Name: Ensaios de transferência de energia de ressonância de Förster para medição de proteínas STAT fosforilatos endogensas em células humanas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Aprenda a quantificar proteínas STAT fosforiladas endógenas em lisados celulares usando ensaios TR-FRET em formato de 384 poços. Este método oferece uma alternativa rápida, reprodutível e sem etapas de lavagem aos métodos convencionais como Western blot e ELISA.

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1. Cultura celular
<ol><li>Manter as células em uma incubadora e cultura de CO2 umidificados de 37 °C/5% com DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) (células HeLa e A431) ou RPMI suplementado com 15% de FBS (células U266B1). Cultuize as células até atingirem 70-80% de confluência, depois tentem e os façam para os ensaios. NOTA: A mídia cultural continha fenol vermelho. Nenhuma fome de soro foi conduzida para qualquer linha celular antes de conduzir os ensaios.</li>
</ol>2. Estimulador ou titulação inibidora utilizando o protocolo de ensaio de duas placas com células aderentes
NOTA: Este procedimento descreve como determinar potências estimuladoras ou inibidoras, gerando uma curva de resposta de concentração a partir de uma série de diluição do composto de teste.
<ol><li>Semeadura celular<ol>
<li>Dispense 50 μL de células na densidade pré-otimizada (40.000 células HeLa/well para STAT3 e STAT6; 75.000 células A431/poço para STAT5) em uma placa tratada com cultura de tecido de 96 poços no meio de cultura adequado. Incubar durante a noite a 37 °C/5% de CO2. NOTA: A densidade celular ideal e o tempo de incubação da cultura precisam ser determinados.</li>
	</ol></li>
	<li>Diluições de compostos de teste<ol>
<li>Prepare a série intermediária de diluição de 2x de compostos de teste(s) diluindo em série compostos (diluições de intervalo de meio log) em 12 poços de uma placa de polipropileno de 96 poços em meio livre de soro. NOTA: Recomenda-se realizar uma curva de concentração-resposta de intervalo de intervalo de 12 pontos, em pelo menos duplicada para uma estimativa precisa do EC50 ou IC50.</li>
		<li>Alternativamente, para compostos de teste hidrofóbicos, dimetilsulfoxida (DMSO) solúveis, realize as diluições iniciais em 100% DMSO e, em seguida, dilua a série de diluição composta em meio livre de soro. NOTA: A tolerância ao ensaio ao DMSO deve ser estabelecida antes de realizar uma titulação composta de teste no veículo DMSO. É importante manter concentrações de solventes iguais entre células tratadas e não tratadas. Além disso, ao testar diluições seriais de compostos, as concentrações de solventes devem permanecer sempre constantes em toda a série de diluição.</li>
	</ol></li>
	<li>Tratamento celular<ol>
<li>Para estimulação celular, adicione 50 μL de meio livre de soro sozinho (células não tratadas) ou contendo o estimulador (2x).</li>
		<li>Incubar para o tempo pré-otimizado em temperatura ambiente (RT) ou 37 °C (interferon (IFN) α2b/20 min em RT para STAT3; fator de crescimento epidérmico (EGF)/10 min na RT para STAT5; interleucina (IL)-4/20 min na RT para STAT6). Prossiga em seguida para a seção 2.4. NOTA: A temperatura ideal de incubação precisa ser determinada.</li>
		<li>Para inibição celular, adicione 25 μL de meio livre de soro sozinho (células não tratadas) ou contendo o inibidor (4x).</li>
		<li>Incubar para o tempo pré-otimizado em RT ou 37 °C (Inibidor JAK 1/30 min em RT para STAT3 e STAT6; Erlotinib/15 min em RT para STAT5).</li>
		<li>Adicione 25 μL de meio livre de soro sozinho (células não tratadas) ou contendo o estimulador (4x) em seu EC80.</li>
		<li>Incubar para o tempo pré-otimizado em RT ou 37 °C (mesmas condições da etapa 2.3.2).</li>
	</ol></li>
	<li>Lise celular<ol>
<li>Prepare o tampão de lyse 1x complementado específico do kit, conforme indicado pelo fabricante. NOTA: É obrigatório complementar o 1x Lysis Buffer com o Coquetel Inibidor de Fosfatase 100x diluído a uma concentração final de 1x. O tampão de lyse suplementada 1x contém flúor de sódio de 1 mM, ortovanadato de sódio de 2 mM e 2 mM beta-glicerofosfato. Outros inibidores de fosfatase não são necessários e devem ser evitados. Tampões de lise e inibidores de fosfatase que não sejam os incluídos no kit não são recomendados, pois podem conter ingredientes que podem interferir na medição.</li>
		<li>Remova e descarte cuidadosamente o meio de cultura celular aspirando o supernasce.</li>
		<li>Adicione imediatamente 50 μL de 1x Tampão de Lise Suplementar. NOTA: O volume do buffer de lise (25-50 μL) pode ser otimizado.</li>
		<li>Incubar por 30 min em RT sob agitação (shaker de placa orbital a 400 rpm; agitação moderada). NOTA: O tempo de incubação da lise (30-60 min) pode ser otimizado. Os lysates podem ser usados imediatamente para detecção de proteínas-alvo ou congelados a -80 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Detecção de TR-FRET<ol>
<li>Prepare o mix de detecção de anticorpos 4x em 1x tampão de detecção, conforme indicado pelo fabricante.</li>
		<li>Nesta etapa de transferência, cuidadosamente pipeta 15 μL de lysato celular da placa de cultura de 96 poços para um poço de uma microplata branca de baixo volume 384-well.</li>
		<li>Adicione 15 μL do Lysate de Controle Positivo e 15 μL de 1x Lysis Buffer (controle negativo) para poços de ensaio separados.</li>
		<li>Adicione 5 μL de mistura de detecção de anticorpos 4x (ou Eu-Ab1/FR-Ab2 para detecção da proteína fosfo ou Eu-Ab3/FR-Ab4 para detecção da proteína total) a cada um dos poços de ensaio.</li>
		<li>Cubra a placa com um selador de placas e incubar por 1h até a noite na RT, dependendo do ensaio (consulte a Ficha Técnica correspondente). NOTA: O tempo ideal de leitura precisa ser otimizado para cada ensaio e linha celular. A placa pode ser lida várias vezes sem um efeito negativo sobre o desempenho do ensaio.</li>
		<li>Remova o selador de placa adesiva e leia a placa em um leitor de microplacão compatível com TR-FRET. NOTA: Recomenda-se fluorômetros à base de filtro, embora alguns instrumentos monocromáticos possam ser usados. Verifique se o módulo óptico apropriado (filtros e espelho) para TR-FRET está instalado. Use um comprimento de onda de excitação de 320 ou 340 nm para excitar o chelate Europium. Leia ensaios tanto em 615 nm (ou 620 nm) e 665 nm para detectar tanto a emissão do europium doador quanto do fluoróforo aceitor, respectivamente. As configurações do instrumento dependerão do leitor em particular. Os dados aqui apresentados foram obtidos utilizando-se excitação baseada em lâmpadas, 90 μs de atraso, tempo de integração de 300 μs e 100 flashes por poço. O ensaio phospho-STAT4, no entanto, foi lido usando excitação a laser para gerar maiores relações sinal-fundo (S/B).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Estimulador ou titulação inibidora usando o protocolo de ensaio de duas placas com células de suspensão
