Name: Interrogatório de Mecanobiologia totalmente óptica de proteína associada a sim em câncer humano e células normais usando um sistema multifuncional (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Aprenda a investigar a mecanossensibilidade da proteína YAP em células de câncer humano e normais usando um sistema óptico multifuncional automatizado. Este método avançado permite imagem de células vivas em alta resolução.

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Este projeto é apoiado financeiramente pelo Prêmio Piloto de Câncer do Centro de Câncer da UF Saúde (X. T. e D. S.) e pelo Pacote de Início do Prêmio Gatorade (X. T.). Os autores agradecem sinceramente as discussões intelectuais e os suportes técnicos do Dr. Jonathan Licht (UFHCC), Dr. Rolf Renne (UFHCC), Dr. Ji-Hyun Lee (Bioestatística, UF), Dr. Hugh Fan (MAE, UF), Dr. Warren Dixon (MAE, UF), Dr. Ghatu Subhash (MAE, UF), Dr. Mark Sheplak (MAE & ECE, UF), Dr. Malisa Sarntinoranont (MAE, UF), Dr. Scott Banks (MAE, MAE), Dr. UF), Dr. Matthew Traum (MAE, UF), Dr. David Hahn (Universidade do Arizona), Dr. Weihong Wang (Oracle Corporation), Dr. Youhua Tan (Hong Kong Polytechnic University), e a Equipe de Apoio de Nikon (Drs. Jose Serrano-Velez, Larry Kordon e Jon Ekman). Os autores estão profundamente gratos pelo apoio generoso e eficaz de todos os membros dos laboratórios de pesquisa de Tang, Siemann e Guan e todos os membros da equipe dos Departamentos de Oncologia MAE & ECE & Physics & Radiation, UF.

