Isolamento Magnético de Células Microgliais de Rato Neonato para Culturas Celulares Primárias
July 25th, 2022
Culturas primárias de micróglias são comumente usadas para avaliar novas moléculas anti-inflamatórias. O presente protocolo descreve um método reprodutível e relevante para isolar magneticamente a micróglia de filhotes recém-nascidos.
Este protocolo nos permite cultivar micróglias em condições que imitam de perto as características in vivo. Usando a tecnologia de classificação de células magnéticas, nosso protocolo nos permite estimular a micróglia apenas dois dias in vitro, sem usar nenhum soro no meio de cultura. Para começar, use uma pequena tesoura para cortar a pele do pescoço ao nariz, seguindo a sutura sagital de 15 a 20 milímetros.
Insira as pontas com o forame magno paralelo ao crânio. Corte de cada lado para os olhos. Corte entre os olhos com uma pequena tesoura para separar o crânio e o cérebro da cabeça.
Com duas pinças, agarre o crânio perto dos bulbos olfativos e rasgue cuidadosamente o crânio. Com uma lâmina de barbear, remova o cerebelo e o bulbo olfativo e corte o cérebro em dois pedaços. Coloque as peças cerebrais em uma placa de Petri contendo 40 mililitros de HBSS sem cálcio e magnésio.
Prepare a mistura de dissociação de acordo com esta tabela. Transfira 12 peças cerebrais para um tubo C para um peso total de 1,2 gramas por tubo de dissociação. Em seguida, coloque tubos C no dissociador com aquecimento.
Inicie o programa NTDK otimizado no dissociador. Centrífuga por 20 segundos. Complete a dissociação mecânica pipetando três vezes.
Transfira as células para quatro tubos de 15 mililitros com filtros acoplados. Lave os filtros com 10 mililitros de HBSS com cálcio e magnésio. Centrifugar por 10 minutos e remover o sobrenadante com uma pipeta de 10 mililitros.
Adicione cuidadosamente 10 mililitros de HBSS com cálcio e magnésio e ressuspenda o pellet. Novamente, centrifugar e remover o sobrenadante. Ressuspeite o pellet com seis mililitros de buffer de classificação.
Repita a centrifugação e descarte o sobrenadante. Em seguida, adicione 200 microlitros de solução de microesferas CD11b e incube os tubos por 15 a 20 minutos a quatro graus Celsius. Após a incubação, ressuspeite o pellet com seis mililitros de tampão de classificação.
Repita a centrifugação e ressuspenda o pellet com oito mililitros de buffer de classificação. Em seguida, siga o programa Possel no separador para preparar oito colunas. Passe as células através da coluna adicionando um mililitro de suspensão celular de cada vez.
Com um mililitro de tampão de classificação, elimine células CD11b-positivas em uma placa de eluição estéril. Junte as células em um tubo de 50 mililitros. Centrifugar e ressuspender o pellet com 10 mililitros de meio microglia fria.
Conte as células CD11b positivas. Ressuspeite as células em meio microglia frio para obter uma concentração final de 650.000 a 700.000 células por mililitro. Dispensar a suspensão em placas de cultura celular.
Incubar as placas durante a noite a 37 graus Celsius com dióxido de carbono a 5%. No dia seguinte, substitua o meio por meio de micróglia pré-aquecido e repita a incubação durante a noite. Estimule as células antes desta etapa e realize o ensaio fagocítico durante as últimas três horas da estimulação.
Calcule o número de contas de acordo com esta tabela em uma proporção de 50 contas por célula. Prepare a mistura de contas. Incube o tubo por uma hora em banho-maria a 37 graus Celsius.
Vórtice a cada 10 minutos. A cada poço, adicione o volume calculado da solução de grânulos e incube por três horas. Usando essa abordagem, a atividade fagocítica da micróglia foi avaliada após a estimulação por fatores pró-inflamatórios, como interleucina-1 beta, mais interferon gama ou lipopolissacarídeos.
Após estimulação por seis a 24 horas, as esferas fluorescentes da micróglia Cy3 foram analisadas por microscópio confocal. Após seis horas, a micróglia começa a fagocitar as esferas Cy3 apenas sob a condição de interleucina-1 beta mais interferon gama. Após 24 horas, houve aumento da fluorescência Cy3 para ambos os tipos de estimulação, destacando-se o aumento da atividade fagocítica.
A pureza da cultura microglial foi elevada pela citometria de fluxo, que mostrou aumento da viabilidade celular após a triagem. Usando citometria de fluxo e marcadores de população de células RT-qPCR foram analisados antes e depois de classificar células CD11b-positivas de cérebros de camundongos no oitavo dia pós-natal. Essas análises distinguiram várias populações de células cerebrais, como CX3CR135 para microglia, O4 ou OLIG2 para oligodendrócitos, NeuN ou sinaptofisina, para neurônios, e ACSA-2, ou GFAP para astrócitos.
