Name: Atividade de rede de gravação em circuitos nociceptivos da coluna vertebral usando matrizes de microeletrodos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Aprenda a registrar atividade de rede em circuitos nociceptivos da coluna vertebral usando matrizes de microeletrodos em fatias de medula de camundongo. Este método permite analisar processamento sensorial espinhal e triagem de compostos antinociceptivos.

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Este trabalho foi financiado pelo National Health and Medical Research Council (NHMRC) da Austrália (bolsas 631000, 1043933, 1144638 e 1184974 para B.A.G. e R.J.C.) e o Hunter Medical Research Institute (bolsa para B.A.G. e R.J.C.).

<ol><li>Smith, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calretinin+positive+neurons+form+an+excitatory+amplifier+network+in+the+spinal+cord+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Calretinin positive neurons form an excitatory amplifier network in the spinal cord dorsal horn.</a> eLife. 8, 49190(2019).</li>
<li>Smith, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+calretinin-expressing+neurons+in+the+mouse+superficial+dorsal+horn%3A+implications+for+spinal+pain+processing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of calretinin-expressing neurons in the mouse superficial dorsal horn: implications for spinal pain processing.</a> The Journal of physiology. 593 (19), 4319-4339 (2015).</li>
<li>Boyle, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+a+spinal+microcircuit+that+gates+myelinated+afferent+input%3A+Implications+for+tactile+allodynia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Defining a spinal microcircuit that gates myelinated afferent input: Implications for tactile allodynia.</a> Cell Reports. 28 (2), 526-540 (2019).</li>
<li>Browne, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+cross-referencing+of+inhibitory+and+excitatory+interneuron+populations+to+dissect+neuronal+heterogeneity+in+the+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transgenic cross-referencing of inhibitory and excitatory interneuron populations to dissect neuronal heterogeneity in the dorsal horn.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 32(2020).</li>
<li>Graham, B. A., Hughes, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rewards%2C+perils+and+pitfalls+of+untangling+spinal+pain+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rewards, perils and pitfalls of untangling spinal pain circuits.</a> Current Opinion in Physiology. 11, 35-41 (2019).</li>
<li>Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+circuitry+for+pain+processing+in+the+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).</li>
<li>Hughes, D. I., Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+targets%3A+inhibitory+interneurons+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Central nervous system targets: inhibitory interneurons in the spinal cord.</a> Neurotherapeutics. 17 (3), 874-885 (2020).</li>
<li>Duan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+spinal+circuits+transmitting+and+gating+mechanical+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain.</a> Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).</li>
<li>Hachisuka, J., Chiang, M. C., Ross, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Itch+and+neuropathis+itch%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Itch and neuropathis itch.</a> Pain. 159 (3), 603(2018).</li>
<li>Foster, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+ablation%2C+silencing%2C+and+activation+establish+glycinergic+dorsal+horn+neurons+as+key+components+of+a+spinal+gate+for+pain+and+itch%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch.</a> Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).</li>
<li>Bourane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+spinal+circuit+for+light+touch+and+fine+motor+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control.</a> Cell. 160 (3), 503-515 (2015).</li>
<li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+spinal+circuits+involved+in+touch-evoked+dynamic+mechanical+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification of spinal circuits involved in touch-evoked dynamic mechanical pain.</a> Nature neuroscience. 20 (6), 804-814 (2017).</li>
<li>Peirs, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+allodynia+circuitry+in+the+dorsal+horn+is+defined+by+the+nature+of+the+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mechanical allodynia circuitry in the dorsal horn is defined by the nature of the injury.</a> Neuron. 109 (1), 73-90 (2021).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuit+dissection+of+the+role+of+somatostatin+in+itch+and+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Circuit dissection of the role of somatostatin in itch and pain.</a> Nature Neuroscience. 21 (5), 707-716 (2018).</li>
<li>Obien, M. E. J., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+neuronal+function+through+microelectrode+array+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Revealing neuronal function through microelectrode array recordings.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 423(2015).</li>
<li>Nam, Y., Wheeler, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+microelectrode+array+technology+and+neural+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">In vitro microelectrode array technology and neural recordings.</a> Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).</li>
<li>Johnstone, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrode+arrays%3A+a+physiologically+based+neurotoxicity+testing+platform+for+the+21st+century%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Microelectrode arrays: a physiologically based neurotoxicity testing platform for the 21st century.</a> Neurotoxicology. 31 (4), 331-350 (2010).</li>
<li>Stett, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+application+of+microelectrode+arrays+in+drug+discovery+and+basic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Biological application of microelectrode arrays in drug discovery and basic research.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 377 (3), 486-495 (2003).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+and+recent+development+of+the+microelectrode+arrays+%28MEAs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Trends and recent development of the microelectrode arrays (MEAs).</a> Biosensors and Bioelectronics. 175 (1), 112854(2020).</li>
<li>Chapman, R. J., Cilia La Corte, P. F., Asghar, A. U. R., King, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network-based+activity+induced+by+4-aminopyridine+in+rat+dorsal+horn+in+vitro+is+mediated+by+both+chemical+and+electrical+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Network-based activity induced by 4-aminopyridine in rat dorsal horn in vitro is mediated by both chemical and electrical synapses.</a> The Journal of Physiology. 587, Pt 11 2499-2510 (2009).</li>
<li>Ruscheweyh, R., Sandkühler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epileptiform+activity+in+rat+spinal+dorsal+horn+in+vitro+has+common+features+with+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Epileptiform activity in rat spinal dorsal horn in vitro has common features with neuropathic pain.</a> Pain. 105 (1-2), 327-338 (2003).</li>
