. Embora as células HEK-293T sejam células imortalizadas, as células ...

O vitiligo é uma doença de pele que afeta seriamente a saúde física e mental dos indivíduos afetados. Por várias razões, incluindo anormalidades metabólicas, estresse oxidativo, geração de mediadores inflamatórios, descolamento celular e resposta autoimune, os melanócitos funcionais são perdidos, e a secreção da melanina é interrompida, levando ao desenvolvimento do vitiligo 1,2. Esta condição ocorre amplamente e é particularmente problemática no rosto. O principal tratamento é o uso sistêmico de corticosteroides e imunomoduladores. A fototerapia pode ser usada para doenças sistêmicas ou locais, e há tratamentos cirúrgicos, como transplante de pele perfurado e transplante de melanócitos autólogos 3,4,5. No entanto, pacientes que usam terapia medicamentosa e fototerapia são propensos a recaídas, e esses tratamentos têm efeitos terapêuticos de longo prazo ruins. O tratamento cirúrgico é traumático e apenas moderadamente eficaz 2,6. Portanto, uma nova e eficaz estratégia terapêutica é necessária para o vitiligo.
A reprogramação de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) reverte essas células de seu estado terminal para um estado pluripotente, um processo mediado pelos fatores de transcrição, Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc7. No entanto, devido à possibilidade de tumorigenicidade e ao longo tempo de produção, essa tecnologia tem sido recebida com ceticismo quando aplicada aos cenários clínicos8. Reprogramação direta é uma tecnologia que faz com que um tipo de célula terminal se transforme em outro tipo de célula terminal9. Esse processo é alcançado por fatores adequados de transcrição. Várias células já foram diretamente reprogramadas com sucesso, incluindo cardiomiócitos10, neurônios11 e células ciliadas cocleares12. Alguns pesquisadores até reprogramaram tecido da pele diretamente in situ, que pode ser usado para reparação de feridas13. As vantagens da reprogramação direta incluem redução do tempo de espera e custos, menor risco de câncer, menos problemas éticos e uma melhor compreensão do mecanismo subjacente à determinação do destinocelular 9.
Embora o método de reprogramação direta seja amplamente utilizado, atualmente não há um método definido para a reprogramação direta das células da pele em melanócitos, especialmente por causa dos numerosos fatores de transcrição a serem considerados14,15. Os fatores de transcrição, Mitf, Sox10 e Pax3, têm sido usados para reprogramação direta de células da pele em melanócitos14. Em contraste, a combinação de MITF, PAX3, SOX2 e SOX9 também tem sido usada para reprogramação direta de células da pele em melanócitos humanos em outro estudo15. Neste protocolo, apesar do uso de um método de triagem diferente, o mesmo resultado foi obtido com a combinação de Mitf, Sox10 e Pax3 para reprogramação direta de células da pele em melanócitos como descrito anteriormente14. Desenvolver um sistema para gerar melanócitos de outras células da pele pode fornecer um esquema para transformar outras células da pele de pacientes com vitiligo em melanócitos. Por isso, é fundamental construir um método simples e eficiente para essa reprogramação direta para gerar melanócitos com sucesso.