<ol><li>Diluição de compostos de teste<ol>
<li>Prepare a série intermediária de diluição de 2x de compostos de teste, conforme descrito nas etapas 2.2.1 e 2.2.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Semeadura celular e tratamento<ol>
<li>Dispense 20 μL de células na densidade pré-otimizada (200.000 células U266B1/poço para STAT1; 400.000 células U266B1/bem para STAT4) em uma placa tratada com cultura de tecido de 96 poços no meio de cultura adequado. Proceder diretamente ao tratamento celular ou incubar 2-4 h a 37 °C, 5% de CO2. NOTA: Esta etapa precisa ser otimizada para diferentes tipos de células.</li>
		<li>Para estimulação celular, adicione 20 μL de meio livre de soro sozinho (células não tratadas) ou contendo o estimulador (2x).</li>
		<li>Incubar para o tempo pré-otimizado em RT ou 37 °C (IFNα2b/15 min em RT para STAT1; IFNα2b/25 min a 37 °C para STAT4). Prossiga em seguida para a seção 3.3. NOTA: A temperatura ideal de incubação precisa ser determinada.</li>
		<li>Para inibição celular, adicione 10 μL de meio livre de soro sozinho (células não tratadas) ou contendo o inibidor (4x).</li>
		<li>Incubar para o tempo pré-otimizado em RT ou 37 °C (Inibidor JAK 1/30 min em RT para STAT1 e STAT4).</li>
		<li>Adicione 10 μL de meio livre de soro sozinho (células não tratadas) ou contendo o estimulador (4x) em seu EC80.</li>
		<li>Incubar para o tempo pré-otimizado em RT ou 37 °C (mesmas condições da etapa 3.2.3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lise celular<ol>
<li>Prepare o buffer específico de 5x de lise suplementar do kit, conforme indicado pelo fabricante. NOTA: É obrigatório complementar o Tampão de Lysis 5x com o Coquetel Inibidor de Fosfatase 100x diluído a uma concentração final de 5x. O tampão de lyse suplementada 5x contém flúor de sódio de 5 mM, ortovanadato de sódio de 10 mM e 10 mM beta-glicerofosfato. Outros inibidores de fosfatase não são necessários e devem ser evitados.</li>
		<li>Adicione 10 μL de 5x tampão de lise suplementada.</li>
		<li>Incubar por 30 min em RT sob agitação (shaker de placa orbital a 400 rpm; agitação moderada). NOTA: O tempo de incubação da lise (30-60 min) pode ser otimizado. Os lysates podem ser usados imediatamente para detecção de proteínas-alvo ou congelados a -80 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Detecção de TR-FRET<ol>
<li>Após a lise celular, realize a etapa de detecção TR-FRET conforme descrito na seção 2.5 para o protocolo de ensaio de 2 placas para células aderentes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Titulação estimuladora usando o protocolo de ensaio de uma placa com células aderentes ou suspensas
<ol><li>Diluição de compostos de teste<ol>
<li>Prepare a série de diluição intermediária de compostos de teste em 3x, diluindo em série compostos(s) (diluições de intervalo de meio log) em 12 poços de uma placa de polipropileno de 96 poços em meio livre de soro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Semeadura celular e tratamento<ol>
<li>Dispense 8 μL de células na densidade pré-otimizada (160.000 células U266B1/poço para STAT4; 80.000 células HeLa/well para STAT6), no meio de cultura sem soro apropriado, em uma placa de ensaio branco, de baixo volume 384. Proceder diretamente ao tratamento celular ou incubar 2-4 h a 37 °C, 5% de CO2. NOTA: A exigência de um período de incubação da cultura celular antes do tratamento precisa ser determinada para diferentes tipos de células.</li>
		<li>Para estimulação celular, adicione 4 μL de meio livre de soro sozinho (células não tratadas) ou contendo o estimulador (3x).</li>
		<li>Incubar para o tempo pré-otimizado em temperatura ambiente ou 37 °C (IFNα2b/25 min a 37°C para STAT4; IL-4/20 min a 37°C para STAT6). Prossiga em seguida para a seção 4.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lise celular<ol>
<li>Prepare o buffer específico de 5x de lise suplementar do kit, conforme indicado pelo fabricante. NOTA: É obrigatório complementar o Tampão de Lysis 5x com o Coquetel Inibidor de Fosfatase 100x diluído a uma concentração final de 5x.</li>
		<li>Adicione 3 μL de 5x tampão de lise suplementada.</li>
		<li>Incubar por 30 min no RT sob agitação (shaker de placa orbital a 400 rpm). NOTA: O tempo de incubação da lise (30-60 min) pode ser otimizado. As lises podem ser usadas imediatamente ou congeladas a 80 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Detecção de TR-FRET<ol>
<li>Adicione 15 μL de Lysate de Controle Positivo (não diluído) e 15 μL de 1x Tampão de Lise Suplementar (controle negativo) para separar poços de ensaio.</li>
		<li>Adicione 5 μL de mistura de detecção de anticorpos 4x (ou Eu-Ab1/FR-Ab2 para a proteína fosfo ou Eu-Ab3-/FR-Ab4 para a proteína total) preparada em 1x Tampão de Detecção para cada um dos poços de ensaio.</li>
		<li>Cubra a placa com um selador de placas e incubar por 1h até a noite no RT, dependendo do ensaio. NOTA: O tempo ideal de leitura precisa ser otimizado para cada ensaio e linha celular. A placa pode ser lida várias vezes sem um efeito negativo sobre o desempenho do ensaio.</li>
		<li>Remova o selador da placa adesiva. Leia a placa em um leitor de microplacão compatível com TR-FRET.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Análise de dados
<ol><li>Calcule a razão TR-FRET para cada poço usando a seguinte fórmula (1): <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62915/62915eq01.jpg"> (1) NOTA: Como o sinal TR-FRET é lido em um modo resolvido pelo tempo, a subtração de fundo geralmente não é necessária. Se a subtração de fundo for conduzida, use os poços livres de células contendo o 1x Tampão de Lise Suplementar (controle negativo) para subtração de fundo. Determine a relação TR-FRET médio dos poços livres de células e, em seguida, subtraia esse valor da razão TR-FRET de cada poço.</li>
	<li>Para curvas de concentração-resposta, analise os dados de acordo com uma regressão não linear utilizando a equação logística de 4 parâmetros (curva de dose-resposta sigmoidal com inclinação variável) e uma ponderação de dados de 1/Y2 para gerar valores EC50 ou IC50 .</li>
	<li>Para o experimento do fator Z, analise os dados de acordo com a seguinte fórmula (2)10 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62915/62915eq02.jpg"> (2) Quando μ e σ são os valores médios e desvios padrão para o controle positivo (p; células estimuladas) e controle negativo (n; células não tratadas), respectivamente.</li>
</ol>