<li>Kay, C. W., Ursu, D., Sher, E., King, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Cx36+and+Cx43+in+4-aminopyridine-induced+rhythmic+activity+in+the+spinal+nociceptive+dorsal+horn%3A+an+electrophysiological+study+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">The role of Cx36 and Cx43 in 4-aminopyridine-induced rhythmic activity in the spinal nociceptive dorsal horn: an electrophysiological study in vitro.</a> Physiological Reports. 4 (14), 12852(2016).</li>
<li>Jankowska, E., Lundberg, A., Rudomin, P., Sykova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+4-aminopyridine+on+synaptic+transmission+in+the+cat+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of 4-aminopyridine on synaptic transmission in the cat spinal cord.</a> Brain Research. 240 (1), 117-129 (1982).</li>
<li>Semba, K., Geller, H. M., Egger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Aminopyridine+induces+expansion+of+cutaneous+receptive+fields+of+dorsal+horn+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">4-Aminopyridine induces expansion of cutaneous receptive fields of dorsal horn cells.</a> Brain Research. 343 (2), 398-402 (1985).</li>
<li>Ruscheweyh, R., Sandkühler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+oscillatory+Ca2%2B+waves+in+rat+spinal+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Long-range oscillatory Ca2+ waves in rat spinal dorsal horn.</a> European Journal of Neuroscience. 22 (8), 1967-1976 (2005).</li>
<li>Egert, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+organotypic+long-term+culture+of+the+rat+hippocampus+on+substrate-integrated+multielectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">A novel organotypic long-term culture of the rat hippocampus on substrate-integrated multielectrode arrays.</a> Brain Research Protocols. 2 (4), 229-242 (1998).</li>
<li>Thiebaud, P., De Rooij, N., Koudelka-Hep, M., Stoppini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrode+arrays+for+electrophysiological+monitoring+of+hippocampal+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Microelectrode arrays for electrophysiological monitoring of hippocampal organotypic slice cultures.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 44 (11), 1159-1163 (1997).</li>
<li>Rey, H. G., Pedreira, C., Quiroga, R. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Past%2C+present+and+future+of+spike+sorting+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Past, present and future of spike sorting techniques.</a> Brain Research Bulletin. 119, 106-117 (2015).</li>
<li>Satuvuori, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measures+of+spike+train+synchrony+for+data+with+multiple+time+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Measures of spike train synchrony for data with multiple time scales.</a> Journal of Neuroscience Methods. 287, 25-38 (2017).</li>
<li>Mendis, G. D. C., Morrisroe, E., Reid, C. A., Halgamuge, S. K., Petrou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+local+field+potentials+of+dissociated+cultures+grown+on+multi-electrode+arrays+for+pharmacological+assays%5BTitle%5D)+AND+%2238th+Annual+International+Conference+of+the+IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Society%22%5BJournal%5D)">Use of local field potentials of dissociated cultures grown on multi-electrode arrays for pharmacological assays.</a> 38th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 952-956 (2016).</li>
<li>Hughes, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological%2C+neurochemical+and+electrophysiological+features+of+parvalbumin-expressing+cells%3A+a+likely+source+of+axo-axonic+inputs+in+the+mouse+spinal+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Morphological, neurochemical and electrophysiological features of parvalbumin-expressing cells: a likely source of axo-axonic inputs in the mouse spinal dorsal horn.</a> The Journal of Physiology. 590 (16), 3927-3951 (2012).</li>
<li>Peirs, C., Seal, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuits+for+pain%3A+recent+advances+and+current+views%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neural circuits for pain: recent advances and current views.</a> Science. 354 (6312), 578-584 (2016).</li>
<li>Li, J., Baccei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+membrane+excitability+in+rat+spinal+lamina+I+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of membrane excitability in rat spinal lamina I projection neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 107 (10), 2604-2614 (2012).</li>
<li>Li, J., Baccei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pacemaker+neurons+within+newborn+spinal+pain+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pacemaker neurons within newborn spinal pain circuits.</a> Journal of Neuroscience. 31 (24), 9010-9022 (2011).</li>
<li>Sandkühler, J., Eblen-Zajjur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+rhythmic+nociceptive+and+non-nociceptive+spinal+dorsal+horn+neurons+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of rhythmic nociceptive and non-nociceptive spinal dorsal horn neurons in the rat.</a> Neuroscience. 61 (4), 991-1006 (1994).</li>
<li>Lucas-Romero, J., Rivera-Arconada, I., Roza, C., Lopez-Garcia, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+classification+of+spontaneous+discharges+in+mouse+superficial+dorsal+horn+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Origin and classification of spontaneous discharges in mouse superficial dorsal horn neurons.</a> Scientific Reports. 8 (1), 9735-9735 (2018).</li>
<li>Antonio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L.+al.+In+vitro+seizure+like+events+and+changes+in+ionic+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">L. al. In vitro seizure like events and changes in ionic concentration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 260, 33-44 (2016).</li>
<li>Avoli, M., Jefferys, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+drug-induced+epileptiform+synchronization+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Models of drug-induced epileptiform synchronization in vitro.</a> Journal of Neuroscience Methods. 260, 26-32 (2016).</li>
<li>Taccola, G., Nistri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+micromolar+concentrations+of+4-aminopyridine+facilitate+fictive+locomotion+expressed+by+the+rat+spinal+cord+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Low micromolar concentrations of 4-aminopyridine facilitate fictive locomotion expressed by the rat spinal cord in vitro.</a> Neuroscience. 126 (2), 511-520 (2004).</li>
<li>Mitra, P., Brownstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+spinal+cord+slice+preparation+for+recording+from+lumbar+motoneurons+of+the+adult+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse.</a> Journal of Neurophysiology. 107 (2), 728-741 (2012).</li>
<li>Egert, U., Heck, D., Aertsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+monitoring+of+spiking+networks+in+acute+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional monitoring of spiking networks in acute brain slices.</a> Experimental Brain Research. 142 (2), 268-274 (2002).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.

