Name: Limpeza Seletiva de Nematodes de Caenorhabdite Selvagem para Enriquecer para Bactérias do Microbioma Intestinal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Aprenda a enriquecer microrganismos não cultiváveis do intestino de nematódeos Caenorhabditis selvagens utilizando a resistência da cutícula do estágio dauer. Este método permite identificar novas bactérias do microbioma e estudar interações hospedeiro-microbioma.

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Obrigado ao Dr. Christian Braendle e ao Centre Nationale de la Recherche Scientifique (CNRS) Nouragues Field Station.

1. Induzir formação de dauer para nematoides selvagens em placas de GNM
<ol><li>Cresça a cepa de Caenorhabditis selvagem em placas de GNM padrão com OP50-1 E. coli como fonte de alimento depois de obter os vermes com um micróbio não cultural de interesse. Incubar os nematoides a 20 °C. NOTA: A temperatura padrão para o cultivo De caenorhabditis os nematoides está entre 15-25 °C, mas deve ser determinada empiricamente para evitar a perda do micróbio de interesse.</li>
	<li>Esfue a placa dos animais a 20 °C por 4-5 dias até que todo o OP50-1 seja consumido e a maioria tenha chegado ao estágio dauer. NOTA: Os dauers são larvas de longa duração que se desenvolvem devido à ausência de nutrição e têm cutículas protetoras.</li>
</ol>2. Lavar os nematoides
<ol><li>Adicione 5 mL de m9 de mídia de sais mínimos (42 mM Na2HPO4, 22 mM KH2PO4, 8,6 mM NaCl, 19 mM NH4Cl) a uma placa de 6 cm de vermes famintos.</li>
	<li>Usando uma pipeta de vidro estéril e uma lâmpada, pipete o M9 e vermes da placa e transfira-os para um tubo de centrífuga estéril de 15 mL.</li>
	<li>Usando uma centrífuga clínica, gire os vermes no tubo a 1000 x g por 30 s em temperatura ambiente.</li>
	<li>Usando uma pipeta estéril de 15 mL, remova e descarte o supernatante M9 acima da pelota de vermes. Não perturbe os vermes vivos na parte inferior do tubo deixando aproximadamente 50 μL de M9 acima dos vermes.</li>
	<li>Adicione 10 mL de M9 + 0,05% de Triton X-100 ao mesmo tubo de centrífuga e aperte adequadamente a tampa do tubo.</li>
	<li>Incubar o tubo em um nutador por 20 minutos à temperatura ambiente para remover os micróbios externos. Remova o tubo do nutador e gire os vermes a 1000 x g para 30 s.</li>
	<li>Usando uma pipeta estéril, remova e descarte o supernatante M9 acima da pelota de vermes. Não perturbe os vermes vivos na parte inferior do tubo deixando aproximadamente 50 μL de M9 acima dos vermes.</li>
	<li>Siga e repita os passos 2.5-2.8 mais três vezes.</li>
</ol>3. Desinfetar os nematoides
<ol><li>Prepare uma solução antibiótica e SDS em 10 mL de tampão M9 adicionando 0,25% SDS (250 μL de 10% SDS), 50 μg/mL de carbenicilina, 25 μg/mL de kanamicina, 12,5 μg/mL de tetraciclina, 100 μg/mL de gentamicina, 50 μg/mL de estreptomicina, 37,5 μg/mL de clororamfenicol, e 200 μg/mL de cefotax (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Incubar o tubo contendo nematoides na solução antibiótico e SDS em um nutador à temperatura ambiente durante a noite. NOTA: Todos os vermes e embriões não-dauer morrerão, mas muitos dos vermes dauer sobreviverão a este processo de limpeza.</li>
</ol>4. Remoção da solução antibiótica e SDS
<ol><li>Gire os vermes no tubo a 1000 x g por 1 min a temperatura ambiente. Usando uma pipeta estéril, remova o supernasal do tubo centrífuga sem perturbar os vermes na parte inferior do tubo.</li>
	<li>Adicione 10 mL de M9 + 0,05% Triton X-100 e aperte adequadamente a tampa do tubo. Incubar o tubo em um nutador por 20 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Remova o tubo do nutador e gire os vermes a 1000 x g por 1 min. Siga e repita os passos 4.2-4.3 três vezes.</li>
	<li>Após a última lavagem, deixe a pelota de verme imperturbável na parte inferior em 100 μL da solução e descarte o resto.</li>
</ol>5. Propagar uma cepa de nematoide limpo
<ol><li>Utilizando uma pipeta de vidro estéril, transfira 100 μL do supernante e a pelota para o centro de uma placa NGM de 10 cm semeada com OP50-1. Deixe a placa secar sem perturbar o líquido no centro.</li>
	<li>Permita que os dauers rastejem para fora do centro e através do gramado OP50-1 por 5-10 min.</li>
	<li>Pegue cuidadosamente um único dauer e coloque-o em uma placa semeada de 6 cm NGM. No total, escolha pelo menos 10 dauers e emplaque-os em placas individuais de 6 cm NGM semeadas com OP50-1 (10 placas no total).</li>