<ol><li>Villarino, A., Kanno, Y., O'Shea, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+consequences+of+Jak-STAT+signaling+in+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and consequences of Jak-STAT signaling in the immune system.</a> Nature Immunology. 18 (4), 374-384 (2017).</li>
<li>Hammarén, H. M., Virtanen, A. T., Raivola, J., Silvennoinen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+JAKs+in+cytokine+signaling+and+its+breakdown+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">The regulation of JAKs in cytokine signaling and its breakdown in disease.</a> Cytokine. 118, 48-63 (2019).</li>
<li>O'Shea, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+JAK-STAT+pathway%3A+impact+on+human+disease+and+therapeutic+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The JAK-STAT pathway: impact on human disease and therapeutic intervention.</a> Annual Review of Medicine. 66, 311-328 (2015).</li>
<li>Verhoeven, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+potential+and+controversy+of+targeting+STAT+family+members+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">et al. potential and controversy of targeting STAT family members in cancer.</a> Seminars in Cancer Biology. 60 (2), 41-56 (2020).</li>
<li>Gilda, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+blotting+inaccuracies+with+unverified+antibodies%3A+need+for+a+Western+blotting+minimal+reporting+standard+%28WBMRS%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">et al. blotting inaccuracies with unverified antibodies: need for a Western blotting minimal reporting standard (WBMRS).</a> PLoS One. 10 (8), 0135392(2015).</li>
<li>Binder, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+and+utilization+of+the+SureFire+phospho-STAT5+assay+for+a+cell-based+screening+campaign%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">et al. and utilization of the SureFire phospho-STAT5 assay for a cell-based screening campaign.</a> Assay and Drug Development Technologies. 6 (1), 27-37 (2008).</li>
<li>Ayoub, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+time-resolved+fluorescence-based+assay+to+monitor+extracellular+signal-regulated+kinase+signaling+in+a+high-throughput+format%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Homogeneous time-resolved fluorescence-based assay to monitor extracellular signal-regulated kinase signaling in a high-throughput format.</a> Frontiers in Endocrinology. 5, 94(2014).</li>
<li>Robers, M. B., Machleidt, T., Carlson, C. B., Bi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+LanthaScreen+and+beta-lactamase+reporter+assays+for+high-throughput+screening+of+JAK2+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Cellular LanthaScreen and beta-lactamase reporter assays for high-throughput screening of JAK2 inhibitors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 6 (4), 519-529 (2008).</li>
<li>Hwang, B., Engel, L., Goueli, S. A., Zegzouti, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+bioluminescent+immunoassay+to+probe+cellular+signaling+pathway+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Homogeneous bioluminescent immunoassay to probe cellular signaling pathway regulation.</a> Communications Biology. 3 (8), 1-12 (2020).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high-throughput+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high-throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Osmond, R. I. W., Das, S., Crouch, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cell-based+assays+for+cytokine+receptor+signaling%2C+using+an+AlphaScreen+SureFire+assay+format%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Development of cell-based assays for cytokine receptor signaling, using an AlphaScreen SureFire assay format.</a> Analytical Biochemistry. 403 (1-2), 94-101 (2010).</li>
<li>Haan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jak1+has+a+dominant+role+over+Jak3+in+signal+transduction+through+%CE%B3c-containing+cytokine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Jak1 has a dominant role over Jak3 in signal transduction through γc-containing cytokine receptors.</a> Chemistry & Biology. 18 (3), 314-323 (2011).</li>
<li>Kim, Y., Apetri, M., Luo, B., Settleman, J. E., Anderson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+tyrosine+kinase+inhibitors+on+normal+and+oncogenic+EGFR+signaling+and+downstream+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Differential effects of tyrosine kinase inhibitors on normal and oncogenic EGFR signaling and downstream effectors.</a> Molecular Cancer Research. 13 (4), 765-774 (2015).</li>
<li>Qian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+homogeneous+cell-based+kinase+assays+for+JAK2+V617F%3A+SureFire+pSTAT5+and+GeneBLAzer+fluorescence+resonance+energy+transfer+assays%5BTitle%5D)+AND+%22ASSAY+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Comparison of two homogeneous cell-based kinase assays for JAK2 V617F: SureFire pSTAT5 and GeneBLAzer fluorescence resonance energy transfer assays.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 10 (2), 212-217 (2012).</li>
<li>Iversen, P. W., et al. HTS assay validation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIversen%2C+PW+%22Assay+Guidance+Manual%22">Assay Guidance Manual</a>. Markossian, S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2012).</li>
<li>Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+cell+culture+optimization+enhances+experimental+reproducibility+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells.</a> Scientific Reports. 8, 3029(2018).</li>
</ol>