Apesar da importância da DH espinhal na sinalização nociceptiva, no processamento e nas respostas comportamentais e emocionais resultantes que caracterizam a dor, os circuitos nessa região permanecem mal compreendidos. Um dos principais desafios na investigação desta questão tem sido a diversidade de populações de neurônios que compõem esses circuitos 6,31,32. Os recentes avanços nas tecnologias transgênicas, liderados pela opto...

Os papéis de tipos específicos de interneurônios inibitórios e excitatórios dentro da DH medula espinhal estão sendo descobertos a uma velocidade rápidade 1,2,3,4. Juntos, os interneurônios compõem mais de 95% dos neurônios no DH e estão envolvidos no processamento sensorial, incluindo a nocicepção. Além disso, esses circuitos interneurônios são importantes para determinar se os sinais periféricos ascendem ao neuroaxis para atingir o cérebro e contribuem para a percepção da dor 5,6,7. Até o momento, a maioria dos estudos investigou o papel dos neurônios DH no nível de análise unicelular ou organismo inteiro usando combinações de eletrofisiologia intracelular in vitro, rotulagem neuroanatomética e análise comportamental in vivo 1,3,8,9,10,11,12,13,14 . Essas abordagens avançaram significativamente na compreensão do papel das populações específicas de neurônios no processamento da dor. No entanto, permanece uma lacuna na compreensão de como tipos celulares específicos e pequenos macro-circuitos influenciam grandes populações de neurônios em um nível de microcircuito para posteriormente moldar a saída do DH, respostas comportamentais e a experiência de dor.
Uma tecnologia que pode investigar a função de macro-circuito ou nível multicelular é a matriz de microeletrodos (MEA)15,16. Os MEAs têm sido usados para investigar a função do sistema nervoso por várias décadas17,18. No cérebro, eles facilitaram o estudo do desenvolvimento neuronal, plasticidade sináptica, triagem farmacológica e teste de toxicidade17,18. Eles podem ser usados tanto para aplicações in vitro quanto in vivo, dependendo do tipo de MEA. Além disso, o desenvolvimento de MEAs evoluiu rapidamente, com diferentes números de eletrodos e configurações agora disponíveis19. Uma vantagem fundamental dos MEAs é sua capacidade de avaliar simultaneamente a atividade elétrica em muitos neurônios com alta precisão espacial e temporal através de múltiplos eletrodos15,16. Isso fornece uma leitura mais ampla de como os neurônios interagem em circuitos e redes, sob condições de controle e na presença de compostos aplicados localmente.
Um desafio das preparações in vitro de DH é que os níveis de atividade contínuos são tipicamente baixos. Aqui, este desafio é abordado em circuitos DH da medula espinhal usando o bloqueador de canal K+ com espaço de tensão, 4-aminopryidina (4-AP), para estimular quimicamente circuitos DH. Esta droga tem sido usada anteriormente para estabelecer atividade elétrica síncronica rítmica no DH de fatias agudas da medula espinhal e sob condições in vivo agudas 20,21,22,23,24. Esses experimentos utilizaram patch unicelular e gravação extracelular ou imagem de cálcio para caracterizar atividade induzida por 4-AP 20,21,22,23,24,25. Juntos, este trabalho demonstrou a exigência de transmissão sináptica excitatória e inibitória e sinapses elétricas para atividade rítmica induzida por 4-AP. Assim, a resposta 4-AP tem sido vista como uma abordagem que desmascara circuitos de DH polissinápticos nativos com relevância biológica e não como um epifenomenon induzido por drogas. Além disso, a atividade induzida por 4-AP exibe um perfil de resposta semelhante às drogas analgésicas e antiepilépticas como condições de dor neuropática e tem sido usada para propor novos alvos de drogas analgésicas de base espinhal, como connexins 20,21,22.
Aqui, é descrita uma preparação que combina MEAs e ativação química do DH espinhal com 4-AP para estudar este circuito nociceptivo no macro-circuito, ou nível de rede de análise. Esta abordagem fornece uma plataforma estável e reprodutível para investigar circuitos nociceptivos sob condições ingênuas e neuropáticas "semelhantes à dor". Esta preparação também é prontamente aplicável para testar a ação em nível de circuito de analgésicos conhecidos e para exibir novos analgésicos na medula espinhal hiperativa.

