Name: Indução e Avaliação de Dyskinesias induzidas por Levodopa em um modelo de rato da doença de Parkinson (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Aprenda a induzir e avaliar discinesias induzidas por levodopa em modelo de rato da doença de Parkinson. Este método quantifica intensidade e frequência de movimentos anormais para testar tratamentos.

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Queremos reconhecer as lutas de todos aqueles com mal de Parkinson e a força e resiliência que eles mostram todos os dias, especialmente o amado pai do KSC, Mark Steece. O trabalho aqui representado foi apoiado pelo Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e AVC (NS090107, NS110398) e pelo Programa internacional de bolsas de pesquisa da Parkinson Disease Foundation, agora a Parkinson Foundation. Também gostaríamos de reconhecer Molly VanderWerp por sua excelente assistência editorial.

Os animais aqui apresentados foram mantidos e tratados em conformidade com as diretrizes institucionais. Todos os procedimentos de animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Estadual de Michigan (IACUC) em conformidade com as regulamentações federais e estaduais.
1. Confirmação sem drogas do estado da lesão 6-OHDA
<ol><li>Teste de hang tail postural 11,12,13 NOTA: Avalie o estado da lesão pelo menos 1 semana após a indução da lesão 6-OHDA (Ver 9,10,35 para detalhes sobre lesões) em indivíduos experimentais (por exemplo, masculino ou feminino, adulto Sprague Dawley ou Fisher 344 ratos).<ol>
<li>Suspenda o rato aproximadamente 6 cm acima de sua gaiola, firmemente segurando na base da cauda, por ~5 s.</li>
		<li>Registo a direção da contorção corporal como + para um animal com sucesso torcendo contralateral para o lado lesionado e - por falta de torção ou torção em ambas as direções.</li>
		<li>NOTA: Estes testes são opcionais, mas recomendados. Consulte 14,15,16,17 para obter opções/variações adicionais de teste sem drogas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Teste de arrasto de ajuste de etapas (adaptado a partir de16) NOTA: Avalie o estado da lesão pelo menos 1 semana após a indução unilateral da lesão 6-OHDA em indivíduos experimentais (por exemplo, masculino ou feminino, adulto Sprague Dawley ou Fisher 344 ratos).<ol>
<li>Segure o rato pela base de sua cauda, elevando os pés traseiros da superfície em ~6 cm; arraste para trás através de uma superfície plana, lisa, mas não escorregadia, ~75 cm, acima de 5-10 s.</li>
		<li>Observe e regise o número de movimentos de ajuste de toque/passo de cada pré-selecionado ao longo de três testes repetidos.</li>
		<li>Escore o sujeito como + para lesão unilateral bem sucedida quando toques de 0-2 forepaw são observados contralateral para o lado lesionado, juntamente com toques rápidos (~10 toques) da previ ipsilateral para o lado lesado (por exemplo, animais unilateralmente lesados no lado esquerdo mostram déficit de toques (0-2 toques) com a forepaw direita contralalateral).</li>
		<li>Por outro lado, marque toques moderados a rápidos (5-10 toques) de ambas as paralelepípedos como - para indicar estado de lesão incompleto ou desconhecido. NOTA: Um animal ansioso pode mostrar ajuste rápido de toque/passo, mesmo se lesionado com sucesso. Se isso for suspeito, coloque o rato de volta em sua gaiola e reteste ≥30 minutos depois.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparação de reagentes e suprimentos
<ol><li>Determine l-3,4-dihidroxyfenylalanina metil ester cloridrato (levodopa ou L-DOPA) e hidrocloroide benserazida, um inibidor de decarboxilase periférico (ver Tabela de Materiais), frequência de classificação e cronograma experimental apropriado para a questão investigativa 12,18,19,20 (Figura 1). NOTA: Questões investigacionais podem ser colocadas para buscar qualquer número de perguntas que vão desde perguntar se uma terapia específica pode reduzir a LID existente ou evitar a indução do LID. Eles também podem explorar se a eficácia terapêutica depende da dose de levodopa ou se a expressão lid e/ou eficácia terapêutica varia dependendo do sexo, espécie e idade do sujeito.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62970/62970fig1v3.jpg"> Figura 1: Exemplo do cronograma do tratamento. Exemplo L-DOPA linha do tempo de escalada de 12 semanas de comprimento total, com 8 semanas de injeções L-DOPA começando 3 semanas após 6-OHDA lesionação e 4 semanas após o tratamento experimental. Neste exemplo, l-DOPA é subcutâneamente injetado 5x por semana (segunda-feira a sexta-feira) aproximadamente ao mesmo tempo todos os dias, por 2 semanas em cada dose L-DOPA prescrita (3, 6, 9 e 12 mg/kg). As classificações de LID comportamental ocorrem nos dias 1, 6 e 10 de cada nível de dosagem L-DOPA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62970/62970fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol start="2"><li>Pesar ratos semanalmente para calcular a quantidade de droga apropriada com base nas mudanças de peso contínuas durante o estudo. NOTA: Devido ao aumento da atividade em ratos LID+, há potencial para perda de peso com tratamentos L-DOPA de longo prazo. Se ocorrer perda de peso, forneça aos ratos guloseimas nutricionalmente completas e altamente palatáveis (ver Tabela de Materiais) após as injeções L-DOPA.</li>
