Usando o Phage Display para desenvolver moduladores variantes de Ubiquitin para Ligases E3

O display de phage não só nos ajuda a investigar as características de ligação de enzimas clinicamente importantes, mas também desenvolve moduladores para essas enzimas e as doenças correspondentes. O display phage pode ser usado para desenvolver novos aglutinantes para uma ampla gama de proteínas-alvo e também é mais fácil de executar do que outros métodos convencionais de exibição. Este procedimento envolveu muita ação repetitiva, então a chave é não piloto automático e manter o foco por toda parte.

Comece inoculando 30 mililitros de caldo de tetraciclina 2YT com 200 microliters da cultura das sementes. Incuba-o por aproximadamente três horas a 37 graus Celsius com 200 RPM orbital tremendo até que as bactérias estejam na fase de tronco médio. Descarte a solução de revestimento da placa em uma pia.

Seque-o suavemente com toalhas de papel. Em seguida, adicione 200 microliters de tampão PB a cada bem revestido. Descarte o tampão PB da placa e seque-o em toalhas de papel.

Adicione mais 200 microliters de tampão PB a cada poço revestido da placa. Incuba-o à temperatura ambiente por uma hora com tremor orbital de 300 RPM. Descongele a biblioteca de phage no gelo, depois dilua-a para 100X a diversidade da biblioteca na PBS.

Adicione a solução de cloreto de sódio polietileno glicol em um quinto do volume da biblioteca diluída e incubar a solução no gelo por 30 minutos. Em seguida, centrifugar a solução a 11.000 vezes G por 30 minutos a quatro graus Celsius. Descarte o supernatante e centrífuga por mais dois minutos para puxar o supernatante restante e concentrar a pelota de phage.

Levemente resuspenque a pelota de phage em um mililitro de tampão PBT por proteína alvo para ser analisado, tipicamente quatro no total. Adicione 100 microliters de biblioteca de phage a cada bem revestido na placa de controle. Incuba-o à temperatura ambiente por uma hora com tremor orbital de 300 RPM.

Descarte o tampão PB da placa alvo na pia e seque a placa em toalhas de papel. Transfira todos os 100 microliters da biblioteca de phage na placa de controle para cada poço revestido da placa alvo. Incuba-o à temperatura ambiente por uma hora com tremor orbital de 300 RPM.

Em seguida, remova a biblioteca de phage da placa e lave os poços revestidos quatro vezes com tampão PT. Inverta a placa e toque em uma toalha de papel para remover as últimas gotas de tampão. Adicione 100 microliters de ácido clorídrico molar de 0,1 molar a cada bem revestido para elute o phage.

Incubar a placa em temperatura ambiente por cinco minutos com tremor orbital de 300 RPM. Depois disso, neutralize o pH adicionando 12,5 microliters de pH 11 um cloridrato molar tris a cada bem revestido. Transfira a praga elucida de todos os oito poços para um único tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Pipeta para cima e para baixo durante a transferência para tornar as soluções homogêneas e aspirar todo o líquido dos poços. Adicione 10%BSA à praga elucidada para fazer a concentração final 1% Armazene o tubo de microcentrifusagem a quatro graus Celsius. Esta é a saída redonda.

Prepare uma cultura de sementes para cultivar o insumo phage para a próxima rodada de seleção, inoculando cinco mililitros da cultura de sementes de tetraciclina 2YT com uma colônia isolada de E.coli de uma placa de ágar. Incuba-o durante a noite a 37 graus Celsius com 200 RPM orbital tremendo. Diluir a proteína alvo nas rodadas dois e três tubos com uma quantidade apropriada de PBS.

Pegue metade do conteúdo das rodadas dois e três tubos e cubra quatro poços por proteína alvo em uma placa de ligação de 96 poços para a próxima rodada. Em seguida, use metade da saída redonda para inocular três mililitros de células de fase de tronco médio. Incuba-o a 37 graus Celsius por 30 minutos com tremor orbital de 200 RPM.

Adicione m13KO7 auxiliar phage a uma concentração final de 10 bilhões de PFU por mililitro. Incuba-lo novamente a 37 graus Celsius por uma hora com 200 RPM de agitação orbital. Após uma hora, transfira os três mililitros de cultura para 30 mililitros de solução de kanamycina de carbenicilina 2YT.

Cresça durante a noite a 37 graus Celsius com 200 RPM orbitais tremendo. Os resultados representativos para uma seleção de variantes de ubiquitina contra uBE4B são mostrados aqui. Os UBVs foram ordenados da maior frequência para a menor frequência.

As sequências representam a região diversificada da ubiquitina na UBV com todos os resíduos randomizados. A afinidade relativa de ligação dos aglutinantes à proteína alvo do tipo selvagem, proteína alvo mutada, bem como proteínas fora do alvo é medida por ensaios imunossorbentes ligados à enzima ou ELISA. Todas as absorvâncias ELISA foram normalizadas contra 96 pontuações médias de BSA ELISA e 96 pontuações médias de GST ELISA.

O verde mais escuro representa a ligação relativa mais forte. O GST foi incluído como um controle para a vinculação inespecífica porque a proteína alvo é marcada gst. Os resultados elisa são apresentados graficamente aqui.

O eixo x representa as UBVs e o eixo y representa a absorvência normalizada correspondente. Ao tentar este procedimento, é importante que você não descarte a solução na placa depois de adicionar o ácido clorídrico. Os phages estão agora suspensos em solução e você quer mantê-los para que você possa realizar análises finais de enriquecimento subsequentes ou ambos.

Após este procedimento, deve-se fazer o sequenciamento para determinar as frequências UBV. Os ensaios ELISAs e IC50 podem ser feitos para determinar as eficácias vinculantes e as eficácias inibitórias, respectivamente, e também para ajudar a determinar quais UBVs caracterizam ainda mais.