	<li>Incubar as placas por 4-5 dias a 20 °C até que os dauers tenham crescido e a geração seguinte (F1) tenha chegado à fase adulta. Verifique visualmente se há contaminação em todas as placas, vistas como crescimento microbiano não-OP50-1.</li>
	<li>Para cada placa limpa, verifique a propagação do micróbio de interesse via Normarski ou microscopia fluorescente, como a hibridização fluorescente in situ (FISH)12, dependendo do fenótipo de interesse.</li>
</ol>6. Dissecção intestinal e identificação de PCR de espécies microbianas
<ol><li>Cresça animais a 20 °C por 3-4 dias para permitir que eles desamarrem e reduzam a quantidade de bactérias OP50-1. Adicione 5 mL de mídia M9 ao prato de vermes famintos.</li>
	<li>Usando uma pipeta de vidro estéril e uma lâmpada, pipete os vermes M9 + da placa e transfira-os para um tubo de centrífuga estéril de 15 mL.</li>
	<li>Usando uma centrífuga clínica, gire os vermes no tubo a 1000 x g por 30 s em temperatura ambiente.</li>
	<li>Usando uma pipeta estéril de 15 mL, remova o supernatante do tubo centrífuga sem perturbar os vermes vivos na parte inferior do tubo.</li>
	<li>Adicione 10 mL de M9 + 0,05% Triton X-100 e incuba o tubo em um nutador por 20 minutos para remover micróbios externos. Repita quatro vezes para lavar os vermes.</li>
	<li>Após a última lavagem, usando uma ponta de pipeta estéril, remova o sobrenatante sem perturbar a pelota na parte inferior em 100 μL da solução.</li>
	<li>Usando uma ponta de pipeta estéril, transfira M9 e os vermes para uma placa ngm não semeada e deixe a placa secar enquanto os vermes rastejam por 20 minutos para ajudar a remover OP50-1 da cutícula e do intestino.</li>
	<li>Adicione 250 μL de M9 à placa seca e use uma pipeta de vidro para transferir M9 + worms para uma nova placa NGM não semeada. Mais uma vez, deixe essa placa secar e deixe os vermes rastejarem por 20 minutos.</li>
	<li>Adicione 250 μL de M9 à placa e transfira 100 μL dos M9 + worms para um vidro de relógio limpo.</li>
	<li>Usando duas agulhas de seringa estéreis de 26 G, decapite os nematoides segurando o verme com uma agulha e usando a outra agulha para cortar o verme. Após a decapitação, o intestino (granular) e a gônada (transparente) do corpo sairão naturalmente do corpo.</li>
	<li>Corte um pedaço do intestino exposto segurando o intestino com uma agulha e cortando-o com o outro. NOTA: Se possível, verifique se o micróbio de interesse ainda está presente em intestinos sempreados usando microscopia normarski, FISH ou imunohistoquímica23.</li>
	<li>Transfira um único intestino dissecado em um tubo PCR de 0,5 mL contendo 10 μL de água estéril. Repita para um total de pelo menos 5 tubos PCR contendo intestinos de diferentes animais.</li>
	<li>Congele os tubos PCR a -80 °C por um mínimo de 5 min. Retire os tubos PCR do congelador e descongele as amostras.</li>
	<li>Pipeta o líquido para cima e para baixo algumas vezes para separar as bactérias do intestino.</li>
	<li>Conduzir PCR usando pares de primer universais contra a sequência de DNA da pequena subunidade ribossômica de bactérias, leveduras ou microsporidia, dependendo do tipo suspeito de micróbio. NOTA: Por exemplo, um protocolo amostral usando primers universais bacterianos 16S é apresentado na Tabela 1.</li>
	<li>Purifique o amplicon usando um kit de limpeza e concentração de DNA baseado em filtro (ver Tabela de Materiais) e realize o sequenciamento Sanger.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Este protocolo descreve o isolamento e identificação de micróbios de nematoides de Caenorhabditis isolados silvestres utilizando uma série de procedimentos de limpeza. Numerosos micróbios estão associados a nematoides isolados selvagens, e alguns deles têm fenótipos excitantes que podem ser usados para estudos futuros em interações hospedeira-micróbios e imunidade inata. Muitos microbiomas culturais e bactérias patogênicas foram isolados de nematodes de Caenorhabditis selvagens usando técnicas padrão para crescimento bacteriano in vitro25,26. No entanto, nem todos os micróbios podem ser cultivados in vitro, e torna-se necessário enriquecê-los em nematoides selvagens. Alguns micróbios têm um estágio de esporo resistente, como a microsporidia, e altas concentrações de SDS podem ser usadas para matar a maioria das bactérias e fungos, permitindo o enriquecimento específico dos esporos12. Este protocolo apresenta um método para enriquecer micróbios intestinais não culturais que não são resistentes à SDS e ao tratamento com antibióticos.