<ol><li>Werley, C., Boccardo, S., Rigamonti, A., Hansson, E., Cohen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+optical+sensors+in+arrayed+islands+of+cells+for+multimodal+recordings+of+cellular+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Multiplexed optical sensors in arrayed islands of cells for multimodal recordings of cellular physiology.</a> Nature Communications. 11 (1), 3881(2020).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epi-illumination+SPIM+for+volumetric+imaging+with+high+spatial-temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Epi-illumination SPIM for volumetric imaging with high spatial-temporal resolution.</a> Nature Methods. 16 (6), 501-504 (2019).</li>
<li>Saraswathibhatla, A., Galles, E. E., Notbohm, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+force+and+motion+in+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal force and motion in collective cell migration.</a> Scientific Data. 7 (1), 197(2020).</li>
<li>Saraswathibhatla, A., Henkes, S., Galles, E. E., Sknepnek, R., Notbohm, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+tractions+control+the+size+of+a+collectively+moving+pack+in+a+cell+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Extreme+Mechanics+Letters%22%5BJournal%5D)">Coordinated tractions control the size of a collectively moving pack in a cell monolayer.</a> Extreme Mechanics Letters. 48, 101438(2021).</li>
<li>Wang, W., Kim, C. K., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+tools+for+imaging+and+recording+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular tools for imaging and recording neuronal activity.</a> Nature Chemical Biology. 15 (2), 101-110 (2019).</li>
<li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+imaging+software+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Biological imaging software tools.</a> Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).</li>
<li>Carpenter, A. E., Kamentsky, L., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+call+for+bioimaging+software+usability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A call for bioimaging software usability.</a> Nature Methods. 9 (7), 666-670 (2012).</li>
<li>Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+long-term+imaging+and+quantification+of+single-cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics.</a> Nature Biotechnology. 34 (11), 1137-1144 (2016).</li>
<li>Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+indicators+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded indicators of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).</li>
<li>Luo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+multi-functional+integration+program+%28AMFIP%29+towards+all-optical+mechanobiology+interrogation%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Automatic multi-functional integration program (AMFIP) towards all-optical mechanobiology interrogation.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+control+of+microscopes+using+manager%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer control of microscopes using manager.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 92 (1), 14-20 (2010).</li>
<li>Tulpule, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinase-mediated+RAS+signaling+via+membraneless+cytoplasmic+protein+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Kinase-mediated RAS signaling via membraneless cytoplasmic protein granules.</a> Cell. 184 (10), 2649-2664 (2021).</li>
<li>Tang, X., Tofangchi, A., Anand, S. V., Saif, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+cell+traction+force+microscopy+to+study+multi-cellular+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel cell traction force microscopy to study multi-cellular system.</a> PLOS Computational Biology. 10 (6), 1003631(2014).</li>
<li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+force+affects+expression+of+an+in+vitro+metastasis-like+phenotype+in+HCT-8+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells.</a> Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).</li>
<li>Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stiffness+of+living+tissues+and+its+implications+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering.</a> Nature Reviews Materials. 5, 351-370 (2020).</li>
<li>Phelps, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maleimide+cross-linked+bioactive+PEG+hydrogel+exhibits+improved+reaction+kinetics+and+cross-linking+for+cell+encapsulation+and+in+situ+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Maleimide cross-linked bioactive PEG hydrogel exhibits improved reaction kinetics and cross-linking for cell encapsulation and in situ delivery.</a> Advanced Materials. 24 (1), 64-70 (2012).</li>
<li>Bajaj, P., Tang, X., Saif, T. A., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiffness+of+the+substrate+influences+the+phenotype+of+embryonic+chicken+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Stiffness of the substrate influences the phenotype of embryonic chicken cardiac myocytes.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 95 (4), 1261-1269 (2010).</li>
<li>Temples, M. N., Adjei, I. M., Nimocks, P. M., Djeu, J., Sharma, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+three-dimensional+tumor+models+to+study+natural+killer+cell+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Engineered three-dimensional tumor models to study natural killer cell suppression.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (7), 4179-4199 (2020).</li>
<li>Feng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+split+fluorescent+proteins+for+endogenous+protein+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Improved split fluorescent proteins for endogenous protein labeling.</a> Nature Communications. 8, 370(2017).</li>
<li>Guan, J., Liu, H., Shi, X., Feng, S., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+multiple+genomic+elements+using+correlative+CRISPR+imaging+and+sequential+DNA+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Tracking multiple genomic elements using correlative CRISPR imaging and sequential DNA FISH.</a> Biophysical Journal. 112 (6), 1077-1084 (2017).</li>
<li>Micro-Manager. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://micro-manager.org/wiki/NikonTi2">https://micro-manager.org/wiki/NikonTi2</a> (2021).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Martiel, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cell+traction+forces+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Measurement of cell traction forces with ImageJ.</a> Methods in Cell Biology. 125, 269-287 (2015).</li>
<li>Okumurai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+generalization+of+Cerruti%27s+problem+in+an+elastic+half-space%5BTitle%5D)+AND+%22Doboku+Gakkai+Ronbunshu%22%5BJournal%5D)">On the generalization of Cerruti's problem in an elastic half-space.</a> Doboku Gakkai Ronbunshu. 1995, 1-10 (1995).</li>
<li>Piccolo, S., Dupont, S., Cordenonsi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+YAP%2FTAZ%3A+hippo+signaling+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The biology of YAP/TAZ: hippo signaling and beyond.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1287-1312 (2014).</li>
<li>Hong, W. W., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+YAP+and+TAZ+transcription+co-activators%3A+Key+downstream+effectors+of+the+mammalian+Hippo+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The YAP and TAZ transcription co-activators: Key downstream effectors of the mammalian Hippo pathway.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 23 (7), 785-793 (2012).</li>
<li>Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP%2FTAZ+at+the+roots+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">YAP/TAZ at the roots of cancer.</a> Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+yes-associated+protein+contributes+to+progression+and+poor+prognosis+of+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Overexpression of yes-associated protein contributes to progression and poor prognosis of non-small-cell lung cancer.</a> Cancer Science. 101 (5), 1279-1285 (2010).</li>
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<li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanically-induced+colon+cancer+cell+population+shows+increased+metastatic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">A mechanically-induced colon cancer cell population shows increased metastatic potential.</a> Molecular Cancer. 13, 131(2014).</li>
<li>Panciera, T., Azzolin, L., Cordenonsi, M., Piccolo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+of+YAP+and+TAZ+in+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology of YAP and TAZ in physiology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 758-770 (2017).</li>
<li>Yuan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yes-associated+protein+%28YAP%29+functions+as+a+tumor+suppressor+in+breast%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Yes-associated protein (YAP) functions as a tumor suppressor in breast.</a> Cell Death and Differentiation. 15 (11), 1752-1759 (2008).</li>
<li>Koushki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamin+A+redistribution+mediated+by+nuclear+deformation+determines+dynamic+localization+of+YAP%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Lamin A redistribution mediated by nuclear deformation determines dynamic localization of YAP.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Chang, S. S., Rape, A. D., Wong, S. A., Guo, W. H., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+regulates+cellular+mechanical+states%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Migration regulates cellular mechanical states.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (26), 3104-3111 (2019).</li>
<li>Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+guidance+of+integrin+mediated+traction+stress+during+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 69, 174-183 (2015).</li>
<li>Lee, J., Abdeen, A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+directed+adipogenesis+and+neurogenesis+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+adipose+tissue+and+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Matrix directed adipogenesis and neurogenesis of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow.</a> Acta Biomaterialia. 42, 46-55 (2016).</li>
<li>Tang, X., Bajaj, P., Bashir, R., Saif, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+far+cardiac+cells+can+see+each+other+mechanically%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">How far cardiac cells can see each other mechanically.</a> Soft Matter. 7 (13), 6151-6158 (2011).</li>
<li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li>
<li>Rape, A., Guo, W. H., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+traction+force+in+relation+to+cell+shape+and+focal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions.</a> Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2011).</li>
<li>Shiu, J. Y., Aires, L., Lin, Z., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopillar+force+measurements+reveal+actin-cap-mediated+YAP+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nanopillar force measurements reveal actin-cap-mediated YAP mechanotransduction.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 262-271 (2018).</li>
<li>Fracchia, A., Asraf, T., Salmon-Divon, M., Gerlitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+lamin+B1+levels+promote+cell+migration+by+altering+perinuclear+actin+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Increased lamin B1 levels promote cell migration by altering perinuclear actin organization.</a> Cells. 9 (10), 2161(2020).</li>
<li>Ramdas, N. M., Shivashankar, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+control+of+nuclear+morphology+and+chromatin+o1rganization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal control of nuclear morphology and chromatin o1rganization.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (3), 695-706 (2015).</li>
<li>Khatau, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perinuclear+actin+cap+regulates+nuclear+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A perinuclear actin cap regulates nuclear shape.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 19017-19022 (2009).</li>
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</ol>

