Name: Reconstituição da Atividade de Extração de Msp1 com Componentes Totalmente Purificados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Aprenda a reconstituir a atividade de extração da AAA-ATPase Msp1 usando componentes purificados e proteolipossomos definidos. Este protocolo simplificado permite manipular a enzima, o substrato e o ambiente lipídico para estudar o controle de qualidade proteica.

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MLW desenvolveu parte deste protocolo durante seus estudos de pós-doutorado com o Dr. Robert Keenan na Universidade de Chicago.
Este trabalho é financiado pela concessão do NIH 1R35GM137904-01 à MLW.

A função mitocondrial adequada depende de um sistema robusto de controle de qualidade de proteína. Devido aos limites inerentes à fidelidade das vias de direcionamento da proteína TA, as proteínas T deslocalizadas são uma fonte constante de estresse para mitocôndrias. Um componente-chave da rede de proteostase mitocondrial é o Msp1, que é um ATPase AAA+ ancorado em membrana que remove proteínas TA mal localizadas do OMM. Aqui, descrevemos como preparar proteoliposomes, co-reconstituir Msp1 e uma proteína TA modelo, e rea...

A função celular adequada depende de um processo chamado proteostase, que garante que as proteínas funcionais estejam na concentração correta e localização celular1. Falhas na proteostase levam à função organela comprometida e estão associadas a muitas doenças neurodegenerativas2,3,4. As proteínas de membrana apresentam desafios únicos à rede de proteostase, pois devem ser direcionadas para a membrana correta, evitando a agregação dos domínios hidrofóbicos transmembrano (TMDs)5. Consequentemente, o maquinário especializado evoluiu para proteger o TMD hidrofóbico do citosol e facilitar a segmentação e inserção na membrana celular adequada6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
Mitocôndrias são o centro metabólico da célula e estão envolvidas em inúmeros processos celulares essenciais, tais como: fosforilação oxidativa, geração de aglomerados ferro-enxofre e regulação apoptótica16,17. Essas organelas endossímbiticas contêm duas membranas, conhecidas como a membrana mitocondrial interna (IMM) e a membrana mitocondrial externa (OMM). Mais de 99% das 1.500 proteínas mitocondriais humanas estão codificadas no genoma nuclear e precisam ser translocadas através de uma ou duas membranas diferentes18,19. A função mitocondrial adequada depende, portanto, de uma rede robusta de proteostase para corrigir quaisquer erros na segmentação ou translocação de proteínas.
Nosso laboratório se concentra em um subconjunto de proteínas de membrana mitocondrial chamadas proteínas ancoradas na cauda (TA), que têm um único domínio transmembrano no próprio C-terminus20,21,22,23,24. As proteínas TA estão envolvidas em uma série de processos essenciais, como apoptose, transporte de vesículas e translocação de proteínas25. A topologia única das proteínas TA requer a inserção pós-translacional, que ocorre no ânticulo endoplasmático (ER) pela Entrada Guiada de Extremidades Ancoradas (GET) ou Complexo de Proteína de Membrana Ticúrica Endoplasmática (EMC) ou no OMM por uma via mal caracterizada20,26,27,28. As propriedades biofísicas do TMD são necessárias e suficientes para guiar as proteínas TA para a membrana correta29. O reconhecimento de características biofísicas em vez de um motivo de sequência definida limita a fidelidade das vias de segmentação5. Assim, a málocalização das proteínas TA é um estresse comum para as redes de proteostase. O estresse celular, como a inibição da via GET, causa um aumento da mislocalização da proteína à OMM e disfunção mitocondrial, a menos que essas proteínas sejam prontamente removidas30,31.
Um tema comum na proteostase da membrana é o uso de proteínas AAA+ (ATPase Associated com ctivities celular A)proteínas para remover proteínas antigas, danificadas ou mislocalizadas da bicamada lipídica1,32,33,34,35,36,37,38 . As proteínas AAA+ são motores moleculares que formam anéis hexamericos e sofrem movimentos dependentes de ATP para remodelar um substrato, muitas vezes por translocação através de um poro axial estreito39,40. Embora grande esforço tenha sido dedicado ao estudo da extração de proteínas de membrana por ATPases AAA+, as reconstituições são complexas ou envolvem uma mistura de lipídios e detergente41,42, que limita o poder experimental de examinar o mecanismo de extração de substrato a partir da bicamada lipídica.
Msp1 é um ATPase AAA+ altamente conservado ancorado no OMM e peroxisoos que desempenha um papel crítico na proteostase da membrana, removendo proteínas TA mal localizadas43,44,45,46,47. O MSP1 também foi recentemente mostrado para aliviar o estresse de importação de proteínas mitocondriais, removendo proteínas de membrana que param durante a translocação através da OMM48. A perda de Msp1 ou o homólogo humano ATAD1 resulta em fragmentação mitocondrial, falhas na fosforilação oxidativa, convulsões, aumento da lesão após acidente vascular cerebral e morte precoce31,49,50,51,52,53,54,55,56.
Mostramos que é possível co-reconstituir proteínas TA com Msp1 e detectar a extração da bicamadas lipídica57. Este sistema simplificado utiliza proteínas totalmente purificadas reconstituídas em lipossomos definidos que imitam o OMM (Figura 1)58,59. Esse nível de controle experimental pode abordar questões mecanicistas detalhadas da extração de substratos que são experimentalmente intratáveis com reconstituições mais complexas envolvendo outras proteínas AAA+. Aqui, fornecemos protocolos experimentais detalhando nossos métodos de preparação de lipossomos, reconstituição de proteínas de membrana e o ensaio de extração. Esperamos que esses detalhes experimentais facilitem um estudo mais aprofundado do processo essencial, mas mal compreendido, da proteostase da membrana.