A técnica aqui apresentada aproveita a resistência ambiental vista em animais dauer devido a alterações fisiológicas como fortalecimento da cutícula, supressão do bombeamento faringeal e cobertura da boca com um plugue bucal27. Um passo crítico neste protocolo é a incubação noturna com vários antibióticos e 0,25% de SDS. Esta etapa é usada para matar todos os micróbios externos, deixando micróbios internos intactos. Embora os dauers C. elegans tenham sido demonstrados para sobreviver às concentrações de SDS tão altas em 10% para 30 min27, este protocolo usa uma incubação moderada, mas prolongada, para não apenas matar micróbios, mas expor ainda mais bactérias a antibióticos. Além disso, uma concentração moderada de SDS pode ajudar a garantir que dauers de outras espécies de Caenorhabditis sobrevivam, pois a exposição de C. tropicalis a 1% de SDS durante a noite resultou na morte de todos os animais dauer. Se todos os dauers morrerem, então a concentração de SDS e/ou o tempo de exposição ao SDS devem ser reduzidos. Por outro lado, se as placas de geração F1 ainda tiverem contaminação visível após a limpeza, o tempo de concentração e incubação da SDS deve ser aumentado.
Outro passo crítico é o isolamento de animais dauer solteiros após a limpeza. Este passo é crucial, pois nem todos os animais estão limpos após a SDS e o tratamento com antibióticos. Portanto, os animais são colocados no centro de uma placa NGM de 10 cm com OP50-1 e autorizados a rastejar radialmente para fora. Muitas vezes é melhor escolher mais animais distais, pois o rastreamento estendido através do OP50-1 parece ajudar a remover quaisquer micróbios sobreviventes potenciais ligados à cutícula. No entanto, isso leva a uma limitação do protocolo, pois será mais desafiador enriquecer para um micróbio de interesse se ele não estiver presente na população em alta frequência. Aqui, a adesão da Alphaproteobacteria esteve presente em 90%-95% da população; portanto, a maioria das placas limpas tinha a bactéria do microbioma. No entanto, se um micróbio de interesse estiver presente em uma frequência muito menor na população, pode ser necessário tela de muito mais placas de F1 .
Este protocolo provavelmente poderia ser usado para isolar qualquer número de micróbios não culturais de interesse encontrados em nematoides selvagens. No entanto, o micróbio deve estar em um tecido protegido pela cutícula dauer, capaz de sobreviver em animais dauer, e ter um fenótipo observável no hospedeiro. Como tal, essa técnica pode ser usada para enriquecer outras bactérias microbioma no lúmen intestinal além das espécies de Alfaproteobactérias descritas aqui, incluindo bactérias que não aderem. Além disso, o protocolo foi utilizado para enriquecer para uma bactéria intracelular facultativa, Bordetella atropi, que infecta o nematode Oscheius tipulae28. Após o enriquecimento, B. atropi foi encontrado para formar colônias em placas de NGM, mostrando que um micróbio de interesse pode ser descoberto como culturalável in vitro uma vez que contaminantes de crescimento mais rápido são removidos. Essa técnica provavelmente funcionaria para microsproidianos e vírus, incluindo o vírus Orsay, dada essa capacidade de enriquecer uma bactéria intracelular. No entanto, esses micróbios devem ser capazes de sobreviver à transição para dentro e para fora do dauer.
É importante lembrar que, embora este protocolo possa ser realizado em um laboratório de Biossegurança Nível 1, uma técnica estéril deve ser mantida em todo o processo para evitar contaminação microbiana. O protocolo pode ser alterado de acordo com as necessidades do pesquisador, incluindo os tipos/concentrações de antibióticos, a porcentagem de SDS e/ou a adição de antifúngicos, como a nystatina. Muitas vezes, o número de micróbios contaminantes encontrados em um nematoide isolado selvagem pode variar drasticamente. Aqui, a perda aparente do crescimento não-OP50-1 E. coli em placas de NGM foi usada como leitura para uma cepa de nematoide limpa. Mas, pode haver populações não culturais de micróbios contaminantes presentes, por isso é essencial realizar um método de metagenômica, como o sequenciamento de amplicon de rRNA 16S para ver a extensão da contaminação26. Uma vez que a cepa de verme é limpa, ela pode ser congelada e armazenada para estudos futuros. No geral, este protocolo permite que os pesquisadores enriqueçam micróbios não culturais em nematoides selvagens, permitindo-lhes estudar efeitos sobre o condicionamento físico hospedeiro, caracterizar fenótipos de colonização ou infecção, e aproveitar ferramentas genéticas para entender os mecanismos subjacentes às interações hospedeiro-micróbios.