<table><tbody><tr><td>4-aminopiridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>275875-5G</td><td></td></tr><tr><td>100% etanol</td><td>Thermo Fisher</td><td>AJA214-2.5LPL</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 1M</td><td>Banksia Scientific</td><td>0430/1L</td><td></td></tr><tr><td>Carbonox (Carbogen - 95% O2, 5% CO2)</td><td>Coregas</td><td>219122</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de mola de cabo longo curvo</td><td>Fine Science Tools</td><td>15015-11</td><td></td></tr><tr>Câmara <td></td><td></td><td></td><td>de incubação de interface de ar personalizada</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Thermo Fisher</td><td>10091130</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Thermo Fisher</td><td>AJA783-500G</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cavalo</td><td>Thermo Fisher</td><td>16050130</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert10</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Thermo Fisher</td><td>AJA383-500G</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina</td><td>Ceva</td><td>KETALAB04</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica grande</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>14007-14</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 454 Parafusos Adesivos</td><td>Instantâneos e Suprimentos Industriais</td><td>L4543G</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td>R2018b</td></tr><tr><td>MEAs,</td><td>Sistemas Multicanais</td> Tridimensionais <td>60-3DMEA100/12/40iR-Ti, 60-3DMEA200/12/50iR-Ti</td><td>60 eletrodos de nitreto de titânio (TiN) com 1 eletrodo de referência interno, organizados em uma grade quadrada de 8x8. Os eletrodos são 12 &micro; m de diâmetro, 40 &micro; m (100/12/40) ou 50 &micro; m (200/12/50) de altura e equidistantemente espaçado 100 &micro; m (100/12/40) ou 200 &micro; m (200/12/50) de distância.</td></tr><tr><td>MEA headstage</td><td>Sistemas multicanais</td><td>MEA2100-HS60</td><td></td></tr><tr><td>Placa de interface MEA</td><td>Sistemas multicanais</td><td>MCS-IFB 3.0 Rede MEA Multiboot</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sistemas multicanais</td><td>ALA HSG-MEA-5BD</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de perfusão MEA</td><td>Sistemas multicanais</td><td>PPS2</td><td></td></tr><tr><td>MEAs,</td><td>Sistemas multicanais</td> planares <td>60MEA200/30iR-Ti, 60MEA500/30iR-Ti</td><td>60 eléctrodos de nitreto de titânio (TiN) com 1 eléctrodo de referência interno, organizados numa grelha quadrada de 8x8 (200/30) ou numa grelha rectangular de 6x10 (500/30). Os eletrodos são 30 &micro; m de diâmetro e equidistantemente espaçado 200 &micro; m (200/30) ou 500 &micro; m (500/30) de distância.</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Thermo Fisher</td><td>AJA296-500G</td><td></td></tr><tr><td>Câmera para microscópio</td><td>Motic</td><td>Moticam X Wi-Fi</td><td></td></tr><tr><td>Multi Channel Analyser software</td><td>Multichannel Systems</td><td></td><td>V 2.17.4</td></tr><tr><td>Multi Channel Experimenter software</td><td>Multichannel Systems</td><td></td><td>V 2.17.4</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher</td><td>AJA465-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Thermo Fisher</td><td>AJA475-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Thermo Fisher</td><td>ACR207805000</td><td></td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>16021-14</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de mola pequena</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica pequena</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Sucarose</td><td>Thermo Fisher</td><td>AJA530-500G</td><td></td></tr><tr><td>Supercola</td><td></td><td></td><td>adesivo de cianoacrilato</td></tr><tr><td>Tetrodotoxina</td><td>Abcam</td><td>AB120055</td><td></td></tr><tr><td>Mesa de isolamento de vibração</td><td>Newport</td><td>VH3048W-OPT</td><td></td></tr><tr><td>micrótomo vibratório</td><td>Leica</td><td>VT1200 S</td><td></td></tr></tbody></table>