<table><tbody><tr><td>Biobeads</td><td>Bio-Rad</td><td>1523920</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatidil inositol de fígado bovino</td><td>Avanti</td><td>840042C</td><td>PI</td></tr><tr><td>Fosfatidilcolina de ovo de galinha</td><td>Avanti</td><td>840051C</td><td>PC</td></tr><tr><td>Fosfatidil etanolamina de ovo de galinha</td><td>Avanti</td><td>840021C</td><td>PE</td></tr><tr><td>ECL Selecione o reagente de detecção de western blotting</td><td>GE</td><td>RPN2235</td><td></td></tr><tr><td>Suportes de filtro</td><td>Avanti</td><td>610014</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de vidro</td><td>VWR</td><td>60910L-1</td><td></td></tr><tr><td>Coluna de rotação de glutationa</td><td>Thermo Fisher</td><td>PI16103</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-coelho</td><td>Thermo Fisher</td><td>NC1050917</td><td></td></tr><tr><td>Mini-extrusora</td><td>Avanti</td><td>610020</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de policarbonato</td><td>Avanti</td><td>610006</td><td>200 nM</td></tr><tr><td>membrana em PVDF</td><td>Thermo Fisher</td><td>88518</td><td>45 &micro; M</td></tr><tr><td>Rabbit anti-FLAG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7245</td><td></td></tr><tr><td>Sintético 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina</td><td>Avanti</td><td>840035C</td><td>DOPS</td></tr><tr><td>Sintético 1',3'-bis[1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo]-glicerol</td><td>Seringa Avanti</td><td>710335C</td><td>TOCL</td></tr><tr><td>, 1 mL</td><td>Seringa Norm-Ject</td><td>53548-001</td><td></td></tr><tr><td>, 1 mL, à prova</td> <td>de gásAvanti</td><td>610017</td><td></td></tr></tbody></table>

reconstituição da atividade de extração de msp1 com componentes totalmente purificados

Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

Como centro de fosforilação oxidativa e regulação apoptótica, as mitocôndrias desempenham um papel vital na saúde humana. A função mitocondrial adequada depende de um sistema robusto de controle de qualidade para manter a homeostase proteica (proteostase). Declínios na proteostase mitocondrial têm sido ligados ao câncer, envelhecimento, neurodegeneração e muitas outras doenças. Msp1 é um AAA+ ATPase ancorado na membrana mitocondrial externa que mantém a proteostase removendo proteínas ancoradas na cauda deslocalizadas. Utilizando componentes purificados reconstituídos em proteoliposomes, mostramos que o Msp1 é necessário e suficiente para extrair um modelo de proteína ancorada na cauda de uma bicamada lipídica. Nosso sistema simplificado reconstituído supera várias das barreiras técnicas que têm dificultado o estudo detalhado da extração de proteínas de membrana. Aqui, fornecemos métodos detalhados para a geração de lipossomos, reconstituição de proteínas de membrana e o ensaio de extração de Msp1.

Para interpretar corretamente os resultados, o gel livre de manchas e a mancha ocidental devem ser vistos juntos. O gel livre de manchas garante o carregamento igual em todas as amostras. Ao visualizar o gel livre de manchas, os acompanhantes (GST-calmodulin e GST-SGTA) serão visíveis nas pistas INPUT (I) e ELUTE (E). Verifique duas vezes se a intensidade dessas bandas é uniforme em todas as amostras de ENTRADA. Da mesma forma, certifique-se de que a intensidade é uniforme em todas as amostras de ELUTE. O ELUTE é 5x mais...

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para a reconstituição da atividade extração de Msp1 com componentes totalmente purificados em proteoliposomes definidos.

Reconstituição da Atividade de Extração de Msp1 com Componentes Totalmente Purificados

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...