<table><tbody><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-062</td><td>Armazenado a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>0,45 &mu; Filtro</td><td>M Millipore</td><td>SLHVR33RB</td><td></td></tr><tr><td>5 mL de tubo de fundo redondo de poliestireno</td><td>Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>95%/100% etanol</td><td>LANBAO</td><td>210106</td><td>Armazenado em RT</td></tr><tr><td>Adenina</td><td>Sigma</td><td>A2786</td><td>Concentração de estoque 40 mg/mL Concentração final 24 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a</td><td>Invitrogen</td><td>A21137</td><td>Diluição de 1:500 para usar</td></tr><tr><td>Antibióticos(Pen/Strep)</td> <td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Armazenado a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Anti-TRP1/TYRP1</td><td>Anticorpo Millipore</td><td>MABC592</td><td>Hospedeiro/Isotipo: Camundongo IgG2a Reatividade da espécie: Camundongo/Humano Diluição de 1:200 para usar</td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-TRP2/DCT</td><td>Abcam</td><td>ab74073</td><td>Hospedeiro/Isotipo: Coelho IgG Reatividade da espécie: Camundongo/Humano Diluição de 1:200 para uso</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004</td><td>Concentração de estoque 10 mM Final concentração 3 &mu; </td></tr><tr><td>M Toxina da cólera</td><td>Sigma</td><td>C8052</td><td>Concentração de estoque 0,3 mg/mL Concentração final 20 pM</td></tr><tr><td>Cy3 IgG anti-coelho de cabra (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-165-144</td><td>Diluição de 1:500 para usar</td></tr><tr><td>DMEM (glicose alta)</td><td>HyClone</td><td>SH30243,01</td><td>Armazenado a 4 &graus; C</td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>Armazenado em RT</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>Armazenado em -20 &deg; C Inativado por calor antes do uso</td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td>Armazenada em plasmídeos</td></tr><tr><td>RT GFP-PURO (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 e Snai2)</td><td>Hanheng Biological Technology Co., Ltd.</td><td>pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325</td><td>Armazenado em -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>Abcam</td><td>ab220365</td><td>Armazenado em RT</td></tr><tr><td>EDN3 Humano</td><td>American-Peptide</td><td>88-5-10A</td><td>Concentração de estoque 100 &mu; M Concentração final 0,1 &mu; </td></tr><tr><td>M Hidrocortisona</td><td>Sigma</td><td>H0888</td><td>Concentração de estoque 100 &micro; g/mL Concentração final 0,5 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>L-DOPA</td><td>Sigma</td><td>D9628</td><td>Armazenado em RT</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Reagente de transfecção, armazenado a 4 &graus; C</td></tr><tr><td>Kit de coloração Masson-Fontana</td><td>Solarbio</td><td>G2032</td><td>Armazenado a 4 & C</td></tr><tr><td>Bálsamo neutro</td><td>Solarbio</td><td>G8590</td><td>Armazenado a 4 &graus; C</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>Armazenado em RT</td></tr><tr><td>PBS (-)</td> <td>Gibco</td><td>C10010500BT</td><td>Armazenado em RT</td></tr><tr><td>Phorbol 12-miristato 13-acetato (TPA)</td> <td>Sigma</td><td>P8139</td><td>Concentração de estoque 1 mM Concentração final 200 nM</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td>reagente de transfecção polimérica catiônica; Concentração de estoque 8 &mu; g/&micro; L Concentração final 4 ng/&micro; L</td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Gibco</td><td>A11138-03</td><td>Armazenado a -20 &graus; C</td></tr><tr><td>Humano recombinante bFGF</td><td>Invitrogen</td><td>13256-029</td><td>Concentração de estoque 4 &mu; g/mL Concentração final 10 ng/mL</td></tr><tr><td>Insulina humana recombinante</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>I3536</td><td>Concentração de estoque 10 mg/mL Concentração final 5 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>SCF humano recombinante</td><td>R& D</td><td>255-SC-010</td><td>Concentração de estoque 200 &mu; g/mL Concentração final 100 ng/mL</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td>Armazenado a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma</td><td>1330-20-7</td><td>armazenado em RT</td></tr></tbody></table>

reprogramação direta de fibroblastos de rato em melanócitos

Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes

A perda da função dos melanócitos leva ao vitiligo, que afeta seriamente a saúde física e mental dos indivíduos afetados. Atualmente, não há tratamento eficaz a longo prazo para o vitiligo. Portanto, é imprescindível desenvolver um tratamento conveniente e eficaz para o vitiligo. A tecnologia de medicina regenerativa para reprogramação direta de células da pele em melanócitos parece ser um novo tratamento promissor do vitiligo. Isso envolve a reprogramação direta das células da pele do paciente em melanócitos funcionais para ajudar a amenizar a perda de melanócitos em pacientes com vitiligo. No entanto, este método precisa ser testado primeiro em camundongos. Embora a reprogramação direta seja amplamente utilizada, não há um protocolo claro para reprogramação direta em melanócitos. Além disso, o número de fatores de transcrição disponíveis é esmagador. 
Aqui, um protocolo concentrado do sistema de embalagem de lentivírus é apresentado para produzir fatores de transcrição selecionados para reprogramação de células da pele para melanócitos, incluindo Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 e Snai2. Os fibroblastos embrionários do camundongo (MEFs) foram infectados com o lentivírus concentrado para todos esses fatores de transcrição para a reprogramação direta dos MEFs em melanócitos induzidos (iMels) in vitro. Além disso, esses fatores de transcrição foram examinados, e o sistema foi otimizado para reprogramação direta aos melanócitos. A expressão dos marcadores característicos da melanina em iMels no nível genético ou proteico foi significativamente aumentada. Esses resultados sugerem que a reprogramação direta de fibroblastos para melanócitos pode ser uma nova estratégia terapêutica bem sucedida para o vitiligo e confirmar o mecanismo de desenvolvimento de melanócitos, o que fornecerá a base para uma reprogramação direta de fibroblastos em melanócitos in vivo.

