DUCT: Fundição de Resina Dupla seguida de Tomografia Microcomputada para Análise hepática 3D

Este método nos permite analisar, visualizar e quantificar a arquitetura de sistemas vasculares e biliares hepáticos em 3D. Agora podemos entender melhor os aspectos espaciais da doença hepática e da regeneração. A principal vantagem dessa técnica é que ela não se baseia na existência de anticorpos ou imagens de fluorescência.

Também permite a visualização direta de quais redes são adequadamente lubrificadas. Este método é adequado para a análise de sistemas tubulares, portanto, a pesquisa de vasos sanguíneos, ductos biliares e vias aéreas são áreas ideais. Utilizamos o DUCT para entender as mudanças estruturais relacionadas à regeneração biliar.

Antes de injetar resina no sistema biliar do camundongo, comece a mover o intestino e o pâncreas para o lado esquerdo do camundongo, usando um cotonete molhado com PBS para expor o ducto biliar comum e a veia portal. Em seguida, faça uma pequena incisão transversal na veia cava inferior. Vire o lado ventral do fígado em direção ao coração para expor a superfície visceral e a região hilar, e localize o ducto biliar comum que corre da região do hilar através do pâncreas, e para o intestino no esfíncter de Oddi.

Use os fórceps retos para limpar a área tecidual circundante de aproximadamente cinco milímetros do ducto biliar comum. Em seguida, colocando um fio de sutura de seda sob o ducto biliar comum, amarre um nó de mão sobre mão solto ao redor do ducto biliar comum. Segure a tesoura de mola plana contra o ducto biliar comum para fazer uma incisão oblíqua ao ducto biliar comum no local onde o ducto biliar comum entra no pâncreas e no intestino ao lado do esfíncter de Oddi.

Em seguida, misture um mililitro da resina amarela com 50 microliters do agente de cura MV, e encha uma seringa de um mililitro com a mistura de agente de cura de resina. Conecte a seringa recheada com o conjunto de tubos e pressione o êmbolo para encher a tubulação até que a mistura do agente de cura de resina escorre da ponta da tubulação. Use os fórceps para endireitar a área ao redor da incisão comum do ducto biliar.

Antes de inserir a tubulação na abertura no ducto biliar comum com a borda mais longa da ponta chanfrada para baixo em direção ao lado dorsal do ducto biliar. Em seguida, aperte o nó de fio de seda para fixar o tubo dentro do ducto biliar comum. Depois de injetar a resina no ducto biliar comum, observe a vesícula biliar e os lobos hepáticos individuais.

Massageie o fígado com um cotonete de algodão molhado pbs para ajudar a espalhar a resina igualmente. Os ramos terminais dos dutos biliares cheios de resina serão levemente visíveis na superfície hepática. Pare de injetar a resina quando pontos de resina aparecerem na superfície do fígado ou quando a resistência for atingida.

Em seguida, remova a tubulação puxando para fora do ducto biliar comum e aperte rapidamente o nó de seda usando fórceps para evitar que a resina vaze. Corte as pontas soltas da sutura de seda, para que elas não interfiram com a injeção de veia portal. Antes de injetar a resina na veia portal, limpe a veia portal de seu tecido circundante cerca de dois centímetros de sua entrada no fígado, usando fórceps retos.

Em seguida, coloque o fio de sutura de seda sob a área desmatada da veia portal para amarrar um nó de mão solta. Na veia do portal distal ao fígado, faça uma incisão longitudinal antes de amarrar o nó. Em seguida, prepare a mistura de agente de cura de resina verde na seringa e encha a tubulação com a mistura como demonstrado anteriormente.

Use os fórceps para endireitar a veia do portal puxando o tecido circundante em direção ao lado da cauda antes de inserir o tubo com a borda mais longa da ponta chanfrada em direção ao lado dorsal do vaso. Aperte o fio de seda para fixar o tubo na veia do portal. Depois de injetar a resina na veia portal, observe os vasos sanguíneos enchendo com resina, e massageie o fígado com um cotonete de algodão molhado pbs para ajudar a espalhar a resina.

Quando todos os vasos sanguíneos estiverem cheios, retire a tubulação da veia do portal, e aperte rapidamente o nó de seda usando fórceps para evitar que a resina vaze. Para tomografia microcomputada ou microCT do fígado dissecado do camundongo, coloque o lobo hepático medial direito em um tubo concético de 15 mililitros e encha o tubo com gel de 1%agarose para aproximadamente dois terços do volume total do tubo para minimizar o movimento amostral indesejado durante a medição do MicroCT. Monte o tubo cônico de 15 mililitros com a amostra no estágio rotacional de um dispositivo ct.