O uso de AAA-ATPases para remover proteínas de um bicamheiro lipídico é um tema comum no controle da qualidade das proteínas. Uma compreensão mecanicista desse processo essencial requer um sistema reconstituído. A reconstituição anterior com AAA-ATPases era complexa e heterogênea.Nosso sistema é simples e totalmente definido. Isso nos permite manipular o AAA-ATPase Msp1, o substrato e o ambiente lipídulo. Para começar, adicione tampão de reconstituição previamente preparado, proteínas Msp1 e TA purificadas e lipossomos em um tubo PCR e, em seguida, incubar a mistura no gelo por 10 minutos.Durante a incubação, corte a ponta de uma ponta de pipeta P200 para cerca de 1/8 de polegada de diâmetro. Em seguida, o vórtice do tubo contendo BioBeads completamente para obter uma mistura uniforme. Em seguida, remova rapidamente a tampa e use a ponta de pipeta P200 cortada para transferir um volume apropriado das contas para um tubo PCR vazio.Uma vez que a incubação de 10 minutos para a reconstituição esteja completa, usando uma ponta de pipeta sem cortes, remova todo o líquido das BioBeads. Em seguida, transfira 100 microliters da reconstituição para o tubo com as BioBeads e deixe-a girar em uma roda por 16 horas. No dia seguinte, gire o tubo em um PicoFuge para pelotar as contas, em seguida, transfira o material reconstituído para um tubo PCR limpo e mantenha o tubo no gelo.Para remover proteínas que não conseguiram reconstituir nos lipossomos, equilibre as colunas de spin de glutationa com tampão de extração, que normalmente envolve três rodadas de lavagem com 400 microliters de tampão, seguidas de centrifugação para remover o tampão. Em seguida, adicione cinco micromoles de cada acompanhante ao material reconstituído, seguido por 100 microliters de tampão de extração, elevando o volume para 200 microlitres. Adicione essa mistura às colunas de giro de glutationa equilibradas, depois conecte as colunas de giro e gire-as por 30 minutos, permitindo que os acompanhantes se liguem à resina.Após a rotação, gire as colunas brevemente. Recolher o fluxo, que é o material pré-desmatado esgotado de proteínas agregadas. Coloque-o no gelo e prossiga diretamente para o ensaio de extração.Prepare tubos para análise SDS-PAGE. Adicione 45 microliters de água duplamente destilada ao tubo de entrada, 40 microliters de água ao tubo de fluxo e 16,6 microliters de 4X SDS-PAGE carregando tampão para cada tubo. Para o ensaio de extração, prepare a reação de extração e eleve o volume final para 200 microliters com o tampão de extração.Em seguida, pré-aqueça o ensaio de extração em um bloco de calor de 30 graus Celsius por dois minutos. Para iniciar o ensaio, adicione ATP a uma concentração final de dois mililitros. Gire o tubo por cinco segundos em um PicoFuge, e incuba-o a 30 graus Celsius por 30 minutos.Durante a incubação, pegue uma amostra de cinco microliter da reação e adicione-a ao tubo de entrada. Além disso, equilibre uma coluna de spin de glutationa para cada amostra no ensaio de extração, como demonstrado anteriormente. Uma vez que a incubação de 30 minutos esteja completa, adicione 200 microliters de tampão de extração ao tubo, elevando o volume total para 400 microliters.Em seguida, adicione esta reação à resina de glutationa equilibrada e deixe-a girar por 30 minutos a quatro graus Celsius. Após a rotação, gire as colunas para coletar o fluxo-through e, em seguida, pegue uma amostra de 10 microliter para o tubo de fluxo. Lave a resina duas vezes com 400 microliters de tampão de extração, descartando o fluxo após cada lavagem.Após a terceira lavagem, mantenha o fluxo e leve uma amostra de 50 microliter para o tubo de lavagem. Em seguida, prepare cinco mililitros de tampão de elução adicionando glutationa reduzida a uma concentração final de cinco milimoles no buffer de extração. Adicione 200 microliters do tampão de elução à coluna de giro e incubar por cinco minutos.Em seguida, centrifufique a coluna e colete o fluxo. Repita o passo de eluição mais uma vez. Após a segunda eluição, pegue uma alíquota de 50 microliter da amostra de eluição e adicione-a ao tubo de elute.Depois de executar uma mancha ocidental, a eficiência de extração pode ser determinada comparando a quantidade de substrato na fração de elute com a fração de entrada. O sinal no fluxo mostra alguma variabilidade, mas é geralmente semelhante à fração de entrada, e não há sinal na fração de lavagem. Normalmente, há uma eficiência de extração de aproximadamente 10% para o controle positivo e uma eficiência de extração de um a 2% para o controle negativo.Quando as condições de reconstituição não são otimizadas, os níveis de extração são comparáveis entre as amostras positivas e negativas. Esta técnica permitiu que nosso laboratório testásse propriedades biofísicas do substrato a afetar o reconhecimento por Msp1.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Aqui, nós descrevemos um protocolo para a purificação de altamente ativa Hsp104, a AAA hexamérica + proteína de levedura, que acopla a hidrólise de ATP a desagregação de proteína. Este esquema explora uma construção His6 marcadas para a purificação de...

Purificação da Hsp104, um Disaggregase Protein

Nanodiscs são pequenas partículas discóides que incorporam proteínas de membrana em um pequeno pedaço de bicamada de fosfolipídios. Nós fornecemos um protocolo visual que mostra a incorporação passo-a-passo do transportador MalFGK2 em um disco.

Um método passo-a-passo para a reconstituição de um transportador ABC em partículas lipídicas Nanodisc

Este vídeo demonstra um protocolo in vitro para estudar a remoção mediada por Msp1 de proteínas TA mal localizadas integradas à bicamada lipídica de lipossomas. As proteínas Msp1 e TA são co-reconstituídas em lipossomas, e a translocação dependente de ATP das proteínas TA é confirmada por meio da purificação de afinidade.