O organismo modelo genético C. elegans é um excelente sistema in vivo para estudar interações hospedeiro-micróbio1,2. Eles têm fisiologia relativamente simples em comparação com outros animais, no entanto, grande parte de sua biologia celular é fundamentalmente semelhante aos mamíferos tornando-os um bom modelo para pesquisas biológicas1,3,4. Além disso, são microscópicas, fáceis de manter e permanecem transparentes ao longo de sua curta vida útil. Essas propriedades permitem estudos rápidos sobre os mecanismos que regem as interações hospedeiro-micróbio e a visualização da infecção in vivo e a colonização dos hospedeiros geneticamente flexíveis5,6. Finalmente, C. elegans responde rapidamente a infecções bacterianas, fúngicas e virais, tornando-as um excelente modelo para estudar interações hospedeira-micróbio e o microbioma intestinal7,8,9.
Um aumento na amostragem de C. elegans selvagens e outros nematoides permitiu pesquisas sobre a ecologia de nematoides de vida livre e variação genética natural10,11. Simultaneamente, a amostragem também aumentou a descoberta de patógenos biológicos e micróbios que interagem naturalmente com C. elegans12,13,14,15, levando ao estabelecimento de muitos sistemas modelo de micróbios hospedeiros que estudam interações com vírus, bactérias, microsporidia, oomycetes ou fungos16,17,18,19,20 . Tipicamente, c. elegans selvagens são encontrados em caules e frutas podres, muitas vezes em climas mais temperados, e principalmente eles são auto-reprodução21. Quando essas amostras são trazidas para o laboratório, nematoides selvagens são isolados em populações clonais, carregando uma matriz de microbiota associada. Ao descobrir novos micróbios de interesse em nematoides caenorhabditis, os animais são frequentemente diretamente rastreados para infecção ou colonização por microscopia usando fenótipos facilmente visualizados. Por exemplo, a infecção viral pode ser visualizada como uma desintegração das estruturas intestinais, e os estágios microsporíduos podem ser vistos dentro das células hospedeiras como esporos ou meronts14,22. Quando um micróbio de interesse é descoberto para futura investigação, ele deve ser separado dos outros micróbios contaminantes encontrados nos nematoides selvagens para que possa ser estudado isoladamente. Em muitos casos, o micróbio de interesse não pode ser cultivado in vitro, tornando essencial enriquecer o micróbio no nematoide hospedeiro.
Por exemplo, este protocolo descreve um isolado selvagem de C. tropicalis contendo uma bactéria que coloniza dentro do lúmen intestinal de nematoides, aderindo às células epiteliais intestinais de forma direcional. Fenotipicamente, a bactéria cresce perpendicular ao longo dos lados internos do lúmen intestinal, dando-lhe uma aparência cerdas, visualizada em um microscópio normarski padrão em todas as fases do animal, incluindo o estágio dauer. A placa de crescimento do nematoide (NGM) na qual esta cepa selvagem C. tropicalis foi cultivada continha contaminação visível com outros micróbios. Este protocolo foi desenvolvido para reduzir o crescimento microbiano contaminante adicional nas placas para estudar essa bactéria de adesão desconhecida. Os nematoides foram forçados a entrar na fase dauer para proteger as bactérias no lúmen, e depois limpos usando uma série de lavagens. Posteriormente, as espécies bacterianas desconhecidas foram identificadas por dissecção dos intestinos e amplificação pcr do DNA ribossômico 16S para sequenciamento.
No geral, este protocolo pode potencialmente enriquecer qualquer micróbio de interesse associado a um nematoide capturado selvagem. Posteriormente, os pesquisadores identificarão o micróbio alvo, visualizarão fenótipos de infecção in vivo ou colonização por meio de microscopia e estudarão efeitos sobre o condicionamento físico hospedeiro ou outros aspectos das interações hospedeiro-micróbios. O isolamento e a investigação de novas espécies microbianas que interagem com nematoides caenorhabditis podem descobrir os mecanismos genéticos da imunidade hospedeira e novos paradigmas das interações hospedeira-micróbios relevantes para estudos de patogênese microbiana e microbioma.