Este artigo inclui os protocolos de um sistema concentrado de embalagem de lentivírus para produzir lentivírus de fatores de transcrição para reprogramação direta de fibroblastos para melanócitos e protocolos para triagem de fatores de transcrição e reprogramação direta de melanócitos de MEFs.
O sucesso da produção concentrada de lentivírus foi avaliado observando a intensidade de fluorescência de GFP (Figura 1A) ou por citometria de fluxo (Fi...

Aqui, descrevemos um sistema de reprogramação direta otimizado para melanócitos e um sistema de embalagem de vírus concentrado de alta eficiência que garante uma reprogramação direta suave.

Reprogramação Direta de Fibroblastos de Rato em Melanócitos

The loss of function of melanocytes leads to vitiligo, which seriously affects the physical and mental health of the affected individuals. Presently, ...

A reprogramação direta para gerar melanócitos foi relatada. No entanto, vários fatores de transcrição são utilizados em diferentes estudos. Neste protocolo, validamos e reduzimos o número do fator de transcrição ainda com maior eficiência de reprogramação.Estabelecemos um sistema de reprogramação direta para gerar melanócitos usando apenas três fatores de transcrição, Mitf, Sox10 e PAX3, e modificamos o sistema de cultura para torná-lo mais estável e robusto. Como regenerar melanócitos funcionais é uma questão significativa que pode ajudar a lidar com limitações terapêuticas para doenças despigmentação como o vitiligo. A reprogramação certa proporciona uma potencial Nossa técnica tem as características de conveniência, forte operabilidade e estabilidade, o que é mais fácil de promover e repetir.Para iniciar a produção do lentivírus concentrado, a placa 1,5 vezes 10 para as 6 células HEK-293T em um prato de 60 milímetros, e cultivar as células com meio normal a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono. Após 24 horas de incubação, quando as células HEK-293T atingirem 80 a 90% de confluência, substitua o meio por 3,5 mL de DMEM e incuba as células a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono por duas horas. Depois de remover as células da incubadora, substitua o meio por DMEM contendo 2% de FBS e adicione a mistura de complexo de transfecção recém-preparada às células de forma drop-wise.Misture a mistura líquida suavemente. Ao completar oito horas, troque o meio celular com 3,5 mL de meio normal. Colete o vírus supernante em 24 e 48 horas.Em seguida, misture os supernacantes do vírus coletados em dois pontos de tempo diferentes e centrifugar a mistura a 200 xg por cinco minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, passe o supernante coletado através de filtros de 0,45 mícrons para coletar o filtrado em um tubo cônico estéril de 50 mL. Concentre o vírus filtrado supernacido por centrifugação a 6.000 xg a quatro graus Celsius durante a noite.Uma vez feito, certifique-se de que a pelota do vírus é visível na parte inferior do tubo cônico. Despeje o supernatante lentamente. Para dissolver a pelota do vírus no meio normal com um por 100º volume do vírus supernante.Use uma micropipette P1000 para pipeta para cima e para baixo suavemente até que uma mistura homogênea de vírus concentrado de 100x seja obtida. Divida o vírus concentrado nos tubos de microcentrifuuagem para armazenar a 80 graus Celsius. Placa 1 vezes 10 para a 5ª célula HEK-293T em um poço de uma placa de seis poços.Cultuam essas células com o meio normal a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono. Após 24 horas, adicione 0,1 a 0,2 microlitres do vírus concentrado fluorescente de 100x a cada poço. Seguido pela adição de quatro nanogramas por microliters do reagente de transfecção policrórica cônica a cada poço.Cerca de oito a doze horas após a infecção pelo vírus, substitua o meio pelo meio normal. Às 48 horas após a infecção, lave o prato com 1 mL de PBS estéril para remover as células mortas. Em seguida, tentepsinizar as células usando 250 microlitres de 0,05% trypsin-EDTA solução por poço de uma placa de seis poços à temperatura ambiente.Centrifugar a placa a 200 xg por cinco minutos a quatro graus Celsius. Depois de remover o supernasce, suspenda a pelota celular em um mL de PBS e adicione a suspensão celular a um tubo de fundo redondo de poliestireno de cinco mL. Em seguida, coloque o tubo no citômetro de fluxo para analisar a amostra.Para reprogramação direta de fibroblastos, cubra um poço de uma placa de cultura celular de seis poços com 1 mL