Deixe que o tubo se adapte termicamente à câmara de medição por pelo menos uma hora. Quando a amostra estiver adaptada termicamente, centralize-a no campo de visão ou FOV, em seguida, otimize as distâncias da amostra de origem e detector de amostras, ou SSD e SDD para alcançar resolução voxel suficiente. Uma vez definidos os parâmetros, inicie uma medição de tomografia computadorizada.

Use software dedicado de reconstrução tomográfica para reconstruir os dados ct. Para analisar os dados do CT, carregue os arquivos selecionando arquivo, importação e comando. Use a função de determinação da superfície no painel superior para segmentar a resina nos dados usando limiar global.

Na janela de diálogo, determine o valor limiar com a avaliação do histograma definindo a posição da linha isovalor vermelha para segmentar apenas os vasos cheios de resina. No painel esquerdo, selecione o módulo criar ROI a partir de volume ou CAD ou malha para criar uma região de interesse ou ROI dos vasos cheios de resina. Na janela de diálogo, use a opção criar ROIs de sólido para selecionar e confirmar o nome do volume processado.

Eliminar a segmentação errônea de clusters de ruído na região de fundo deste ROI. Marque o ROI no painel direito clicando com o botão direito do mouse e selecionando o ROI dividido do módulo. Na janela de diálogo, defina o parâmetro voxel de volume mínimo para excluir todas as partículas de ruído.

O valor do parâmetro é experimentado e dependente de dados, e otimizado para cada amostra a ser analisada. No painel esquerdo use o módulo de alisamento para criar máscaras de canal suaves, contínuas e sólidas sem artefatos, como a presença de bolhas de ar ou vazamento de resina no ROI de custo de resina. Crie um ROI separado como descrito anteriormente para o sistema preenchido com a resina mais absortiva como a resina amarela usada para a injeção comum do ducto biliar com valores de maior intensidade nos dados ct.

Marque e resina mascaram o novo ROI clicando com o botão direito do mouse antes de selecionar ROIs subtraídas e, em seguida, subtrair o novo ROI da máscara de resina para criar um novo ROI para o sistema tubular restante. Exporte os ROIs resultantes para ambos os sistemas tubulares em vários formatos com base em referências do operador para processamento subsequente em diferentes softwares. Processe ainda mais os ROIs resultantes em um software gráfico de volume para exportar a visualização final na forma de uma imagem ou um vídeo.

Neste estudo, foi alcançada uma injeção de resina dupla bem sucedida com dutos biliares intrahápticos bem preenchidos e vasculatura de veia portal. A análise representativa ilustra o resultado dos dados segmentados de um fígado bem injetado para um rato P15, e um rato adulto onde a resina é visível nos ramos laterais. No exemplo típico de injeção mal sucedida, danos físicos ao fígado durante o procedimento cirúrgico resultaram no vazamento da resina.

Também o endurecimento prematuro da resina na agulha ou na ponta da tubulação antes da injeção, e a perfusão transcárdia insuficiente causaram o subenchimento do sistema. O pequeno vazamento de resina pode ser corrigido manualmente durante a segmentação de dados MicroCT. A alta pressão de injeção pode romper vasos ou dutos, e danificar irreversivelmente a arquitetura do vaso ou duto.

Além disso, as bolhas foram outro artefato de injeção muito comum que levou ao enchimento esparso das redes tubulares. Quando utilizada a resina recém-aberta, observou-se uma clara diferença no contraste entre os dutos biliares injetados por resina amarela e as veias do portal injetadas por resina verde. Após três meses de armazenamento, o contraste foi suficiente para distinguir a veia portal do ducto biliar.

No entanto, a precipitação afetou a mistura das duas resinas, que era visível como uma opacidade heterogênea na veia do portal preenchido. Quando a resina tinha mais de seis meses, o contraste se degradou a um ponto em que era inviável distinguir o ducto biliar injetado em amarelo da veia portal injetada pelo verde, com base apenas no seu contraste. É crucial fazer uma incisão oblíqua no ducto biliar comum.

Caso contrário, será muito difícil inserir a tubulação. A técnica DUCT esclarece novos mecanismos arquitetônicos de regeneração biliar em um modelo clinicamente relevante com características distintas nas regiões do lóbulo hilar e periférico.