Interesses Concorrentes: Jaime Padros, Mireille Caron e Geneviève Chatel são funcionários da BioAuxilium Research, que fabrica os kits de ensaio THUNDER TR-FRET utilizados neste estudo. Além disso, Jaime Padros e Mireille Caron são acionistas da BioAuxilium Research. Isso não altera a adesão dos autores a todas as políticas do JoVE sobre o compartilhamento de dados e materiais.

Comparado aos métodos convencionais para análise de fosfoproteína, como a mancha ocidental e os métodos baseados em ELISA, o fluxo de trabalho para um ensaio celular THUNDER TR-FRET é simples e rápido, usa uma amostra de baixo volume (15 μL), é projetado para HTS em um formato de 384 poços, e é altamente favorável à automação. O protocolo de ensaio é flexível e pode ser facilmente adaptado a aplicações de médio e alto rendimento. Os ensaios podem ser executados usando um protocolo de transferência de duas placas ou um pr...

A via de sinalização JAK/STAT desempenha um papel fundamental na mediação de respostas celulares a diversas citocinas, interferons, fatores de crescimento e moléculas relacionadas1,2. A ligação desses ligantes a receptores específicos de superfície celular resulta na ativação de JAKs, que por sua vez ativam proteínas STAT por fosforilação de resíduos específicos de tyrosina. A fosforilação STAT resulta em sua dimerização e translocação para o núcleo, onde exercem seu efeito sobre a transcrição de genes-alvo regulados. A família STAT é composta por sete membros: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b e STAT6. Os membros desempenham um papel complexo e essencial na regulação dos processos fisiológicos das células, incluindo proliferação, diferenciação, apoptose, angiogênese e regulação do sistema imunológico. A ativação anormal das vias de sinalização STAT está implicada em muitas doenças humanas, especialmente câncer e condições imunológicas3,4. Portanto, a capacidade de avaliar a fosforilação da proteína STAT dentro do ambiente de sinalização celular nativa é importante tanto para pesquisas acadêmicas quanto de descoberta de drogas.
Até o momento, os métodos convencionais utilizados para medir os níveis de proteína fosfoilada intracelular, incluindo OST, são à base de anticorpos e incluem mancha ocidental, ELISA e citometria fosfoflua. Esses métodos heterogêneos são intensivos em mão-de-obra, demorados, propensos a erros, baixo rendimento e, muitas vezes, não confiáveis (por exemplo, questões de especificidade) no caso de manchas ocidentais5. Em contraste, ensaios homogêneos requerem menos etapas experimentais, usam volumes amostrais menores e são favoráveis ao HTS. Existem cinco plataformas homogêneas de imunoensaio baseadas em células disponíveis comercialmente que podem ser usadas para monitorar quantitativamente a fosforilação dependente de STATs em lises celulares: SureFire, HTRF, LANCE, LanthaScreen e Lumit. Cada uma dessas plataformas tem suas vantagens e desvantagens.
SureFire é baseado na tecnologia luminescente de canalização de oxigênio, que utiliza contas de doadores e aceitadores revestidas para capturar especificamente um par de anticorpos, um dos quais é biotinilado. Na presença de proteína fosfoilada, os dois anticorpos aproximam o doador e o aceitador, permitindo a geração de um sinal quimiomanuminescente6. Embora versátil e sensível, essa tecnologia é cara, é afetada pela biotina no meio da cultura, é muito sensível à temperatura ambiente e à luz, e requer um leitor especial para detecção. HTRF e LANCE são ambos baseados na tecnologia TR-FRET que utiliza complexos de íons de ion de lantano luminescente de longa duração (europium ou terbium chelates, ou criptoato europium) como as moléculas doadoras e fluoroforos distantes como as moléculas aceitadoras7. Quando dois anticorpos específicos de proteína rotulados com moléculas doadoras ou aceitadoras são trazidos para a proximidade, o FRET ocorre, causando um aumento da fluorescência aceitadora e uma diminuição da fluorescência do doador. Esses sinais fluorescentes de longa duração podem ser medidos de forma econômica e racionável para reduzir a interferência de ensaios e aumentar a qualidade dos dados. Outras vantagens do TR-FRET são que ele não é sensível à luz, permite leituras repetidas e exibe estabilidade de sinal longa. Embora o TR-FRET seja amplamente implementado no HTS devido à sua versatilidade, sensibilidade e alta robustez, todas as plataformas comerciais de ensaio baseadas em TR-FRET são caras, impedindo assim sua ampla adoção em laboratórios acadêmicos e pequenos industriais. O ensaio LanthaScreen também usa uma leitura baseada em TR-FRET, mas depende de uma linha celular U2OS projetada que expressa a proteína fluorescente verde (GFP)-STAT1 proteína de fusão combinada com um anticorpo STAT1 phospho-specific phospho-specific. Além de limitado em termos de escolha de proteínas de sinalização, este método requer a compra de linhas celulares transfectadas caras, reduzindo sua aplicabilidade e aumentando a possibilidade de artefatos experimentais. Lumit é uma plataforma genérica de imunoensaio bioluminescente que utiliza anticorpos secundários (anti-rato e anti-coelho) quimicamente rotulados com as pequenas e grandes subunidades NanoBit da NanoLuc Luciferase9. A ligação de dois anticorpos primários à proteína alvo traz os anticorpos secundários à proximidade para formar uma enzima ativa que gera um sinal de luminescência. Embora a luminescência seja geralmente uma leitura sensível e robusta, a exigência de anticorpos primários criados em duas espécies diferentes limita as escolhas para o design do ensaio. Além disso, o uso de anticorpos secundários em matrizes amostrais complexas pode ser propenso a talda interferência.