<table><tbody><tr><td>Agulha PrecisionGlide Fisher</td><td>Scientific</td><td>BP1356</td><td></td></tr><tr><td>10% SDS</td><td>Invitrogen</td><td>AM9822</td><td></td></tr><tr><td>BD - 26 G</td><td>Fisher Scientific</td><td>305115</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicilina</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C1389-1G</td><td></td></tr><tr><td>Cefotaxima</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C7039-500mg</td><td></td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Kit de limpeza e concentrador de DNA Millipore-Sigma</td><td>C0378-25G</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Pesquisa Zymo</td><td>11-303C</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Polimerase</td><td>Fisher Scientific</td><td>EP0711</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Millipore-Sigma</td><td>G1264-250mg</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Millipore-Sigma</td><td>K1876-1G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P-286</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S-671</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-661</td><td></td></tr><tr><td>Estreptomicina</td><td>Millipore-Sigma</td><td>S6501-50G</td><td></td></tr><tr><td>Tetraciclina</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T7660-5G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-151</td><td></td></tr><tr><td>Óculos de relógio</td><td>VWR</td><td>470144-850</td><td></td></tr></tbody></table>

limpeza seletiva de nematodes de caenorhabdite selvagem para enriquecer para bactérias do microbioma intestinal

Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria

Caenorhabditis elegans (C. elegans) tem se mostrado um excelente modelo para estudar interações hospedeira-micróbio e microbioma, especialmente no contexto dos intestinos. Recentemente, a amostragem ecológica de nematodes de Caenorhabditis selvagem descobriu uma variedade diversificada de micróbios associados, incluindo bactérias, vírus, fungos e microsporidia. Muitos desses micróbios têm fenótipos interessantes de colonização ou infecção que justificam um estudo mais aprofundado, mas muitas vezes não são culturais. Este protocolo apresenta um método para enriquecer os micróbios intestinais desejados em C. elegans e nematoides relacionados e reduzir a presença dos muitos micróbios contaminantes aderindo à cutícula. Este protocolo envolve forçar os animais para o estágio dauer de desenvolvimento e usar uma série de lavagens de antibióticos e detergentes para remover a contaminação externa. Como os animais dauer têm alterações fisiológicas que protegem nematoides de condições ambientais severas, quaisquer micróbios intestinais serão protegidos dessas condições. Mas, para o enriquecimento funcionar, o micróbio de interesse deve ser mantido quando os animais se desenvolvem em dauers. Quando os animais saem do estágio dauer, eles são singly propagados em linhas individuais. As populações de F1 são então selecionadas para micróbios desejados ou fenótipos de infecção e contra contaminação visível. Esses métodos permitirão aos pesquisadores enriquecer micróbios não culturais no lúmen intestinal, que compõem parte do microbioma natural de C. elegans e patógenos intestinais intracelulares. Esses micróbios podem então ser estudados para os fenótipos de colonização ou infecção e seus efeitos sobre o condicionamento físico hospedeiro.