de solução de gelatina de 0,1% à temperatura ambiente. Após 15 a 30 minutos, quando o poço estiver completamente coberto com a gelatina, aspirar solução de gelatina de 0,1%. Em seguida, chapa 5 vezes 10 para o 4º camundongo fibroblastos embrionários, ou MEFs, em um poço de uma placa de seis poços revestida com 0,1% de gelatina, e cultura as células durante a noite com o meio normal a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono.Após 24 horas, quando os MEFs atingirem 40 a 50% de confluência, substitua o meio pelo meio normal. Em seguida, derreta o vírus congelado e concentrado no gelo. Calcule o volume do vírus a ser adicionado usando a equação e, em seguida, adicione o vírus concentrado para os seis fatores de transcrição a cada poço, de acordo com o volume calculado.Adicione quatro microgramas por mL do agente de transfecção polimérica cônica ao poço. Considere-o como o dia zero da infecção por lentivírus. No primeiro dia, após 8 a 12 horas de infecção, substitua o meio contendo o vírus pelo meio normal fresco, ao mesmo tempo em que adiciona 0,5 microgramas por mL puramicina para tela de linhas celulares infectadas estáveis.No segundo dia, 48 horas após a infecção, substitua gradualmente o meio supernante pelo meio de reprogramação. Altere um quarto do volume médio total antes de adicionar três micromolar CHIR99021. Do terceiro ao sétimo dia, dependendo da condição das células, altere o meio substituindo-o gradualmente por uma maior proporção de meio de reprogramação para mudar para o meio de reprogramação completo dentro de cinco dias.Em seguida, desprendem as células com 500 microlitrais de enzima digestiva 0,05% trypsin-EDTA por três minutos à temperatura ambiente. Quando aproximadamente sessenta por cento das células flutuarem, pare a digestão adicionando o meio normal, duas vezes o volume da enzima digestiva. Colete a suspensão celular em um tubo cônico estéril de 15 mL para centrífuga a 200 xg por cinco minutos a quatro graus Celsius.Remova o supernatante antes de suspender a pelota celular com o meio de reprogramação. Quando terminar, emplaque as células re-suspensas em um prato estéril de 60 milímetros. Cultume as células a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada de 5% de dióxido de carbono.Após quarenta e oito horas de infecção por lentivírus em células HEK-293T, o sucesso da produção concentrada de lentivírus foi avaliado observando a intensidade de fluorescência do GFP ou por citometria de fluxo. O título do vírus concentrado foi encontrado alto em 10 a 8 tu/mL. Durante a reprogramação direta dos fibroblastos, a morfologia celular mudou gradualmente para sinapse celular alongada e núcleos celulares aumentados.No entanto, as células envelhecem progressivamente após o dia 20. A remoção dos fatores de transcrição, Mitf, Pax3 ou Sox10, resultou no silenciamento da expressão de genes melanócticos, Tyr, Tyrp1 e Mlana, indicando o maior impacto na conversão do fibroblasto para melanócitos. Assim, a expressão de genes melanóciticos induzidos pela programação direta com três fatores de transcrição foi maior quando comparada com seis fatores de transcrição.Para identificar melanócitos induzidos pelo MEF, ou iMels, a expressão de marcadores melanócticos, TYRP1 e DCT foi detectada usando manchas imunofluorescentes. Além disso, os métodos de coloração específicos de melanina, como dopa e coloração de Masson-Fontana, apresentaram resultados positivos. As células 293T devem ser distribuídas uniformemente.Além disso, a adição de mistura de transfecção às células deve ser feita suavemente para evitar que as células flutuam. O protocolo é estável e prático e pode ser usado para reprogramar outros tipos de células. Espera fornecer uma referência e uma estratégia para a reprogramação direta in vivo na regeneração de melanócitos na medicina futura.

direct-reprogramming-of-mouse-fibroblasts-into-melanocytes

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este vídeo mostra o procedimento para gerar células-tronco pluripotentes induzidas usando lentivírus induzível que expressam Oct4, Sox2, c-Myc e KLF4.

Geração de iPS a partir de células MEFS através da expressão forçada de Sox-2, Oct-4, c-Myc e KLF4

Este vídeo descreve o método rápido para isolar e cultivar os melanócitos e fibroblastos simultaneamente da pele do filhote de camundongo pós-natal. Essas células podem ser mantidas e manipuladas in vitro para estudar a biologia celular da pele, cicatrização de feridas e melanoma.