Assim, ainda existe uma necessidade de uma plataforma de ensaio confiável, rápida, mas acessível baseada em células para medir proteínas STAT fosforiladas individuais e totais de uma maneira compatível com HTS. Para atender a essa necessidade, uma nova plataforma de imunoensaio baseada em células de alto rendimento foi desenvolvida com base em uma tecnologia TR-FRET aprimorada (THUNDER) e projetada para permitir uma medição simples, sensível, robusta e econômica de proteínas intracelulares expressas endógenamente (fosfoiladas ou totais) em lises celulares. As vantagens dessa tecnologia decorrem da combinação de um par FRET doador/aceitor exibindo compatibilidade espectral excepcional e sinal TR-FRET, anticorpos rigorosamente validados e buffers de lise otimizados. Estes ensaios são formatados como imunoensaio sanduiche e usam um fluxo de trabalho simples de três etapas (Figura 1). As células são primeiro tratadas para modular a fosforilação proteica e, em seguida, lysed com o tampão de lise específico fornecido no kit. A proteína STAT fosforilada ou total no liseto celular é detectada em um único passo de adição e incubação de reagentes com um par de anticorpos rotulados por fluoforo que reconhecem epítopos distintos na proteína alvo (Figura 2). Um anticorpo é rotulado com um doador de quelato europium (Eu-Ab1), enquanto o segundo anticorpo é rotulado com um fluoróforo aceitador vermelho distante (FR-Ab2). Os dois anticorpos rotulados se ligam à proteína em solução, aproximando os dois rótulos. A excitação do doador Europium chelate a 320 ou 340 nm desencadeia um FRET para o aceitador, que emite um sinal TR-FRET de longa duração a 665 nm proporcional à concentração de proteína-alvo (fosfoilada ou total) no lysato celular.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62915/62915fig01.jpg"> Figura 1: Fluxo de trabalho de ensaio TR-FRET. O fluxo de trabalho consiste em três etapas: tratamento celular, lise celular e detecção de proteínas utilizando TR-FRET. No protocolo de ensaio de duas placas, os lysates são transferidos para uma placa de detecção branca de 384 poços, enquanto no protocolo de uma placa, todas as etapas são conduzidas na mesma placa branca de detecção de 384 poços (protocolo tudo em um poço). Independentemente do protocolo de ensaio utilizado, a detecção de proteínas é realizada no mesmo volume total (20 μL por poço). Abreviação: TR-FRET = transferência de energia de ressonância Förster resolvida pelo tempo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62915/62915fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62915/62915fig02.jpg"> Figura 2: Princípio de imunoensaio do sanduíche TR-FRET. Um anticorpo é rotulado com o doador de quelato europium (Eu-Ab1) e o segundo com o pequeno aceitador de fluoreóforo (FR-Ab2). Os dois anticorpos rotulados se ligam especificamente a epítopos distintos na proteína alvo (fosforilado ou total) no lysato celular, aproximando os dois fluoroforos. A excitação do doador Europium chelate a 320 ou 340 nm desencadeia um FRET do doador para as moléculas aceitadoras, que por sua vez emitem um sinal a 665 nm. Este sinal é proporcional à concentração de proteína no lisecelular. Na ausência da proteína alvo específica, os fluoroforos doadores e aceitantes estão muito distantes um do outro para que o FRET ocorra. Abreviaturas: FRET = Transferência de energia de ressonância förster; TR-FRET = FRET resolvido pelo tempo; Ab = anticorpo; FR = vermelho distante; Eu - Europium chelate; P = fosforilação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62915/62915fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Aqui, protocolos detalhados são fornecidos para medir, em formato 384-well, os níveis intracelulares de STAT1 (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/Y699) e STAT6 (Y641), juntamente com STAT1 total, STAT3, STAT5 e STAT6, em células de células aderentes ou suspensas usando a plataforma THUNDER TR-FRET. Esses protocolos definem etapas para tratamento celular, lise e detecção de proteína de alvo baseada em TR-FRET usando um protocolo de transferência de duas placas ou um protocolo all-in-one-well. Esses ensaios baseados em células são aplicados para determinar o perfil farmacológico de ativadores e inibidores conhecidos da via JAK/STAT. A robustez e adequação dos ensaios selecionados para HTS são demonstradas. Por fim, são discutidos experimentos-chave para otimização de ensaios, juntamente com recomendações para a solução de problemas de ensaio.

