Isolamento Magnético de Células Microgliais de Rato Neonato para Culturas Celulares Primárias
25 de julho de 2022
Culturas primárias de micróglias são comumente usadas para avaliar novas moléculas anti-inflamatórias. O presente protocolo descreve um método reprodutível e relevante para isolar magneticamente a micróglia de filhotes recém-nascidos.
Este protocolo nos permite cultivar micróglias em condições que imitam de perto as características in vivo. Usando a tecnologia de classificação de células magnéticas, nosso protocolo nos permite estimular a micróglia apenas dois dias in vitro, sem usar nenhum soro no meio de cultura. Para começar, use uma pequena tesoura para cortar a pele do pescoço ao nariz, seguindo a sutura sagital de 15 a 20 milímetros.
Insira as pontas com o forame magno paralelo ao crânio. Corte de cada lado para os olhos. Corte entre os olhos com uma pequena tesoura para separar o crânio e o cérebro da cabeça.
Com duas pinças, agarre o crânio perto dos bulbos olfativos e rasgue cuidadosamente o crânio. Com uma lâmina de barbear, remova o cerebelo e o bulbo olfativo e corte o cérebro em dois pedaços. Coloque as peças cerebrais em uma placa de Petri contendo 40 mililitros de HBSS sem cálcio e magnésio.
Prepare a mistura de dissociação de acordo com esta tabela. Transfira 12 peças cerebrais para um tubo C para um peso total de 1,2 gramas por tubo de dissociação. Em seguida, coloque tubos C no dissociador com aquecimento.
Inicie o programa NTDK otimizado no dissociador. Centrífuga por 20 segundos. Complete a dissociação mecânica pipetando três vezes.
Transfira as células para quatro tubos de 15 mililitros com filtros acoplados. Lave os filtros com 10 mililitros de HBSS com cálcio e magnésio. Centrifugar por 10 minutos e remover o sobrenadante com uma pipeta de 10 mililitros.
Adicione cuidadosamente 10 mililitros de HBSS com cálcio e magnésio e ressuspenda o pellet. Novamente, centrifugar e remover o sobrenadante. Ressuspeite o pellet com seis mililitros de buffer de classificação.
Repita a centrifugação e descarte o sobrenadante. Em seguida, adicione 200 microlitros de solução de microesferas CD11b e incube os tubos por 15 a 20 minutos a quatro graus Celsius. Após a incubação, ressuspeite o pellet com seis mililitros de tampão de classificação.
Repita a centrifugação e ressuspenda o pellet com oito mililitros de buffer de classificação. Em seguida, siga o programa Possel no separador para preparar oito colunas. Passe as células através da coluna adicionando um mililitro de suspensão celular de cada vez.
Com um mililitro de tampão de classificação, elimine células CD11b-positivas em uma placa de eluição estéril. Junte as células em um tubo de 50 mililitros. Centrifugar e ressuspender o pellet com 10 mililitros de meio microglia fria.
Conte as células CD11b positivas. Ressuspeite as células em meio microglia frio para obter uma concentração final de 650.000 a 700.000 células por mililitro. Dispensar a suspensão em placas de cultura celular.
Incubar as placas durante a noite a 37 graus Celsius com dióxido de carbono a 5%. No dia seguinte, substitua o meio por meio de micróglia pré-aquecido e repita a incubação durante a noite. Estimule as células antes desta etapa e realize o ensaio fagocítico durante as últimas três horas da estimulação.
Calcule o número de contas de acordo com esta tabela em uma proporção de 50 contas por célula. Prepare a mistura de contas. Incube o tubo por uma hora em banho-maria a 37 graus Celsius.
Vórtice a cada 10 minutos. A cada poço, adicione o volume calculado da solução de grânulos e incube por três horas. Usando essa abordagem, a atividade fagocítica da micróglia foi avaliada após a estimulação por fatores pró-inflamatórios, como interleucina-1 beta, mais interferon gama ou lipopolissacarídeos.
Após estimulação por seis a 24 horas, as esferas fluorescentes da micróglia Cy3 foram analisadas por microscópio confocal. Após seis horas, a micróglia começa a fagocitar as esferas Cy3 apenas sob a condição de interleucina-1 beta mais interferon gama. Após 24 horas, houve aumento da fluorescência Cy3 para ambos os tipos de estimulação, destacando-se o aumento da atividade fagocítica.
A pureza da cultura microglial foi elevada pela citometria de fluxo, que mostrou aumento da viabilidade celular após a triagem. Usando citometria de fluxo e marcadores de população de células RT-qPCR foram analisados antes e depois de classificar células CD11b-positivas de cérebros de camundongos no oitavo dia pós-natal. Essas análises distinguiram várias populações de células cerebrais, como CX3CR135 para microglia, O4 ou OLIG2 para oligodendrócitos, NeuN ou sinaptofisina, para neurônios, e ACSA-2, ou GFAP para astrócitos.
Após a triagem celular com o anticorpo CD11b, apenas a micróglia foi obtida. É importante pipetar muito suavemente ao adicionar a suspensão à coluna para evitar o entupimento e evitar a morte mecânica das células. Após este método, a proteômica transcriptômica, como o sangue ocidental, ou Luminex, e até mesmo a imunoquímica podem ser realizadas para ver o efeito da estimulação microglial.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo reproduzível para o isolamento de micróglia primária de camundongos neonatos, utilizando tecnologia de separação magnética. A metodologia permite o cultivo da micróglia em condições que replicam de perto as características in vivo, fornecendo insights sobre sua atividade fagocítica.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Pesquisa em Micróglia
Antecedentes
- As micróglias desempenham papéis cruciais no sistema nervoso central.