Não há conflitos de interesse para declarar.

O processo de imagem (etapa 6.3) é fundamental para garantir que as imagens de fluorescência sejam de qualidade suficiente para produzir resultados de quantificação válidos. As imagens de z-stack de proteína fluorescente ou contas devem ter um z-range que é grande o suficiente para incluir as imagens em foco para todas as posições Z que a amostra abrange. Outro passo crítico é coletar as imagens de referência de contas fluorescentes após dissolver as células (etapa 6.5). Como as imagens de referência precisam ser tomadas nas mesmas posições na etapa 6.3, nenhum deslocamento relativo deve ser induzido entre a placa de Petri, a câmara de ambiente e o microscópio. Os investigadores que realizam a etapa de dissolução devem ter cuidado para remover a tampa da placa de Petri e garantir que a perturbação mecânica aplicada não seja grande o suficiente para alterar a localização da placa na câmara de ambiente.
As soluções são fornecidas abaixo para resolver alguns erros que podem ocorrer durante os experimentos. Se nenhuma macro for ativada após clicar em Enter na etapa 6.4, é mais provável que a área inferior esquerda da tela esteja ocupada por uma janela não-Elemento. Nesse caso, a área inferior esquerda da janela precisa ser limpa para que as macros possam ser ativadas em Elementos. Outro erro comum é que as imagens de campo brilhante parecem pretas. Este problema é causado por um intervalo de tempo insuficiente entre as aquisições de fluorescência e imagens de campo brilhante. Pequenos atrasos na contagem de tempo de imagem da fluorescência podem se acumular ao longo do tempo e causar atrasos consideráveis e interferir com a imagem de campo brilhante. Uma solução é ajustar a duração de um ciclo de imagem de todas as posições a ser menor do que (não igual a) o intervalo de tempo entre o início de movimentos consecutivos. Esta operação atualiza a contagem de tempo e elimina o erro cumulativo no início de cada ciclo de imagem.
Esta tecnologia de interrogatório totalmente óptica suporta (1) uma ampla gama de hardware/software, incluindo, mas não se limitando à Nikon, (2) diversos tipos de sistemas de hidrogel validados, incluindo gelatina, PEG, Matrigel e géis de colágeno I, e (3) a personalização programável com base em diferentes necessidades dos pesquisadores. No entanto, se alguma das funções de controle de nível inferior não estiver disponível a partir de um microscópio comercial, a personalização das funções usando o AMFIP se torna desafiadora. Outra limitação desta técnica é a deriva espacial da amostra tanto nos planos XY quanto em foco (Z). Embora essa limitação possa ser superada durante o pós-processamento das imagens, é essencial melhorar a função de foco automático para corrigir a deriva em tempo real das amostras. Essa melhoria aumentará o rendimento do processo de imagem e reduzirá o erro potencial causado pela deriva durante os experimentos.
Mechanotransdutores, como o YAP, podem servir como novos alvos terapêuticos para o desenvolvimento de terapias promissoras contra o câncer25,26,27. Dados emergentes sugerem que a YAP promove a proliferação e invasão de células cancerígenas. A translocação yap induzida pela mecânica do citoplasma para o núcleo ativa a transcrição de genes relacionados à migração celular, proliferação, invasão e apoptose, levando a comportamentos celulares aberrantes28,29,30,31. Este trabalho teve como objetivo explorar a correlação potencial da razão YAP N/C e da mecânica celular em duas linhas típicas de câncer de pulmão humano e células normais. Durante o período de disseminação celular de 10 h, as células PC9 apresentam concentrações semelhantes de YAP no núcleo e citoplasma (Figura 3D e Figura 5A). As células B2B apresentam maior concentração de YAP no núcleo do que no citoplasma (Figura 3C e Figura 5A). Essa relação encontrada durante o estágio de disseminação precoce é diferente da maioria dos achados publicados que comparam a concentração de YAP no núcleo entre células normais e cancerígenas. Embora não necessariamente em estágio inicial de disseminação, a maioria dos achados publicados mostram que o YAP está mais concentrado no núcleo das células cancerosas do que no núcleo das células normais27,28. Apenas um estudo sobre câncer de mama relatou uma exceção32 que mostra que o YAP está mais concentrado no citoplasma, o que concorda com nossas observações atuais feitas em células pc9 de câncer de pulmão. Para o melhor do conhecimento dos autores, este trabalho é o primeiro a mostrar uma menor proporção de N/C yap em uma linha de células cancerígenas de pulmão humana. Os autores afirmam que a razão para uma relação YAP N/C estável nas células PC9 pode ser devido à baixa variação na área de propagação celular/núcleo e tração nas células PC9 no estágio de disseminação precoce. A dissecção dos mecanismos moleculares subjacentes da baixa relação YAP N/C em células PC9 e B2B está em andamento.
Durante as primeiras 10 horas de propagação, essas duas linhas de células mostram uma relação distinta entre a razão YAP N/C, tração celular e área de propagação (Figura 5). Para as células B2B, uma maior razão YAP N/C está correlacionada com uma área de disseminação de células e núcleos mais altas (Figura 6A,B), o que é consistente com os dados relatados de outras células normais33. Curiosamente, embora a tendência de desenvolvimento dessa relação seja geralmente encontrada em todas as células B2B registradas, dois graus diferentes (altos e baixos) dessa relação são encontrados. As células B2B que se espalham e migram simultaneamente mostram menor tração e maior área de disseminação celular e núcleo com maior proporção YAP N/C (2,05 ± 0,32). Para as células B2B que se espalham e permanecem no mesmo local, elas apresentam maior tração e área de propagação celular e núcleo inferior com uma menor razão YAP N/C (1,74 ± 0,21). Esses dois graus de relacionamento são demonstrados nos grupos de dados dispersos bifurcados (Figura 6C,D). Conforme relatado na literatura, células normais estacionárias, como as células do fibroblasto embrionário NIH 3T3, têm tração maior que as células migratórias34. Os dados relatados neste artigo sugerem que as células B2B disseminadas e não migratórias aplicaram tração maior do que a disseminação e migração de células B2B, provavelmente sugerindo que alta tração é necessária para que células não migratórias se estabilizem no substrato.