Ensaio de extração de msp1 para estudar a remoção de proteínas TA mal localizadas

A proteína de levedura nucleóide mitocondrial, Mgm101, é uma proteína de recombinação de tipo rad52 que forma anéis grandes oligoméricas. Um protocolo é descrito para preparar Mgm101 solúvel recombinante utilizando a proteína de ligação à maltose (MBP), acoplado com a estratégia de marcação de permuta catiónica e a cromatografia de exclusão de tamanho.

Preparação do Mgm101 recombinação de proteínas por Estratégia Tagging baseado MBP

É descrito um método para a purificação eficiente de proteínas de fusão duplo-Strep-marcados e os seus complexos específicos de estreptavidina modificada (Strep-Tactin) resina covalentemente reticulado com bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3). O método tem as vantagens de alta velocidade, uma boa recuperação da proteína alvo e de elevada pureza, e é compatível com a análise subsequente por espectrometria de massa.

Um passo de Purificação de Proteínas Twin-Strep-tag e seus complexos de Strep-Tactin Resina reticulado com Bis (sulfossuccinimidilo) suberato (BS3)

Muitas proteínas desempenham sua função quando ligadas às superfícies da membrana. A ligação de proteínas extrínsecas nas membranas dos nanodiscos pode ser indiretamente visualizada por microscopia eletrônica de transmissão. Mostramos que o empilhamento característico (rouleau) de nanodiscos induzido pela coloração negativa fosfotungstato de sódio é impedido pela ligação de proteínas extrínsecas.

Método para visualizar e analisar membrana proteínas que interagem por Microscopia Eletrônica de Transmissão

Nós fornecemos um protocolo para in vitro ensaios de auto-organização da mente e da minha em uma bicamada lipídica suportados numa câmara aberta. Além disso, descrevemos como delimitar o ensaio em lipídios-folheados microcompartments PDMS para imitar as condições na vivo por confinamento de reação.

In Vitro Reconstituição de auto-organização padrões de proteína na Bilayers do Lipid suportados

A inserção co-translacional em nanodiscos pré-formados torna possível estudar proteínas de membrana sintetizadas livres de células em ambientes lipídicos definidos sem contato com detergentes. Este protocolo descreve a preparação de componentes essenciais do sistema e os parâmetros críticos para melhorar a eficiência da expressão e a qualidade da amostra.

Inserção Co-Translacional de Proteínas de Membrana em Nanodiscos Pré-Formados

Este protocolo detalha o enriquecimento de vesículas extracelulares de micobactérias nativas (mEVs) de culturas axênicas de Mycobacterium smegmatis (Msm) e como mCherry (um repórter fluorescente vermelho) contendo MsmEVs recombinantes pode ser projetado e enriquecido. Por fim, verifica-se a nova abordagem com o enriquecimento de MsmEVs contendo a proteína EsxA do Mycobacterium tuberculosis.

Enriquecimento de vesículas extracelulares nativas e recombinantes de micobactérias

Este artigo descreve uma metodologia para superexpressar Nsp15 recombinante, uma nuclease tóxica, em um sistema de expressão C41 (DE3), seguido de purificação da proteína marcada utilizando cromatografia de afinidade e exclusão de tamanho. Esses protocolos podem ser adaptados para outras proteínas tóxicas desafiadoras.

Superexpressando e purificando uma nuclease tóxica de Escherichia coli

Este estudo descreve o procedimento para reconstituir o canal K+ sensível à ácido-sensitivo relacionado à proteína de membrana TWIK (Task2) em nanodiscos. A montagem bem-sucedida foi confirmada por microscopia crio-eletrônica de partícula única, que forneceu médias de classe bidimensionais bem definidas.

Uma técnica para estabilizar proteínas de membrana em nanodiscos

Aprenda a reconstituir a atividade de extração da AAA-ATPase Msp1 usando componentes purificados e proteolipossomos definidos. Este protocolo simplificado permite manipular a enzima, o substrato e o ambiente lipídico para estudar o controle de qualidade proteica.

Reconstituição da Atividade de Extração de Msp1 com Componentes Totalmente Purificados

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