Uma cepa selvagem de C. tropicalis (JU1848) foi isolada de frutas podres de palmeiras na Floresta nouragues da Guiana Francesa (Figura 1A)24. Esta cepa foi encontrada com micróbios finos que colonizam o lúmen do intestino de forma direcional (Figura 1B). Este micróbio foi facilmente transferido para C. elegans tensão N2 via co-cultura com cepa JU1848, onde colonizou o lúmen do intestino da mesma forma.
A propagação de JU1848 em placas padrão de GNM semeadas com E. coli OP50-1 ao longo de várias gerações resultou continuamente em contaminação visível, vista como várias colônias escuras e mucoides dentro e fora do gramado OP50-1 (Figura 2A). Um prato de JU1848 selvagem estava faminto para forçar os animais a entrar em dauer e limpos como descrito. Os animais dauer único que sobreviveram à limpeza foram banhados em placas ngm individuais de 6 cm semeadas com OP50-1 e permitidas a crescer por 4 dias a 20 °C. Foram observadas múltiplas placas de progênero F1 sem contaminação microbiana visível (Figura 2B). Verificou-se que a prole f1 ainda contém bactérias aderindo no lúmen do intestino (veja abaixo).
Animais JU1848 limpos foram lavados e decapitados para isolar peças intestinais conforme descrito no protocolo (etapas 6.1-6.12). A adesão de bactérias no lúmen do intestino dissecado foi verificada através de microscopia de Nomarski (Figura 3). Suspeita-se que o micróbio no lúmen de JU1848 seja uma bactéria, por isso os intestinos dissecados foram usados como modelo para PCR usando primers universais bacterianos 16S, 27F e 1492R. De um total de seis intestinos dissecados individuais, os produtos PCR foram sequenciados via Sanger, e cromatógrafos limpos mostraram que todas as seis sequências eram idênticas. Com base nessas sequências, esta bactéria foi identificada como uma nova espécie na classe Alphaproteobacteria, mas não pôde ser classificada em uma ordem ou gênero conhecido (Arquivo Suplementar 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62937/62937fig01.jpg"> Figura 1: Bactérias de adesão colonizando o lúmen de um C. tropicalis selvagem. (A) Imagem amostra de campo de frutas podres de euterpe sp. (Família: Arecaceae) na floresta nouragues da Guiana Francesa. (B) Imagem nomarski da cepa JU1848 vista com milhares de bactérias longas e finas que formam uma aparência de pincel no lúmen (lúmen) do intestino hospedeiro (in). As camadas bacterianas (ba) que revestiam o intestino são indicadas com suportes ([). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62937/62937fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62937/62937fig02.jpg"> Figura 2: A contaminação do crescimento microbiano é perdida após a limpeza do nematoide. (A) A cepa selvagem JU1848 propaga crescimento microbiano perceptível em placas padrão de GNL de 6 cm semeadas com bactérias E. coli OP50-1. (B) Após a limpeza, uma placa de prole F1 de um único dauer não mostra contaminação microbiana visível após 4 dias de incubação a 20 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62937/62937fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62937/62937fig03.jpg"> Figura 3: As bactérias de adesão são vistas no lúmen do intestino dissecado. Imagem de Nomarski de um animal JU1848 limpo que foi decapitado para que os intestinos se espalham. As bactérias colonizadoras (ba) são indicadas com um suporte ([) e são vistas no lúmen (lúmen) de um pedaço do intestino (in) que está fora do corpo de nematoides (nb). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62937/62937fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagente</td>
			<td>Concentração</td>
			<td>Quantidade</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>2,5 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>2,5 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Intestino dissecado na água</td>
			<td>N/A</td>
			<td>3 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tampão PCR 10x</td>
			<td>10x</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTP</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>1 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Polimerase Taq</td>
			<td>5 U/μL</td>
			<td>0,5 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Água</td>
			<td>N/A</td>
			<td>35,5 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Teste o protocolo PCR usando primers bacterianos universais e intestino dissecado.
Arquivo suplementar 1: Alinhamento MUSCULAR de sequências de rDNA bacterianas 16S derivadas do PCR de seis intestinos JU1848 dissecados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62937/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Por favor, clique aqui para baixar este Arquivo.</a>

Os nematoides de Caenorhabditis selvagens estão associados a muitos micróbios, muitas vezes no lúmen intestinal ou infectando o intestino. Este protocolo detalha um método para enriquecer micróbios não culturais colonizando o intestino, aproveitando a resistência da cutícula dauer.

Limpeza Seletiva de Nematodes de Caenorhabdite Selvagem para Enriquecer para Bactérias do Microbioma Intestinal

Caenorhabditis elegans (C. elegans)&#160;has proven to be an excellent model for studying host-microbe interactions and the microbiome, especially in the ...