Além disso, esses dados mostram que as células B2B normais estacionárias geram uma força perinuclear maior, enquanto pesquisas anteriores realizadas por outros pesquisadores relataram apenas maior tração celular gerada na periferia de células estacionárias34,35,36,37. Os autores acham que a diferença na tendência intrínseca da migração nos experimentos pode causar esses resultados contraditórios. Nos experimentos publicados, a micropatters em forma quadrada foi usada para limitar a propagação e inibir a migração; se as células tinham a tendência de migrar é desconhecida. Como as células migratórias frequentemente mostram alta força de tração na periferia das células38, é provável que as células com tendência a migrar ainda mantenham alta tração periférica, mesmo que sua migração seja restrita. Neste presente estudo, as células estacionárias não são restritas por qualquer micropattern, mas não migram, indicando que as células tendem a manter seu estado não migratório. Outra possibilidade é que a forma celular definida pelo micropattern possa afetar a distribuição de aderências focais e forças de tração39. Os resultados deste estudo foram gerados sem qualquer micropatterning confinante e representam a distribuição de força das células estacionárias em sua forma original.
Para o melhor do conhecimento dos autores, apenas uma publicação até o momento relatou especificamente a descoberta de forças peri-nucleares em células normais (fibroblastos embrionários de camundongos), potencialmente causadas pela tampa de actina que abrange todo o núcleo40. A translocação yap citoplasma-núcleo está correlacionada com o aumento da força peri-nuclear40. Uma busca minuciosa da literatura relevante não produziu nenhuma publicação que relatasse uma força peri-nuclear ou a tampa de actin em células cancerosas. Um estudo indireto sobre células cancerígenas de melanoma demonstrou que a borda da actina (outra organização de actina peri-nuclear localizada ao redor, mas não cobrindo o núcleo) reduz as taxas de migração celular41, sugerindo indiretamente a existência de uma força peri-nuclear. No entanto, nenhum dado experimental direto é relatado. Neste estudo, os autores descobriram que tanto as células PC9 quanto B2B apresentam deslocamento e tração peri-nuclear. Os mecanismos de geração das forças peri-nucleares e seus efeitos permanecem controversos. Em células normais, foi relatado que a tampa de actina desempenha um papel na regulação da morfologia do núcleo e da organização cromatina42, transmitindo sinais mecânicos de aderências focais para o núcleo através de linkers do complexo nucleoesqueleto e citoesqueleto (LINC)43, e regulando a migração celular44. Lamin A/C está relacionado à formação e interrupção do actin cap40,41,42,43,44. No entanto, o relatório que alegou que o tampão actin gera uma força peri-nuclear não considerou o papel potencial do actin rim40. Nas células cancerosas, a superexpressão de Lamin A facilita a formação de uma borda de actina e restringe a migração de células cancerosas. A superexpressão de Lamin B reduz a formação de aro actin e promove a migração. A força peri-nuclear pode estar envolvida neste processo devido à existência da organização peri-nuclear actin e ao efeito de Lamin A. No entanto, os resultados deste estudo não mostraram qualquer evidência de forças peri-nucleares medidas ou o comportamento do actin cap. Portanto, a descoberta de forças peri-nucleares em células PC9 neste presente estudo é o primeiro relatório mostrando forças peri-nucleares e deslocamentos em células cancerígenas de pulmão. Os autores estão atualmente investigando os mecanismos moleculares e funções das forças peri-nucleares nas células PC9 e B2B projetadas pelo CRISPR/Cas9.
Além do interrogatório de mecanobiologia totalmente óptica que é demonstrado neste artigo, o sistema multifuncional integrado pode ser aplicado para sondar opticamente uma miríade de outros sinais fisiológicos e patobiológicos essenciais em sistemas vivos. Por exemplo, o laboratório dos autores estabeleceu recentemente múltiplas linhas celulares de câncer humano que co-expressam três proteínas de membrana sensível à luz: indicador de tensão de membrana QuasAr2 (excitação: 640 nm; emissão: 660 nm-740 nm), despolarizador de tensão de membrana CheRiff (excitação: 488 nm) e hiperpolarizador de tensão de membrana eNpHR3 (excitação: 590 nm). Essas três proteínas funcionais podem ser ativadas por linhas laser ortogonais de espectro de forma livre de crosstalk, permitindo comunicações de sinalização bidirecional ópticas (leitura e controle) da eletrofisiologia da membrana. Utilizando um sistema opto-eletrônico integrado e um grampo manual, os autores validaram o controle e leitura totalmente óptico da tensão de membrana (Vm) em células cancerígenas humanas únicas e esferoides tumorais multicelulares. O interrogatório de eletrofisiologia óptica abre a possibilidade de explorações detalhadas da bioeletricidade anteriormente inacessível em células cancerosas, o que pode ajudar a avançar a biologia tumoral a partir de um novo eixo.