<table><tbody><tr><td>Microplaca de 96 poços, transparente, fundo plano, poliestireno, tratada com cultura de tecidos, estéril</td><td>Corning</td><td>3595</td><td>Esta é a placa para cultura de células ao usar o protocolo de ensaio de duas placas. Outras placas de cultura de células de 96 poços podem ser usadas</td></tr><tr><td>Microplaca de 384 poços, branca, de baixo volume</td><td>PerkinElmer</td><td>6007290</td><td>Esta é a placa para detecção de TR-FRET ao usar os protocolos de ensaio de duas ou uma placa. Outras placas brancas de 384 poços de baixo volume podem ser usadas</td></tr><tr><td>Linha celular A431</td><td>ATCC</td><td>CRL-1555</td><td></td></tr><tr><td>Vedação de microplaca adesiva</td><td>PerkinElmer</td><td>6050185</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher</td><td>D159-4</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s meio Eagle modificado (DMEM)</td> <td>Wisent</td><td>319-005-CL&nbsp;</td><td>THUNDER TR-FRET é compatível com meio de cultura contendo vermelho de fenol</td></tr><tr><td>EnVision Xcite Leitor de placas multirótulo</td><td>PerkinElmer</td><td>2104-0020A</td><td>Os ensaios podem ser realizados em uma variedade de leitores de placas equipados com a opção TR-FRET</td></tr><tr><td>Cloridrato de erlotinibe</td><td>Frascos tratados com</td> cultura de tecidos Sigma <td>CDS022564</td><td></td></tr><tr><td>Falcon</td><td>Fisher</td><td>13-680-65</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal (FBS)</td><td>Wisent</td><td>098-150</td><td></td></tr><tr><td>Linha celular HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>JAK Inibidor 1</td><td>Cayman Chemical</td><td>15146</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de placa orbital</td><td>Muitas opções disponíveis</td><td>Não aplicável</td><td></td></tr><tr><td>EGF humano recombinante</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>IFN&alfa humano recombinante; 2b</td><td>ProSpec</td><td>CYT-460</td><td></td></tr><tr><td>IL-4 humano recombinante</td><td>R& D Systems</td><td>204-IL</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI)</td><td>Wisent</td><td>350-007-CL</td><td>THUNDER TR-FRET é compatível com meio de cultura contendo vermelho de fenol</td></tr><tr><td>THUNDER Phospho-STAT1 (Y701) + Total STAT1 TR-FRET Kit de Ensaio de Sinalização Celular</td><td>BioAuxilium Research</td><td>KIT-STAT1PT-500</td><td></td></tr><tr><td>THUNDER Phospho-STAT3 (Y705) + Total STAT3 Kit de Ensaio de Sinalização Celular</td><td>BioAuxilium Research</td><td>KIT-STAT3PT-500</td><td></td></tr><tr><td>THUNDER Phospho-STAT4 (Y693) Kit de ensaio de sinalização celular TR-FRET</td><td>BioAuxilium Research</td><td>KIT-STAT4P-500</td><td></td></tr><tr><td>THUNDER Phospho-STAT5 (Y694/Y699) + Kit de ensaio de sinalização celular STAT5 TR-FRET total</td><td>BioAuxilium Research</td><td>KIT-STAT5PT-500</td><td></td></tr><tr><td>THUNDER Phospho-STAT6 (Y641) + Kit de ensaio de sinalização celular TR-FRET total STAT6</td><td>BioAuxilium Research</td><td>KIT-STAT6PT-500</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina / EDTA 0,05%</td> <td>Wisent</td><td>325-542-CL</td><td></td></tr><tr><td>U266B1 linha celular</td><td>ATCC</td><td>TIB-196</td><td></td></tr><tr><td>Água ultrapura</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Use água de grau Milli-Q (18 M &Omega;. cm) para diluir o tampão de lise e o tampão de detecção</td></tr></tbody></table>