atividade de rede de gravação em circuitos nociceptivos da coluna vertebral usando matrizes de microeletrodos

Recording Network Activity in Spinal Nociceptive Circuits Using Microelectrode Arrays

As funções e a conectividade de tipos específicos de neurônios dentro do chifre dorsal da medula espinhal (DH) estão sendo delineados em uma velocidade rápida para fornecer uma visão cada vez mais detalhada dos circuitos que sustentam o processamento da dor na coluna vertebral. No entanto, os efeitos dessas conexões para uma atividade de rede mais ampla no DH permanecem menos bem compreendidos porque a maioria dos estudos se concentra na atividade de neurônios únicos e microcircuitos pequenos. Alternativamente, o uso de matrizes de microeletrodos (MEAs), que podem monitorar a atividade elétrica em muitas células, proporciona alta resolução espacial e temporal da atividade neural. Aqui, descreve-se o uso de MEAs com fatias de medula espinhal de camundongos para estudar a atividade de DH induzida por circuitos dh quimicamente estimulantes com 4-aminopirridina (4-AP). A atividade rítmica resultante é restrita ao DH superficial, estável ao longo do tempo, bloqueada por tetrodotoxina, e pode ser investigada em diferentes orientações de fatias. Em conjunto, esta preparação fornece uma plataforma para investigar a atividade do circuito de DH em tecidos de animais ingênuos, modelos animais de dor crônica e camundongos com função nociceptiva geneticamente alterada. Além disso, gravações de MEA em fatias de medula espinhal estimuladas por 4-AP podem ser usadas como uma ferramenta de triagem rápida para avaliar a capacidade de novos compostos antinociceptivos para interromper a atividade na DH medular.

Modelo de atividade de rede no chifre dorsal da medula espinhal A aplicação de 4-AP induz de forma confiável a atividade rítmica síncronica na medula espinhal DH. Tal atividade apresenta-se como aumento de EAPs e LFPs. O sinal posterior é uma forma de onda de baixa frequência, que já foi descrita nas gravações do MEA30. Alterações na atividade EAP e/ou LFP após a aplicação da droga refletem a atividade neural alterada. Exemplos de EAPs e LFPs são mostrados na <strong class="xfi...

O uso combinado da tecnologia de matriz de microeletrodos e estimulação química induzida por 4 aminopirdina para investigar a atividade nociceptiva em nível de rede no chifre dorsal da medula espinhal é delineado.

Atividade de rede de gravação em circuitos nociceptivos da coluna vertebral usando matrizes de microeletrodos

The roles and connectivity of specific types of neurons within the spinal cord dorsal horn (DH) are being delineated at a rapid rate to provide an ...