O objetivo geral deste método é permitir imagens multifuncionais ópticas e análises de células vivas. Um programa de imagem all-in-one que permite a coordenação automática de dispositivos optoeletrônicos multifuncionais reduzirá operações manuais intensivas em mão-de-obra e propensas a erros e é essencial para os pesquisadores realizarem imagens de células vivas de longo prazo1,2,3,4. No entanto, a maioria dos programas públicos existentes na comunidade de pesquisa biomédica só se aplica a dispositivos optoeletrônicos limitados ou exige hardware adicional para a coordenação de diferentes equipamentos5,6,7,8,9. Recentemente, um programa de código aberto e baseado em software foi desenvolvido, intitulado "Automatic Multi-funcional Integration Program (AMFIP)", permitindo imagens multicanal e time-lapse. Com base na linguagem Java e na API (Application Programming Interface) de μManager11,12, a AMFIP foi desenvolvida como um plugin em μManager que executa scripts Java personalizados para realizar comunicações baseadas em software de múltiplas plataformas de hardware e software optoeletrônicas, incluindo, mas não se limitando às da Nikon. A criação da AMFIP abre a possibilidade de interrogatório programável e multifuncional de comportamentos celulares. Um sistema experimental e computacional integrado é desenvolvido neste artigo e combina AMFIP com análise de imagem digital e microscopia de força de tração celular. O sistema permite a elucidação da distinta mecanobiologia YAP em linhas celulares B2B normais (Figura 1) e pc9 (Figura 2) projetadas por CRISPR/Cas9. O sistema fornece à comunidade científica uma solução abrangente que evita a demanda de compra de dispositivos de controle adicionais que podem não estar disponíveis e/ou compatíveis com todos os sistemas de imagem.
Os protocolos apresentados neste artigo introduzem como (1) aplicar a AMFIP para realizar imagens automáticas de longo prazo para ambas as linhas celulares projetadas pelo CRISPR/Cas9 que expressam o YAP com etiqueta mNEonGreen2; e (2) combinam Fiji ImageJ, MATLAB e Origin para a análise quantitativa da razão YAP nuclear/citoplasma (N/C) com base em sua intensidade fluorescente (Figura 3 e Figura 4), campo de deslocamento celular (Figura 1C e Figura 2C) e campo de tração celular (Figura 1D e Figura 2D ). Os resultados sugerem que (1) durante as primeiras 10h de disseminação celular nos substratos que possuem rigidez mecânica fisiologicamente relevante13,14,15,16,17,18, a razão YAP N/C de células B2B únicas apresenta variação e flutuação mais perceptível dependente do tempo em comparação com a de células PC9 únicas (Figura 5 e Figura 6 ); e (2) células cancerígenas PC9 geram tração perceptível em suas regiões peri-nucleares (Figura 7). O sistema integrado e as metodologias descritas neste protocolo transcendem os tipos específicos de células e moléculas optogenéticas. Os pesquisadores podem aplicar os protocolos para personalizar seus experimentos específicos de interrogatório em células vivas e elucidar dinâmicas de sinalização multifacetadas no contexto da fisiologia celular e patologia.