O método foi desenvolvido para facilitar o enriquecimento e identificação de um novo micróbio de interesse encontrado em nematoides de Caenorhabditis selvagens, permitindo uma investigação mais aprofundada sobre as interações de micróbios hospedeiros. A principal vantagem da técnica é que permite aos pesquisadores enriquecer para patógenos não culturados e bactérias microbioma diretamente no intestino de nematoides selvagens. Comece obtendo a cepa de caenorhabditis selvagem de nematoides com um micróbio incultural de interesse e crescendo os vermes em um meio de crescimento nematode padrão ou placas de NGM contendo OP51 Escherichia coli como fonte de alimento.Incubar os nematoides por quatro a cinco dias a 20 graus Celsius até que todo o OP51 Escherichia coli seja consumido e a maioria dos vermes tenha chegado ao estágio Dauer. Para lavar os nematoides no estágio Dauer, adicione cinco mililitros de m9 de luz mínima de sais à uma placa de seis centímetros de vermes famintos e use uma pipeta de vidro estéril e uma lâmpada para espercarar a mídia M9 e vermes da placa e transferi-los para um tubo de centrífuga de 15 mililitros estéril. Gire os vermes a 1.000 vezes G por 30 segundos à temperatura ambiente, depois remova e descarte o supernatante M9 acima da pelota de vermes usando uma pipeta estéril de 15 mililitros sem perturbar os vermes vivos deixando aproximadamente 50 microliters de M9 acima dos vermes.Ao mesmo tubo de centrífugas, adicione 10 mililitros da mídia M9 contendo 0,05% do Triton X-100 e aperte adequadamente a tampa do tubo antes de colocar o tubo em um Nutator à temperatura ambiente para remover os micróbios externos. Após 20 minutos de incubação no Nutator, gire os vermes a 1.000 vezes G por 30 segundos à temperatura ambiente, depois remova e descarte o supernatante M9 como demonstrado e repita o procedimento de lavagem três vezes com a mídia M9 contendo 0,05% de Triton X-100. Em seguida, incubar o tubo contendo nematoides durante a noite em um Nutator à temperatura ambiente adicionando o antibiótico recém-preparado e a solução de SDS.Após o tratamento com antibiótico, gire os vermes no tubo a 1.000 vezes G por um minuto à temperatura ambiente. Remova o supernatante antes de adicionar 10 mililitros de M9 contendo 0,05% Triton X-100 e aperte adequadamente a tampa para incubar o tubo em um Nutator por 20 minutos à temperatura ambiente. Uma vez feito, gire os vermes a 1.000 vezes G por um minuto e repita este procedimento três vezes.Após a quarta lavagem com o M9 contendo 0,05% Triton X-100, deixe a pelota de minhoca intacta em 100 microliters da solução e descarte o resto. Transfira 100 microliters do supernante e a pelota para o centro de uma placa NGM de 10 centímetros semeada com OP51 Escherichia coli. Deixe a placa secar sem ser perturbada enquanto os Dauers rastejam para fora do centro e através do gramado OP51 por 5 a 10 minutos.Pegue cuidadosamente um Dauer e coloque-o em uma placa NGM de seis centímetros semeada com OP51. Da mesma forma, placa pelo menos 10 Dauers em placas NGM individuais de seis centímetros semeadas com OP51. Incubar as placas por quatro a cinco dias a 20 graus Celsius até que Dauers tenha crescido e a geração seguinte F1s tenha chegado ao estágio adulto, em seguida, verifique visualmente se há contaminação em todas as placas.Para cada placa limpa, verifique a propagação do micróbio de interesse via Nomarski ou microscopia fluorescente dependendo do fenótipo de interesse. Para passar fome nos vermes e reduzir o número de bactérias OP51, incubar os nematoides a 20 graus Celsius por três a quatro dias. Adicione cinco mililitros da mídia M9 à placa de vermes recentemente famintos e, em seguida, transfira a mídia M9 e vermes para um tubo de centrífugo estéril de 15 milímetros para girar a 1.000 vezes G por 30 segundos à temperatura ambiente.Remova o supernatante antes de lavar os vermes cinco vezes com 10 mililitros do M9 contendo 0,05% Triton X-100 em um Nutator por 20 minutos. Após a última lavagem, remova o supernascer sem perturbar a pelota em 100 microliters da solução e transfira o M9 e os worms para uma placa NGM de seis centímetros não semeada. Deixe a placa secar enquanto os vermes rastejam por 20 minutos para ajudar a remover op51 da cutícula e do intestino.Quando a placa estiver seca, repita o procedimento adicionando 250 microliters do M9 e transferindo os vermes para uma nova placa NGM de seis centímetros não semeada para permitir que os vermes escorram enquanto a placa seca. Após 20 minutos, adicione 250 microliters do M9 à placa e transfira 100 microliters do M9 junto com vermes para um vidro de relógio limpo, em seguida, decapite os nematoides usando uma agulha de seringa calibre 26 enquanto segura o verme para baixo com outra agulha de seringa calibre 26. Uma vez decapitado, o intestino, uma massa granular e a gônada transparente naturalmente evitarão do corpo de nematoide, então cortarão um pedaço do intestino exposto e transferirão um único intestino dissecado em um tubo PCR de 0,5 mililitro contendo 10 microlitradores de água estéril.Repita o procedimento para coletar intestinos de pelo menos cinco animais diferentes em tubos PCR. Congele os tubos PCR a menos 80 graus Celsius por um mínimo de cinco minutos. Descongele as amostras do intestino antes de prosseguir com pcr e sequenciamento para identificação.Uma cepa de caenorhabditis tropicalis selvagem JU1848 foi encontrada com micróbios finos que colonizaram o lúmen do intestino de forma direcional. A cepa selvagem JU1848 propagou crescimento microbiano notável em placas padrão de NGM de seis centímetros semeadas com bactérias Escherichia coli OP51. Após a limpeza, uma placa de descendente de F1 de um único Dauer não mostrou contaminação microbiana visível após quatro dias de incubação.Na imagem de Nomarski de um animal JU1848 decapitado, as bactérias colonizadoras eram visíveis no lúmen de um pedaço do intestino que está fora do corpo de nematoide. Algumas espécies de Caenorhabditis podem exigir uma menor concentração de SDS para evitar a morte de Dauer. Para propagar uma cepa de nematoide limpa, escolha Dauers que rastejou mais longe do centro como rastreamento ajuda a remover contaminantes sobreviventes.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Taylor, M. N., et.al. Usando dados de verme único para quantificar a heterogeneidade nas interações Caenorhabditis elegans-bacterianas. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo demonstra a exposição de vermes Caenorhabditis elegans livres de germes e pareados por idade a uma cepa bacteriana para colonização intestinal. Explica a remoção seletiva de bactérias externas e não aderidas, deixando apenas bactérias viáveis aderidas ao epitélio intestinal para quantificação.