ensaios de transferência de energia de ressonância de förster para medição de proteínas stat fosforilatos endogensas em células humanas

Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells

O caminho de sinalização Janus kinase (JAK)/sinal e ativador da via de sinalização de transcrição (STAT) desempenha um papel crucial na mediação de respostas celulares às citocinas e fatores de crescimento. As proteínas STAT são ativadas por fosforilação de tirasina mediada principalmente por JAKs. A ativação anormal das vias de sinalização STAT está implicada em muitas doenças humanas, especialmente câncer e condições imunológicas. Portanto, a capacidade de monitorar a fosforilação da proteína STAT dentro do ambiente de sinalização celular nativa é importante tanto para a pesquisa acadêmica quanto para a descoberta de drogas. Os formatos tradicionais de ensaio disponíveis para quantificar proteínas STAT fosforiladas incluem manchas ocidentais e o ensaio imunossorbente ligado à enzima (ELISA). Estes métodos heterogêneos são intensivos em mão-de-obra, de baixa produtividade e, muitas vezes, não são confiáveis (específicos) no caso da mancha ocidental. Métodos homogêneos (sem lavagem) estão disponíveis, mas permanecem caros. 
Aqui, protocolos detalhados são fornecidos para os sensíveis, robustos, e medição econômica em um formato 384-well de níveis endógenos de STAT1 fosforilato (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/Y699) e STAT6 (Y641) em células de células aderentes ou suspensas usando a nova plataforma de transferência de energia de ressonância Förster (TR-FRET) resolvida pelo tempo THUNDER. O fluxo de trabalho para o ensaio celular é simples, rápido e projetado para triagem de alto rendimento (HTS). O protocolo de ensaio é flexível, usa uma amostra de baixo volume (15 μL), requer apenas uma etapa de adição de reagentes e pode ser adaptado a aplicações de baixo rendimento e alto rendimento. Cada imunoensaio sanduíche phospho-STAT é validado em condições otimizadas com agonistas e inibidores conhecidos e gera os valores esperados de farmacologia e fator Z'-factor. Como os ensaios TR-FRET são ratiométricos e não requerem etapas de lavagem, eles fornecem uma reprodutibilidade muito melhor do que as abordagens tradicionais. Juntos, este conjunto de ensaios fornece novas ferramentas econômicas para uma análise mais abrangente das proteínas STAT fosfoiladas específicas após o tratamento celular e a triagem e caracterização de moduladores específicos e seletivos da via de sinalização JAK/STAT.