<table><tbody><tr><td>(3-Aminopropil)trietoxissilano</td><td>Sigma-aldrich</td><td>440140</td><td></td></tr><tr><td>0,05 % Tripsina</td><td>Corning</td><td>25-051-CI</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2</td><td>frasco Corning</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>8 Centrífuga de bancada</td><td>Thermo</td><td>75007210</td><td></td></tr><tr><td>A1R sistema confocal</td><td>Nikon</td><td>HD25</td><td></td></tr><tr><td>Ácido</td> <td>acéticoSigma-aldrich</td><td>695092</td><td>glacial, reagente ACS, &ge; 99,7%</td></tr> <tr><td>Células BEAS-2B (B2B)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>95102433</td><td>células epiteliais humanas do tecido pulmonar</td></tr><tr><td>Microesferas modificadas com carboxilato</td><td>Invitrogen</td><td>F8797</td><td></td></tr><tr><td>Meio de cultura (RPMI-1640)</td> <td>Computador</td> desktop <td>Gibco 11875093</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Dell</td><td>2018</td><td>com sistema operacional Windows 10</td></tr><tr><td>Câmara ambiental TIZB</td><td>Tokai Hit</td><td>TIZB</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina Proteína Humana, Plasma</td><td>Gibco</td><td>33016015</td><td></td></tr><tr><td>Fiji ImageJ</td><td>National Institutes of Health e o Laboratório de Instrumentação Óptica e Computacional</td><td>1.53k</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri com fundo de vidro</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>HEPES tamponado solução salina</td><td>Sigma-aldrich</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>Solução de hidrato de hidrazina</td><td>Sigma-aldrich</td><td>53847</td><td></td></tr><tr><td>IntelliJ IDEA</td><td>JetBrains</td><td>2020</td><td>Plataforma de desenvolvimento</td></tr><tr><td>Java Kit de desenvolvimento</td><td>Java Oracle</td><td>14.0</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimtech Science</td><td>3066-05</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>2020b</td><td></td></tr><tr><td>Monocromático&nbsp; Câmera</td><td>FLIR</td><td>BFS-U3-70S7M-C</td><td></td></tr><tr><td>MycoAlert Kit de detecção de micoplasma</td><td>Lonza</td><td>LT07-218</td><td></td></tr><tr><td>N,N&prime;-solução de metilenobisacrilamida</td><td>Sigma-aldrich</td><td>M1533</td><td></td></tr><tr><td>Plataforma de software NIS-Elements</td><td>Plataforma de</td><td>software</td>Nikon <td>4.50</td></tr><tr><td>Origin</td><td>OriginLab</td><td>OriginPro 2017 (Learning Edition)</td><td>análise de dados e software gráfico</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>células PC9</td><td>Sigma-aldrich</td><td>90071810</td><td>células de adenocarcinoma humano do tecido pulmonar</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td> <td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA polimerase de alta fidelidade</td><td>New England Biolabs</td><td>&nbsp; F-553S</td><td>DNA polimerase de alta fidelidade</td></tr><tr><td>Fita adesiva</td> Fita <td>adesiva</td><td>escocesa</td><td></td></tr><tr><td>Solução de dodecil sulfato de sódio</td><td>Sigma-aldrich</td><td>05030</td><td></td></tr><tr><td>Super cola</td><td>Cola de cianoacrilato</td><td>gorila</td><td></td></tr><tr><td>Ti2-E microscópio invertido</td><td>Nikon</td><td>MEA54000</td><td></td></tr><tr><td>TI2-S-SE-E Platina motorizada com codificador</td><td>Nikon</td><td>MEC56120</td><td></td></tr><tr><td>&mu; Software de</td><td>microscopia de código aberto</td> <td>gama versão 2.0</td> do Manager <td></td> (https://micro-manager.org/)</tr></tbody></table>

interrogatório de mecanobiologia totalmente óptica de proteína associada a sim em câncer humano e células normais usando um sistema multifuncional

All-optical Mechanobiology Interrogation of Yes-associated Protein in Human Cancer and Normal Cells using a Multi-functional System

Imagens multifuncionais de longo prazo e análises de células vivas requerem coordenação funcional e simplificada de várias plataformas de hardware e software. No entanto, o controle manual de vários equipamentos produzidos por diferentes fabricantes é intensivo em mão-de-obra e demorado, potencialmente diminuindo a precisão, reprodutibilidade e qualidade dos dados adquiridos. Portanto, um sistema all-in-one e programável ao usuário que permite a aquisição automática, multifuncional e de longo prazo de imagens e é compatível com a maioria das plataformas de microscopia fluorescentes pode beneficiar a comunidade científica. Este artigo introduz os protocolos operacionais completos de utilização de um novo sistema de software integrado que consiste em (1) um programa de software construído em casa, intitulado "Automatic Multi-funcional Integration Program (AMFIP)", que permite a aquisição automática de imagens multicanais e (2) um conjunto de análise quantitativa de imagens e pacotes de computação de tração celular. 
Este sistema integrado é aplicado para revelar a relação até então desconhecida entre a distribuição espaço-temporal da proteína associada à mecano-sensível ao Sim (YAP) e a mecânica celular, incluindo a disseminação e tração celular, em células normais humanas (B2B) e células cancerígenas de pulmão (PC9). Aproveitando a capacidade deste sistema de controle e leitura multicanal, o resultado mostra: (1) células normais B2B e células cancerígenas PC9 mostram uma relação distinta entre a expressão, tração e dinâmica celular do YAP durante os processos de disseminação e migração de células; e (2) as células cancerígenas PC9 aplicam forças peri-nucleares perceptíveis em substratos. Em resumo, este artigo apresenta um protocolo passo a passo detalhado sobre como utilizar um sistema integrado de programável ao usuário que permite que imagens e análises multifuncionais automáticas elucidam a sensibilidade mecano. Essas ferramentas abrem a possibilidade de explorações detalhadas da dinâmica de sinalização multifacetada no contexto da fisiologia celular e patologia.