Após a triagem celular com o anticorpo CD11b, apenas a micróglia foi obtida. É importante pipetar muito suavemente ao adicionar a suspensão à coluna para evitar o entupimento e evitar a morte mecânica das células. Após este método, a proteômica transcriptômica, como o sangue ocidental, ou Luminex, e até mesmo a imunoquímica podem ser realizadas para ver o efeito da estimulação microglial.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo reprodutível para isolar microglia primária de camundongos neonatais, usando tecnologia de triagem magnética. A metodologia permite o cultivo de microglia sob condições que replicam de perto as características in vivo, fornecendo insights sobre sua atividade fagocítica.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Pesquisa em Microglia
Fundamentos
- Microglia desempenham papéis cruciais no sistema nervoso central.
- Entender as respostas da microglia a estímulos é importante para pesquisas em neuroinflamação.
- A triagem magnética de células fornece uma estratégia viável para isolar microglia.
- Protocolos anteriores podem carecer de reprodutibilidade ou relevância para condições in vivo.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo para isolar e cultivar eficientemente microglia primária.
- Permitir a avaliação das respostas da microglia a estímulos inflamatórios.
- Avaliar a pureza e viabilidade da microglia isolada.
Métodos Utilizados
- Método de cultura celular utilizando triagem magnética para isolar microglia de camundongos neonatais.
- O modelo biológico envolve microglia cortical de filhotes neonatos.
- Imunochemioterapia e citometria de fluxo foram empregadas para avaliar a pureza celular.
- Etapas-chave incluem dissecação, dissociação enzimática e triagem usando microesferas CD11b.
- Ensaios fagocíticos avaliaram a atividade da microglia em resposta a fatores pró-inflamatórios.
Principais Resultados
- Microglia demonstrou atividade fagocítica aumentada em resposta a condições inflamatórias específicas.
- Viabilidade e pureza celular aumentadas foram confirmadas por citometria de fluxo pós-triagem.
- Microscopia confocal destacou diferenças pronunciadas na atividade fagocítica com base na duração da estimulação.
- O método esclareceu distinções entre diferentes populações de células cerebrais.
Conclusões
- Este estudo estabelece um método confiável para isolar microglia de camundongos para experimentação in vitro.
- As descobertas aprimoram a compreensão das funções da microglia e suas respostas à inflamação.
- Este protocolo serve como base para investigações adicionais sobre processos neuroinflamatórios.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This protocol provides a reproducible method for isolating primary microglia from neonatal mice, enabling physiologically relevant in vitro models for neuroinflammatory research. By achieving high purity and viability through magnetic CD11b-based sorting, the approach supports mechanistic de-risking in target validation and assay development for CNS disorders. The method enhances predictive confidence in preclinical screening by maintaining microglial functionality and activation states that closely mimic in vivo conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of microglial activation phenotypes and pro-inflammatory responses relevant to neurodevelopmental and neurodegenerative disease hypotheses.
- Operational Value: Provides a standardized, serum-free culture system that reduces biological variability and supports consistent target engagement studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitatively assessable phagocytic and transcriptional outputs for screening modulatory compounds in inflammatory pathways.
- Operational Value: Delivers a scalable, reproducible isolation workflow compatible with multi-well plating and time-course stimulation assays.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant modeling by preserving microglial identity markers (e.g., CX3CR1) and functional responses to stimuli like IL-1β/IFN-γ and LPS.
- Operational Value: Facilitates translational continuity from discovery to preclinical validation through standardized purification and functional validation via flow cytometry and confocal microscopy.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, providing validated primary cells for hypothesis testing, assay readiness, and data generation that inform lead identification and preclinical risk assessment.
- Discovery Biology: Enables mechanistic de-risking by isolating microglia to clarify pathway involvement in neuroinflammatory processes.
- Screening: Delivers assay-ready cells with quantifiable phagocytic and mRNA readouts for compound screening and target modulation studies.
- Analytics: Supports quantitative dependent variable measurements including phagocytic activity (Cy3-bead uptake) and gene expression (RT-qPCR) for comparative condition analysis.
- Translational Research: Maintains phenotypic fidelity and marker expression, supporting biomarker alignment and continuity in preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation platform applicable across multiple projects studying microglial function in CNS disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing mechanistic ambiguity through physiologically relevant microglial models.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via magnetic sorting and defined culture conditions, minimizing batch-to-batch variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing reliable preclinical data on target modulation and inflammatory response profiles.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS targets based on validated microglial engagement and functional output data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neonatal tissue dissection, enzymatic dissociation, and magnetic cell sorting techniques.
- Dependent on access to cell sorters (e.g., MACS), centrifuges, and sterile tissue culture infrastructure.
- Necessitates standardized reagent preparation and incubation timing to ensure consistent CD11b-positive cell yield and viability.
- Adaptation to other model systems or developmental stages may require optimization of dissociation and sorting parameters.
- Practical limitations include mechanical sensitivity during column passage, necessitating gentle pipetting to avoid clogging and cell damage.