Cultura Rápida de Melanócitos Murinos Primários e Fibroblastos: Isolamento de Melanócitos e Fibroblastos de Amostra de Pele Murina Inteira

Geração de células estaminais pluripotentes induzidas proporciona perspectivas fascinantes para a derivação de transplantes autólogos. No entanto, a progressão através de um estado pluripotente e trabalhoso re-diferenciação ainda dificulta a tradução clínica. Aqui nós descrevemos a derivação de fibroblastos humanos adultos ea sua conversão direta em células progenitoras neurais induzidos ea subsequente diferenciação em linhagens neuronais.

Derivação de adultos fibroblastos humanos e sua conversão direta em Expansível Neural células progenitoras

O protocolo descrito aqui detalha a indução de um programa hemogênico em fibroblastos embrionários de camundongos por meio da superexpressão de um conjunto mínimo de fatores de transcrição. Essa tecnologia pode ser traduzida para o sistema humano para fornecer plataformas para estudos futuros de hematopoiese, doenças hematológicas e transplante de células-tronco hematopoiéticas.

Reprogramação do rato embrionárias fibroblastos com Fatores de transcrição para induzir um Programa hegemônicos

Aqui nós apresentamos um método robusto para reprogramar fibroblastos embrionários primários em cardiomyocytes funcional através de superexpressão de GATA4 Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 e miR-133 (GHMT2m) juntamente com a inibição da sinalização do TGF-β. Nosso protocolo gera cardiomyocytes bater tão cedo quanto pós-transdução de 7 dias com até 60% eficiência.

Supressão de sinalização pró-fibróticos potencializa mediada por fator de reprogramação de fibroblastos embrionários de rato em Cardiomyocytes induzida

Aqui apresentamos nosso protocolo para produzir induzido eritroide progenitores (iEPs) de fibroblastos adulto de rato usando orientada por factor de transcrição direta linhagem reprogramação (DLR).

Direto de linhagem reprogramação de fibroblastos de rato adulto de progenitores eritroide

Aqui nós descrevemos um método clinicamente relevante, alta eficiência, livre de alimentador para reprogramar fibroblastos humanos primários em células-tronco pluripotentes induzidas usando modificados mRNAs codificação fatores reprogramação e imita o microRNA madura-367/302. Também está incluídos métodos para avaliar a eficiência de reprogramação, expanda iPSC clonal colônias e confirmar a expressão do marcador pluripotência TRA-1-60.

Baseado em RNA reprogramação de fibroblastos humanos primários em células-tronco pluripotentes induzidas

Este protocolo esboça um método rápido para gerar simultaneamente culturas do melanócito e do fibroblasto da pele de 0-4 ratos velhos do dia. Estas culturas primárias podem ser mantidas e manipuladas in vitro para estudar uma variedade de processos fisiologicamente relevantes, incluindo biologia celular da pele, pigmentação, cicatrização de feridas e melanoma.

Geração rápida de culturas de melanócitos e fibroblastos de Murina primária

Este protocolo demonstra a indução de um programa hemogenic em fibroblastos dérmicos humanos pela expressão forçada dos fatores de transcrição GATA2, GFI1B e FOS para gerar células-tronco e progenitoras hematopoiéticas.

Reprogramação hemogénica de fibroblastos humanos pela expressão forçada de fatores de transcrição

A reprogramação celular requer a introdução de genes-chave, que regulam e mantêm o estado celular pluripotente. O protocolo descrito permite a formação de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) colônias de fibroblastos dérmicos humanos sem métodos virais/integradores, mas usando RNAs não modificados (NM-RNAs) combinados com fatores de evasão imunológica reduzindo os mecanismos de defesa celular.

Isolamento de fibroblastos dérmicos humanos adultos da pele abdominal e geração de células-tronco pluripotentes induzidas usando um método não integrador

Este protocolo descreve a conversão de fibroblastos de pele em míobios e sua diferenciação em miotubes. As linhas celulares são derivadas de pacientes com distúrbios neuromusculares e podem ser usadas para investigar mecanismos patológicos e testar estratégias terapêuticas.

Reprogramação Direta de Fibroblastos Humanos em Myoblasts para investigar terapias para distúrbios neuromusculares

Aprenda a reprogramação direta de fibroblastos de rato em melanócitos funcionais usando apenas três fatores de transcrição: Mitf, Sox10 e PAX3. Este método otimizado oferece maior eficiência e estabilidade para terapias de doenças de despigmentação como vitiligo.

Reprogramação Direta de Fibroblastos de Rato em Melanócitos

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