Este artigo apresenta um protocolo passo a passo detalhado sobre como utilizar um sistema multifuncional e programável integrado ao usuário que permite que a imagem multicanal e a análise mecanobiológica automática e a elucidação da mecano-sensibilidade da proteína associada ao Sim (YAP).

Interrogatório de Mecanobiologia totalmente óptica de proteína associada a sim em câncer humano e células normais usando um sistema multifuncional

Long-term multi-functional imaging and analysis of live cells require streamlined, functional coordination of various hardware and software platforms. ...

Este método ajudará a ilustrar mecanismos moleculares de fenômenos biológicos multifacetados. Como a mecanobiologia, a eletrofisiologia óptica e a imagem de proteína de DNA/RNA de super-resolução usando técnicas automáticas de imagem de células vivas. Este protocolo permite a correção automática, multifuncional, de alta throughput, auto-deriva e aquisição de imagens a longo prazo.É compatível com a maioria das plataformas microscópicas fluorescentes, como a NYCOM. Quem tentar essa técnica pela primeira vez deve entender a função de cada passo, em vez de apenas seguir o protocolo estritamente, para garantir um experimento bem sucedido. Comece colocando a câmara ambiental no estágio motorizado do microscópio invertido.Ajuste a vazão de CO2 para 160 mililitros por minuto e ajuste a temperatura da câmara. Em seguida, adicione 40 mililitros de água purificada no banho da câmara. Retire a placa de Petri com células da incubadora e coloque-a na câmara do ambiente.Ligue o controlador confocal e o microscópio invertido. Mude o caminho da luz para a direita. Observe as células anexadas usando Micro Manager.Se células suficientes tiverem sido anexadas ao gel, transfira a placa de Petri de volta para a incubadora. Caso não, continue a incubação celular por mais 30 minutos para B2B, e 60 minutos para câncer de pulmão ou células PC-9. Corte 2 pequenos pedaços de fita adesiva e coloque-os na câmara ao redor do orifício circular.Em seguida, aplique um pouco de cola adesiva na área da fita que a placa de Petri cobrirá. Tire a placa de Petri da incubadora. Coloque lentamente a placa de Petri na câmara e deixe o fundo da placa fazer contato com a cola.Pressione a tampa da placa de Petri por 1 minuto para permitir que a cola faça contato total com a placa de Petri e solidifique. Empurre suavemente a placa de Petri horizontalmente para garantir que a cola se solidificou e que a placa de Petri não se mova. Em seguida, feche a tampa da câmara.Abra o IntelliJ e defina um parâmetro T1 na linha 93 do arquivo elements_script.java. Certifique-se de que esse valor é maior do que o tempo de execução da macro e elementos usados para imagens confocal de um campo de visão. Clique no botão Executar para iniciar o projeto AMFIP IntelliJ.Clique no botão ao vivo e multi-desaquisição na interface principal do Micro Manager e, em seguida, alterne o caminho de luz do microscópio invertido para a direita para imagens de campo brilhante. Mude para o objetivo de 10 vezes e abra a luz LED com a intensidade definida em 5%Clique no objetivo do microscópio de caminho de luz e botão de lâmpada LED no painel TI2 elementos. Ajuste o joystick XY e o botão do plano Z para encontrar a posição correta e o plano de foco em ajuste do gel na placa de Petri.Use o objetivo de 10 vezes para encontrar os campos de visão apropriados de múltiplas células únicas ligadas ao gel. Verifique as várias posições caixa XY na janela de aquisição multidimensional. Clique no botão lista de posição de edição e observe a janela da lista de posição do estágio que aparece.Altere o objetivo para 40 vezes, aumente a intensidade da luz LED para 15% Reajuste o estágio motorizado XY para localizar os campos de exibição e registrar as coordenadas clicando no botão de marcação na janela da lista de posição do palco. Recorde de 6 a 7 campos de visão desejados. Clique no botão salvar como botão na janela da lista de posição do palco para gravar as coordenadas e inserir O T1 como a seção de intervalo de tempo da aquisição de imagens para T1 na seção de ponto de tempo na janela de aquisição multidimensional.Abra elementos, altere o caminho da luz para a direita para imagens confocal e desligue a luz LED. Em seguida, clique no botão remover o bloqueio e ligue o canal laser FITC para imagens YAP verificando a caixa FITC. Depois de ajustar a velocidade de varredura para 1 quadro por 2 segundos, gire o botão do plano Z para encontrar a posição Z das células anexadas rapidamente.Regisso dos limites inferior e superior para a pilha Z. Clique em macro na fita superior, selecione editor de macro no menu suspenso de macro e insira os limites inferiores e