A preparação da fatia espinhal MEA 4-AP descrita para você fornece uma plataforma para estudar a conectividade dos circuitos de chifre dorsal e como essas redes interagem durante o processamento sensorial espinhal. A metodologia apresentada permite que a atividade do circuito de chifres dorsais seja investigada em nível regional macroscópico de resolução. Esta preparação pode ser usada como uma ferramenta de triagem rápida para avaliar a capacidade dos compostos de interromper a sinalização em circuitos sensoriais espinhais.Este método ajuda a preencher a lacuna em nossa compreensão de como a atividade de tipos celulares específicos e pequenos micro circuitos influenciam grandes populações de neurônios para posteriormente moldar a saída das respostas de comportamento do chifre dorsal e, em última instância, a experiência de dor. Para começar, encha bem o MEA com soro de cavalo por 30 minutos. Depois de remover o soro, enxágue completamente o MEA cinco vezes com água destilada até que a água destilada se torne não espuma.Em seguida, encha o poço com CSF artificial. Depois de decapitar o camundongo anestesiado, remova a pele sobre a região abdominal fazendo um pequeno corte na pele ao nível dos quadris. Em seguida, puxe a pele em ambos os lados do corte rostrally até que toda a pele seja removida do topo da caixa torácica até o topo da pelve, tanto ventricamente quanto dorsalmente.Depois de colocar o corpo no gelo, use uma abordagem ventral para expor a coluna vertebral removendo as vísceras e cortando as costelas lateralmente para o esterno. Remova a caixa torácica ventral, tanto escápula, quanto os membros inferiores e pélvis. Transfira a coluna vertebral e a preparação da costela para um banho dissecando contendo csf artificial de sacarose gelada.Fixar todos os quatro cantos da preparação colocando pinos através dos músculos inferiores das costas e das costelas superiores presas. Remova todo o músculo e tecido conjuntivo sobre a superfície ventral das vértebras com os rongeurs e identifique a região vertebral sobre o alargamento lumbo-sacral, que fica aproximadamente abaixo dos corpos vertebrais T12-L2. Remova um corpo vertebral caudal para a região de alargamento lumbo-sacral para acessar a medula espinhal sentada no canal vertebral.Usando uma tesoura de mola curva, corte os pedículos vertebrais bilateralmente enquanto levanta e puxa o corpo vertebral rostrally para separar os aspectos ventral e dorsal das vértebras e expor a medula espinhal. Uma vez que os corpos vertebrais são removidos para revelar o alargamento lumbo-sacral, limpe cuidadosamente as raízes restantes que ancoram a medula espinhal com tesouras de mola até que a cordel flutue livremente. Isole a medula espinhal com cortes rostrais e caudais acima e abaixo do alargamento lumbo-sacral para tornar a região alvo do cordão livre.Para fatias transversais, levante e coloque o segmento lumbo-sacral por uma rota anexada em um bloco de poliestireno pré-cortado com um canal raso cortado no centro. Em seguida, use o adesivo de cianoacrilato para anexar o bloco e o cabo à plataforma de seção e colocá-lo no banho de corte contendo sacarose gelada artificial CSF. Uma vez obtidas as fatias de 300 micrômetros de espessura, transfira as fatias para uma câmara de incubação de interface de ar contendo CSF artificial oxigenado e permita que as fatias se equilibrem por uma hora à temperatura ambiente.Para começar a registrar a atividade do chifre dorsal, transfira a fatia da incubadora para o poço MEA usando uma pipeta pasteur de ponta grande recheada com CSF artificial e adicione CSF artificial adicional. Use uma escova de tinta de cabelo fina e curta para posicionar a fatia sobre a matriz de gravação de 60 eletrodos. Em seguida, coloque um pescoço ponderado sobre o tecido para mantê-lo no lugar e promover um bom contato com eletrodos MEA.Coloque o MEA no estágio da cabeça de gravação. Verifique a posição do tecido sobre os eletrodos usando um microscópio invertido para confirmar que o maior número possível de eletrodos estão sob o DH superficial. Certifique-se de que pelo menos dois a seis eletrodos não entrem em contato com a fatia. Depois de conectar a câmera ao dispositivo, leve uma