- Compreender as respostas das micróglias a estímulos é importante para a pesquisa em neuroinflamação.
- A separação magnética de células fornece uma estratégia viável para o isolamento de micróglias.
- Protocolos anteriores podem apresentar falta de reprodutibilidade ou relevância para condições in vivo.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo para o isolamento e cultivo eficiente de micróglias primárias.
- Permitir a avaliação das respostas das micróglias a estímulos inflamatórios.
- Avaliar a pureza e viabilidade das micróglias isoladas.
Métodos Utilizados
- Método de cultivo celular que utiliza triagem magnética para isolar micróglias de camundongos neonatos.
- O modelo biológico envolve micróglias corticais de filhotes neonatos.
- Imunoquímica e citometria de fluxo foram empregadas para avaliar a pureza celular.
- Os passos principais incluem dissecção, dissociação enzimática e triagem utilizando microesferas de CD11b.
- Ensaios de fagocitose avaliaram a atividade das micróglias em resposta a fatores pró-inflamatórios.
Resultados Principais
- As microglias demonstraram aumento da atividade fagocítica em resposta a condições inflamatórias específicas.
- A viabilidade celular e pureza aumentadas foram confirmadas por citometria de fluxo após a separação.
- A microscopia confocal destacou diferenças acentuadas na atividade fagocítica com base na duração da estimulação.
- O método esclareceu as distinções entre diferentes populações de células cerebrais.
Conclusões
- Este estudo estabelece um método confiável para o isolamento de micróglias de camundongo para experimentação in vitro.
- Os achados aprimoram a compreensão das funções das micróglias e suas respostas à inflamação.
- Este protocolo serve como base para investigações futuras sobre processos neuroinflamatórios.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo fornece um método reprodutível para o isolamento de micróglias primárias de camundongos neonatais, permitindo modelos in vitro fisiologicamente relevantes para pesquisas sobre neuroinflamação. Ao alcançar alta pureza e viabilidade por meio da separação magnética baseada em CD11b, a abordagem apoia a redução mecanicista de riscos na validação de alvos e no desenvolvimento de ensaios para distúrbios do SNC. O método aumenta a confiabilidade preditiva na triagem pré-clínica ao manter a funcionalidade e os estados de ativação das micróglias que imitam de perto as condições in vivo.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite a investigação de fenótipos de ativação de micróglias e respostas pró-inflamatórias relevantes para hipóteses de doenças neurodesenvolvimentais e neurodegenerativas.
- Valor Operacional: Oferece um sistema de cultura padronizado e livre de soro que reduz a variabilidade biológica e sustenta estudos consistentes de engajamento de alvos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera saídas fagocíticas e transcricionais quantitativamente avaliáveis para triagem de compostos moduladores em vias inflamatórias.
- Valor Operacional: Oferece um fluxo de trabalho de isolamento escalonável e reprodutível, compatível com placas de múltiplos poços e ensaios de estimulação em curso temporal.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Apoia a modelagem relevante para doenças ao preservar marcadores de identidade de micróglias (por exemplo, CX3CR1) e respostas funcionais a estímulos como IL-1β/IFN-γ e LPS.
- Valor Operacional: Facilita a continuidade translacional da descoberta à validação pré-clínica por meio de purificação padronizada e validação funcional por citometria de fluxo e microscopia confocal.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere na fase inicial da descoberta, fornecendo células primárias validadas para testes de hipóteses, preparação de ensaios e geração de dados que orientam a identificação de compostos promissores e a avaliação de riscos pré-clínicos.
- Biologia da Descoberta: Permite a desvinculação mecanicista mediante o isolamento de micróglias para esclarecer o envolvimento de vias nos processos neuroinflamatórios.
- Triagem: Fornece células prontas para ensaio com leituras quantificáveis de fagocitose e de mRNA para estudos de triagem de compostos e modulação de alvos.
- Análises: Permite medições quantitativas de variáveis dependentes, incluindo atividade fagocítica (captação de microesferas Cy3) e expressão gênica (RT-qPCR), para análise comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Mantém a fidelidade fenotípica e a expressão de marcadores, apoiando o alinhamento de biomarcadores e a continuidade na validação pré-clínica.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma de isolamento reutilizável, aplicável em múltiplos projetos que estudam a função das micróglias em modelos de doenças do SNC.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança na validação de alvos ao reduzir ambiguidades mecanicistas por meio de modelos fisiologicamente relevantes de micróglia.
- Valor Operacional: Aprimora a reprodutibilidade e padronização por meio da separação magnética e condições de cultivo definidas, minimizando a variabilidade entre lotes.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de avançar/não avançar ao fornecer dados pré-clínicos confiáveis sobre modulação de alvos e perfis de resposta inflamatória.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos do SNC com base em dados validados de engajamento de micróglia e respostas funcionais.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em dissecação de tecidos neonatais, dissociação enzimática e técnicas de separação magnética de células.
- Depende do acesso a separadores celulares (por exemplo, MACS), centrífugas e infraestrutura estéril para cultura de tecidos.
- Necessita de preparação padronizada de reagentes e controle rigoroso dos tempos de incubação para garantir rendimento e viabilidade consistentes de células positivas para CD11b.
- A adaptação a outros sistemas modelo ou estágios de desenvolvimento pode exigir otimização dos parâmetros de dissociação e separação.
- As limitações práticas incluem a sensibilidade mecânica durante a passagem pela coluna, exigindo pipetagem suave para evitar entupimento e danos celulares.