Avaliação da colonização bacteriana intestinal em C. elegans livre de germes

Fonte: Morgan, E., et al. Limpeza Seletiva de Nematoides Selvagens Caenorhabditis para Enriquecer Bactérias do Microbioma Intestinal. J. Vis. Exp. (2021)Este vídeo demonstra um protocolo para isolar bactérias intestinais de interesse de vermes selvagens Caenorhabditis . Os vermes são primeiro privados de fome e lavados para eliminar bactérias residuais de alimentação de sua superfície e lúmen intestinal, preservando os microrganismos alvo. Após a limpeza da superfície e múltiplas etapas de...

Limpeza Seletiva de Vermes Caenorhabditis para Enriquecimento da Microbiota Intestinal

Aqui, apresentamos o nemátodo Caenorhabditis elegans como modelo de acolhimento versátil para estudar a interação microbiana.

O nemátode Caenorhabditis Elegans - um modelo versátil na Vivo para estudar interações do anfitrião-micróbio

Este protocolo descreve um método para extrair eficientemente nematoides vivos de substratos naturais no campo.

Isolamento Rápido de Nematoides Selvagens por Baermann Funnel

Este protocolo pode ser usado para realizar levantamentos ecológicos em larga escala de nematodes caenorhabditis autodes . A principal vantagem desse método é a eficiente organização e análise de dados ecológicos e moleculares associados aos nematoides coletados da natureza.

Uma abordagem altamente escalável para realizar pesquisas ecológicas de nematodes de caenorhabditis

Micróbios intestinais, incluindo bactérias extracelulares e patógenos intracelulares como o vírus Orsay e microsporídios (fungos), são frequentemente associados a nematoides selvagens de Caenorhabditis . Este artigo apresenta um protocolo para detecção e quantificação de micróbios que colonizam e/ou infectam nematoides de C. elegans e para medir a carga de patógenos após infecções controladas em laboratório.

Hibridização in situ por fluorescência de RNA (FISH) para visualizar colonização microbiana e infecção em intestinos de Caenorhabditis elegans

Este protocolo descreve uma interrupção de 96 poços de caenorhabditis colonizada individualmente elegans após paralisia fria e branqueamento superficial para remover bactérias externas. A suspensão resultante é emplacada em placas de ágar para permitir quantificação precisa e média de carga bacteriana em um grande número de vermes individuais.

Usando dados de verme único para quantificar a heterogeneidade em Interações elegans-bacterianas de Caenorhabditis

O presente protocolo descreve um procedimento para isolar intestinos de vermes nematoides adultos Caenorhabditis elegans manualmente para entrada em genômica, proteômica, microbioma ou outros ensaios.

Dissecção da Mão de Caenorhabditis elegans Intestinos

Caenorhabditis elegans é uma das principais espécies modelo em biologia, mas quase todas as pesquisas são realizadas na ausência de seus micróbios naturalmente associados. Os métodos descritos aqui ajudarão a melhorar nossa compreensão da diversidade de micróbios associados como base para futuras pesquisas funcionais de C. elegans.

Isolamento e Caracterização da Microbiota Natural do Nematoide Modelo Caenorhabditis elegans

Os microcosmos de composto trazem a diversidade microbiana encontrada na natureza para o laboratório para facilitar a pesquisa do microbioma em Caenorhabditis elegans. Aqui são fornecidos protocolos para a criação de experimentos de microcosmos, com os experimentos demonstrando a capacidade de modular a diversidade microbiana ambiental para explorar as relações entre a diversidade microbiana ambiental e a composição do microbioma intestinal do verme.

Microcosmos de composto como ambientes microbianamente diversos e naturais para pesquisa de microbioma em Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans é um modelo poderoso para examinar os determinantes moleculares que conduzem as interações hospedeiro-microbioma. Apresentamos um pipeline de alto rendimento traçando o perfil dos níveis de colonização do microbioma intestinal em um único animal, juntamente com os principais aspectos da fisiologia de C. elegans.

Aplicação da Vermimetria de Fluxo na Quantificação e Análise do Microbioma Intestinal de Caenorhabditis elegans

Aprenda a enriquecer microrganismos não cultiváveis do intestino de nematódeos Caenorhabditis selvagens utilizando a resistência da cutícula do estágio dauer. Este método permite identificar novas bactérias do microbioma e estudar interações hospedeiro-microbioma.

Limpeza Seletiva de Nematodes de Caenorhabdite Selvagem para Enriquecer para Bactérias do Microbioma Intestinal

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