Cada ensaio THUNDER TR-FRET foi validado farmacologicamente pelo tratamento de células de suspensão (HeLa ou A431) ou células de suspensão (U266B1) com ativadores ou inibidores específicos da via JAK/STAT e, em seguida, medindo os níveis de STATs fosforylatados e totais específicos, quando aplicável. Os ensaios foram realizados em formato de 384 poços utilizando o protocolo de transferência de duas placas e condições de ensaio pré-otimizadas. Figura 3, Figura 4,...

Os protocolos de ensaio baseados em células de ressonância Förster são descritos para a quantificação simples, específica, sensível e robusta do transdutor de sinal endogenso e ativador de transcrição (STAT) 1/3/4/5/6 em lises celulares em um formato de 384 poços.

Ensaios de transferência de energia de ressonância de Förster para medição de proteínas STAT fosforilatos endogensas em células humanas

The Janus kinase (JAK)/signal transducer and activator of transcription (STAT) signaling pathway plays a crucial role in mediating cellular responses to ...

Os ensaios baseados em TR-FRET fornecem novas ferramentas econômicas para a triagem e caracterização farmacológica de moduladores específicos e seletivos das vias de sinalização JAK/STAT. Esta técnica é muito mais fácil, rápida, reproduzível e robusta do que métodos convencionais como a mancha ocidental e a ELISA. Não são necessárias etapas de lavagem e os reagentes são adicionados em uma única etapa.Esta plataforma de imunoensaio pode ser facilmente aplicada a outras proteínas de sinalização celular, desde que anticorpos específicos estejam disponíveis. Para projetar ensaios reprodutíveis, você deve usar boas práticas de cultura celular e estabelecer procedimentos operacionais padrão. Além disso, você deve otimizar cuidadosamente a cultura celular e as condições de tratamento.Demonstrando o procedimento estará Genevieve Chatel, uma cientista do nosso laboratório. Para começar, cultura HeLa e células A431 em uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono usando DMEM suplementada com 10% de FBS. Quando as células atingem 70 a 80% de confluência, tente-as e seja para passar ou usá-las para ensaios.Para realizar o ensaio, dispense 50 microliters de células n

time-resolved-frster-resonance-energy-transfer-assays-for-measurement

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

FRET baseado jornalistas estão cada vez mais utilizados para monitorar atividades quinase e fosfatase em células vivas. Aqui nós descrevemos um método de como usar FRET baseado jornalistas para avaliar o ciclo de dependentes de células alterações na fosforilação alvo.

Atividades de monitoramento quinases e fosfatases através do ciclo celular por raciométrica FRET

Um novo método que envolve a análise quantitativa de FRET (Förster Resonance Energy Transfer) sinais é descrito para o estudo de cinética enzimática.

Quantitativa FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Análise para SENP1 Determinação Cinética Protease

Este vídeo descreve a transferência de energia de ressonância de Förster resolvida no tempo ou ensaio TR-FRET para determinar a fosforilação de proteínas endógenas com a ajuda de fluoróforos doadores e aceptores marcados em anticorpos específicos para uma proteína de teste. Esta técnica é projetada para medir a fosforilação de proteínas de teste em lisados celulares.

Transferência de energia de ressonância de Forster resolvida no tempo para monitorar a fosforilação de proteínas em células

Leucina repetição rica quinases 1 e 2 (e LRRK1 LRRK2) são proteínas de vários domínios que codificam tanto GTPase e domínios cinase e que são fosforiladas em células. Aqui, apresentamos um protocolo para rotular LRRK1 e LRRK2 em células com 32 P-ortofosfato, proporcionando assim um meio para medir seus níveis gerais de fosforilação celular.

Metabólica Rotulagem de Leucina rico Repita Kinases 1 e 2 com Radioactive Fosfato

Termoforese microescala (MST) pode ser amplamente utilizado para a determinação da afinidade de ligação sem purificação da proteína alvo a partir de lisados ​​celulares. O protocolo envolve a sobre-expressão da proteína GFP fundida, a lise das células em condições não desnaturantes, e detecção de sinal MST na presença de várias concentrações do ligando.

Método de purificação de proteína livre de Determinação Affinity Binding por termoforese Microscale

Aqui descrevemos um procedimento que permite uma análise detalhada da ativação dependente de fosforilação do fator de transcrição IRF3. Isso é obtido por meio da combinação de um SDS-PAGE de alta resolução e um PAGE nativo acoplado a immunoblots usando vários anticorpos fosfoespecíficos.

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As cinases de proteínas são altamente evoluídas sinalizando enzimas e andaimes que são críticos para a transdução de sinal inter e intracelular. Nós apresentamos um protocolo para medir a atividade de quinase através do uso de adenosina trifosfato radiomarcado ([γ- 32 P] ATP), um método confiável para auxiliar na elucidação da regulação da sinalização celular.

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Aprenda a quantificar proteínas STAT fosforiladas endógenas em lisados celulares usando ensaios TR-FRET em formato de 384 poços. Este método oferece uma alternativa rápida, reprodutível e sem etapas de lavagem aos métodos convencionais como Western blot e ELISA.

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