superiores para a pilha Z em um arquivo macro. Ligue o canal laser DAPI para imagens de contas verificando a caixa DAPI para encontrar e registrar a posição Z focada das contas.Vá para o editor de macro e insira os valores registrados no arquivo macro. Para definir a tarefa de mover o estágio motorizado usando o AMFIP, vá para Micro Manager, clique em automação plug-ins para abrir a interface gráfica de usuário do AMFIP. Em seguida, clique em adicionar ponto ou remover botões de ponto para adquirir o número exato de campos de exibição selecionados.Insira as coordenadas gravadas dos campos de visão no painel de coordenadas. Defina o tempo total de experiência no campo total de texto de tempo de experiência. Clique no botão de configuração de tempo adicional e defina o intervalo de tempo T2 de mover o estágio motorizado para cada FOV.Maximize o tamanho da janela dos elementos e arraste a GUI de AMFIP para o lado direito da tela para evitar que a GUI perturna as operações automáticas do cursor e clique no botão de digitar. Depois que a primeira macro terminar. clique no botão de aquisição na janela de aquisição multidimensional.Depois de terminar a imagem de longo prazo, pare a tarefa AMFIP clicando no botão de pausa na janela de plug-in de automação e no botão stop na janela de aquisição multidimensional. Abra elementos e defina imagens de pilha Z clicando nos botões superior e inferior na janela de aquisição ND. Mude o caminho da luz para a direita e abra a luz LED.Retire lentamente e cuidadosamente as tampas da câmara e da placa de Petri enquanto monitora a visão de campo brilhante para qualquer deriva do campo de visão. Use uma pipeta de plástico para pegar 0,5 mililitros de solução SDS. Segure cuidadosamente a pipeta de plástico um pouco acima do meio de cultura na placa de Petri e adicione 1 a 2 gotículas da solução SDS no meio da cultura.Uma vez que as células e a visão de campo brilhante sejam dissolvidas, feche a luz LED, mude o caminho da luz para a esquerda, clique no botão remover intertravamento. Execute a imagem da pilha Z e salve a pilha de imagens como reference_N, onde N é o número de sequência de cada campo de exibição. Clique no botão XY de várias posições na janela de aquisição multidimensional.Em seguida, selecione o próximo campo de exibição e clique no botão go-to para mover o estágio motorizado para o segundo FOV. Repita esta etapa para cada campo de visão. A localização nuclear é de proteína associada a sim ou YAP em ells B2B aumentado com o aumento da rigidez do substrato, enquanto as células PC-9 mostraram concentração yap semelhante no núcleo e citoplasma em substratos de rigidez variada.A célula B2B aumentou monotonicamente a área de disseminação ao longo do tempo, juntamente com uma diminuição na relação nuclear yap para citoplasmica, enquanto a célula PC-9 manteve uma área de propagação celular relativamente imutável, orientação e razão nuclear YAP para citoplasmática durante o processo de disseminação de 10 horas. Durante a duração de 10 horas da propagação precoce, a célula B2B representativa deformou constitutivamente a superfície do substrato e aplicou tempo evoluindo a tração celular em toda a área celular. Em contraste, a célula PC-9 representativa só desenvolveu deslocamento e tração nas 2 extremidades do corpo celular, e sua tração diminuiu após 7,5 horas.A relação nuclear yap para citoplasmica e tração dipolo de células B2B pareciam seguir duas tendências distintas, sugerindo que poderia ter havido dois grupos de células B2B que coexistiram no experimento. No primeiro grupo, a relação nuclear-citoplasmica yap e tração dipolo aumentou junto com o alargamento da área de propagação celular e atingiu sua máxima em aproximadamente 1.000 micrômetros quadrados. No segundo grupo, a relação nuclear-citoplasmica e a tração do dipolo aumentaram a uma taxa mais lenta com o alargamento da área de propagação celular e mantiveram valores quase constantes quando a área de propagação celular continuou a aumentar.As faixas de pilha Z para todos os canais laser precisam ser determinadas cuidadosamente para superar a deriva potencial do campo de visão durante o movimento do palco em imagens de longo prazo. Esta nova técnica permite imagens automáticas, não invasivas a longo prazo e multiposição, e pode ajudar a elucidar mecanismo de biologia molecular que requer rastreamento temporal e espacial de células e organelas.

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Bioengineering

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Interrogatório de Mecanobiologia totalmente óptica de proteína associada a sim em câncer humano e células normais usando um sistema multifuncional

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