imagem de referência da fatia em relação ao MEA para uso durante a análise.Em seguida, pressione iniciar o DAQ no software de gravação e confirme que todos os eletrodos recebem um sinal claro. Em seguida, conecte as linhas de entrada e saída de perfusão ao MEA bem preenchido com CSF artificial e ligue o sistema de perfusão. Verifique a vazão e certifique-se de que a vazão é suficiente para evitar o estouro do superfusato.Depois de equilibrar o tecido por cinco minutos, registo os dados da linha de base bruta por cinco minutos. Mova a linha de entrada de perfusão de CSF artificial para uma solução de 4 aminopirridina e espere 12 minutos para que a atividade rítmica induzida por 4 aminopirdinase alcance um estado estável. Em seguida, grave cinco minutos de atividade induzida por 4 aminopirida e esteja preparado para as gravações subsequentes para testar as drogas ou verificar a estabilidade de 4-aminopirida.Após cada sessão de gravação, enxágue as linhas com CSF artificial. Depois de remover o MEA da etapa da cabeça e remover bem a rede e o tecido do MEA, enxágue o MEA e a rede com CSF artificial e repita todo o processo com uma nova fatia. Abra o software de análise e carregue o layout de análise pré-feito.Abra o arquivo de interesse e desmarque o eletrodo de referência e quaisquer eletrodos considerados excessivamente barulhentos. Defina a janela de tempo para análise. Em seguida, mova-se para a guia do filtro do canal cruzado.Selecione os eletrodos de referência e referência complexos com base na imagem tirada e nas notas feitas durante o experimento e pressione Explorar antes de continuar. Mova-se para a guia do filtro EAP e aplique um filtro Butterworth de segunda ordem para remover a atividade LFP. Mova-se para a guia do filtro LFP e aplique um filtro butterworth de segunda ordem para remover a atividade EAP.Na guia detector EAP, certifique-se de selecionar o limiar automático, marque as caixas de borda subindo e caindo e defina o tempo morto para três milissegundos. Para definir limiares positivos e negativos, inspecione os dados retornando à tela do analisador de dados bruto, movendo o marcador de tempo, retornando à guia do detector EAP e pressionando a exploração. Repita o processo até que o limiar de detecção definido capture EAPs sem capturar ruídos ou atividades não fisiológicas.Na guia do detector LFP, certifique-se de selecionar o limiar manual, marque as caixas de borda subindo e caindo e ajuste o tempo morto para três milissegundos. Defina o limiar para um eletrodo e, uma vez satisfeito, selecione aplicar a todos e, em seguida, pressione a análise de início. A aplicação do banho da tetrodotoxina antagonista do canal de sódio fechada de tensão aboliu tanto a atividade EAP quanto a LFP, confirmando a dependência do pico desses sinais.A estabilidade dos parâmetros de atividade induzidos por 4 aminopirdina foi caracterizada para EAP ou LFP. Todas as características de atividade mais a coincidência de atividade para LFPs foram estáveis com base na similaridade da atividade induzida por 4 aminopirida em 12 minutos após a aplicação de 4-aminopirida e 15 minutos depois. Os EAPs ou LFPs do recurso foram caracterizados por um aumento no número de eventos coincidentes detectados em vários eletrodos.O número de eletrodos adjacentes ligados, e a força das ligações entre eletrodos adjacentes e LFPs após a estimulação de 4 aminopirida e, em seguida, relativa estabilidade. A orientação da fatia é uma consideração importante para os preparativos in vitro. A estimulação de 4-aminopirida induziu uma atividade rítmica semelhante no SDH, independentemente da orientação da fatia.Finalmente, para esclarecer ainda mais a relevância da ativação de 4-aminopirridina das redes DH, uma solução de CSF artificial de potássio elevada foi aplicada e mostrou-se evocar uma resposta DH semelhante à estimulação de 4 aminopirida. Os principais passos do protocolo estão na preparação e colocação de tecidos das seções, garantindo que o tecido seja saudável através de dissecção cuidadosa, mas oportuna, bem como o posicionamento ideal delicado do tecido no MEA ajudará na obtenção de resultados de qualidade.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

O vídeo demonstra como usar um arranjo de microeletrodos (MEA) para registrar a atividade eletrofisiológica de neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs). A atividade eletrofisiológica de um MEA multipoço contendo uma co-cultura neurônio-astrócitos é registrada para detectar potenciais de ação de vários neurônios na rede, confirmando a diferenciação bem-sucedida de hiPSCs em neurônios.

Medindo a atividade eletrofisiológica de redes neuronais usando matrizes de microeletrodos

Este vídeo demonstra o registro da atividade neural espontânea e dependente de estimulação de culturas primárias de neurônios ganglionares espirais murinos (SGN) em uma matriz de múltiplos eletrodos (MEA). Envolve lavar e preparar o MEA, registrar a atividade neural espontânea e aplicar estímulos elétricos controlados para identificar a atividade neuronal dependente de estimulação.

Analisando a atividade neural em neurônios ganglionares espirais murinos primários usando matrizes de multieletrodos

Este vídeo descreve o registro intracelular in vivo de motoneurônios de ratos sob estimulação transespinhal por corrente contínua. O protocolo descreve como medir as propriedades da membrana e registrar o disparo rítmico de motoneurônios antes, durante e após a polarização anódica ou catódica da medula espinhal.

Estimulação transespinhal por corrente contínua do motoneurônio espinhal de um rato

Este vídeo demonstra um ensaio baseado em matriz de microeletrodos para estudar a atividade da rede neuronal em seções da medula espinhal de camundongos. Primeiro, a atividade eletrofisiológica do corno dorsal superficial (SDH) do corte é registrada. Em seguida, um inibidor do canal de potássio é introduzido para prolongar a despolarização, resultando em atividade rítmica síncrona em toda a rede neuronal.

Avaliação baseada em matriz de microeletrodos de redes neuronais em fatias da medula espinhal de camundongos

Este vídeo demonstra uma gravação de fibra única da condução nervosa da fibra C em ratos. Um rato anestesiado é incisado para expor o nervo ciático, que fornece suprimento sensorial e motor aos membros inferiores. As fibras C individuais são então expostas. A estimulação elétrica é fornecida usando eletrodos de estímulo implantados no pé e uma resposta é registrada a partir de uma única fibra nervosa.

Registro in vivo de fibras C do nervo ciático em ratos

Ilustramos como executar gravação e elétrica de modulação da atividade epileptiforme 4-aminopiridina-induzida em fatias de cérebro de roedor usando matrizes de microeletrodos. Uma câmara de gravação personalizada mantém a viabilidade do tecido durante prolongadas sessões experimentais. Viver o mapeamento de eletrodo e seleção de pares estimulantes são executadas por uma interface de usuário gráfica personalizada.

Gravação e modulação da atividade epileptiforme em fatias de cérebro de roedor acoplado para matrizes de microeletrodos

Desenvolvemos uma técnica que registra simultaneamente tanto eletrocorticografia e potenciais de campo local em resposta a estímulos nociceptivos do laser de ratos movimentando-se livremente. Esta técnica ajuda a estabelecer uma relação direta dos sinais de electrocortical o nível macroscópico e mesoscópica e que facilita a investigação de informação nociceptiva processamento no cérebro.

Gravações simultâneas de potenciais de campo corticais Local e Electrocorticograms em resposta a estímulos nociceptivos Laser de ratos movimentando-se livremente

A gravação da único-fibra é uma técnica eletrofisiológicos eficaz que seja aplicável aos sistemas nervosos centrais e periféricos. Junto com a preparação de DRG intact com o nervo ciático Unido, o mecanismo da falha da condução é examinado. Ambos os protocolos melhoram a compreensão da relação do sistema nervoso periférico com a dor.

Uso da gravação in vivo da único-fibra e do gânglio dorsal intacto da raiz com nervo sciatic Unido para examinar o mecanismo da falha da condução

Este protocolo descreve a gravação intracelular in vivo de motoneurons lombares de rato com estimulação simultânea de corrente trans-espinhal. O método permite medir as propriedades da membrana e registrar disparos rítmicos de motoneurons antes, durante e depois da polarização anodal ou catódal da medula espinhal.

In Vivo Intracelular Gravação de Motoneurons vertebrais de rato identificados tipo durante estimulação de corrente direta trans-espinhal

APTrack é um plugin de software desenvolvido para a plataforma Open Ephys que permite a visualização de dados em tempo real e o rastreamento do limiar elétrico em malha fechada de potenciais de ação neuronais. Nós usamos isso com sucesso em microneurografia para nociceptores de fibra C humana e nociceptores de fibra C e fibra Aδ de camundongo.

Rastreamento de limiar elétrico de circuito fechado em tempo fechado de código aberto para pesquisa translacional da dor

Aqui, apresentamos um método para avaliar a ativação e o bloqueio dos axônios sensoriais nos nervos periféricos em experimentos agudos, anestesiados e in vivo com ratos, utilizando dois tipos de medições eletrofisiológicas da coluna vertebral que podem discriminar a atividade dos subtipos de fibras nervosas: Potenciais de Campo Local e registros de neurônios únicos em Faixa Dinâmica Ampla.

Métodos eletrofisiológicos para avaliar o bloqueio de dor periférica em um rato anestesiado

Aprenda a registrar atividade de rede em circuitos nociceptivos da coluna vertebral usando matrizes de microeletrodos em fatias de medula de camundongo. Este método permite analisar processamento sensorial espinhal e triagem de compostos antinociceptivos.

Atividade de rede de gravação em circuitos nociceptivos da coluna vertebral usando matrizes de microeletrodos

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