	<li>Calcule a quantidade de L-DOPA e benserazida necessária para cada concentração semanal, pesando alíquotas linófilas para cada dia de injeção e armazenando em combinação por 1-2 semanas a -20 °C em frascos de âmbar de vidro até o dia do tratamento. NOTA: A dose alvo é de 12 mg/kg ou 12 mg L-DOPA/1000 g de peso corporal. Exemplo de cálculos para determinar a quantidade de L-DOPA e soro fisiológico necessários para cada dia de uma semana usando 12 mg de L-DOPA/kg de peso corporal a um volume de injeção de 1 cc/kg de peso de rato é dado no Arquivo Suplementar 1.</li>
</ol>3. Sala e gaiola montada
<ol><li>No primeiro dia de tratamento L-DOPA 3-4 semanas após a cirurgia de lesão 6-OHDA, transfira ratos para uma única moradia, incluindo o enriquecimento aprovado pela IACUC.</li>
	<li>Manter em habitação única durante todo o estudo para evitar interferências de pares com avaliações comportamentais.</li>
	<li>Nos dias de classificação do LID, coloque as gaiolas domésticas em um rack de arame de aço, virado em um ângulo de aproximadamente 45° para uma visão ideal do rato (Figura 2A). Vire as etiquetas de identificação (Figura 2B) para cima e remova garrafas de água, racks de alimentos e todos os tipos de enriquecimento na gaiola (Figura 2C) para evitar interferências com avaliações comportamentais.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62970/62970fig02.jpg"> Figura 2: Exemplo da gaiola configurada para classificações LID de experimentos de ratos em larga escala. (A) Várias gaiolas podem ser configuradas para classificação LID usando grandes racks de metal que permitem uma visualização ideal de cada animal. As gaiolas devem ser espalhadas em um ângulo de 45° com cartões de identificação virados para cima (B), alimentos, garrafas de água, materiais de aninhamento e outros enriquecimentos removidos para limitar a obscurecimento visual do rato e distrações ao rato enquanto examina comportamentos discinéticos (C). Os racks de metal precisam estar a poucos metros de qualquer parede para permitir que o avaliador examine o rato na frente ou atrás da gaiola, conforme necessário. É essencial rotular aparelhos de enriquecimento (por exemplo, casas de retiro de ratos vermelhos c- c) com identidades individuais de animais para substituí-los na mesma gaiola de onde vieram. Isso é particularmente importante quando se usa animais de diferentes sexos para não aumentar o estresse aos sujeitos experimentais. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62970/62970fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
4. Injeção de levodopa e classificação de dyskinesia
<ol><li>Injeções subcutâneas de L-DOPA21,22<ol>
<li>Imediatamente antes da injeção diária de L-DOPA, adicione o volume apropriado de soro fisiológico estéril à mistura l-dopa e benserazida pré-ponderada no frasco âmbar e agite bem por 10 s (passo 2.3). NOTA: O volume de injeção de alvo é de 1 mL/1000 g de peso corporal (com 12 mg L-DOPA por mL). O volume do soro fisiológico estéril dependerá do número de animais por estudo.</li>
		<li>Encha as seringas individuais (por exemplo, 1,0 ou 0,5 mL com agulha de 26 G) com o volume necessário para cada animal (1 mL/kg de peso de rato) e rotule cada seringa com identificação individual animal. NOTA: Mantenha as seringas cheias protegidas da luz em bolsas estéreis até o momento da injeção. L-DOPA oxida rapidamente na presença de oxigênio e luz em um ambiente aquoso 23,24,25,26.</li>
		<li>Traga a primeira gaiola para o banco de injeção.</li>
		<li>Remova o rato de sua gaiola e coloque-o na superfície de injeção.</li>
		<li>Contenha suavemente a cabeça e os ombros contra a superfície em que o rato está descansando com a palma da mão não dominante.</li>
		<li>Suavemente, escroto a pele nas costas sobrevoando a escápula com o polegar e o indicador da mão não dominante, injete o volume L-DOPA com a mão dominante no espaço subcutâneo entre/abaixo dos dedos, mantendo a agulha o mais paralela possível ao corpo para evitar a injeção intramuscular. NOTA: Os ratos não são anestesiados antes da injeção.</li>
		<li>Descarte cada seringa individual usada em um recipiente afiado.</li>
		<li>Substitua o rato em sua gaiola individual e adicione guloseimas nutricionalmente completas, exceto nos dias de classificação LID para evitar interferências com avaliações comportamentais até que as classificações estejam completas.</li>
		<li>Defina o temporizador para 1-2 min, dependendo do tempo de classificação desejado e do número de ratos no estudo em dias de classificação. Recupere a próxima gaiola e injete o próximo rato quando o temporizador indicar.</li>
		<li>Repita isso, injetando um rato a cada 1-2 minutos, até que todos os ratos sejam injetados.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Classificação de dyskinesia induzida por Levodopa pós-injeção<ol>
<li>Classifique a intensidade (Tabela 1) e a frequência (Tabela 2) dos movimentos de dystônica e hipercinética da diskinesia no número desejado de pontos de tempo, o que deve incluir o início inicial do comportamento do LID, o comportamento de pico e a fase de declínio (ver Arquivo Suplementar 2 para um exemplo da folha de registro de classificação LID).</li>
		<li>Para o adulto masculino e feminino Sprague Dawley ou Fisher 344 ratos, e um tamanho amostral de N = 40 ratos, comece as classificações de dyskinesia 20 minutos após a primeira injeção L-DOPA, e depois em intervalos de 50 minutos até 220 ou 270 min pós-injeção, dependendo de quando os comportamentos lid tenham descontinuado em 90%-100% dos ratos.</li>
		<li>Se usar intervalos de classificação de 1 min, defina um temporizador para 1 min. Avalie o primeiro rato por um minuto. Mova-se para o próximo rato e classifique-o por 1 min. Continue por todos os ratos, classificando para intervalos de 1 min.</li>
		<li>Tenha um temporizador posicionado ao lado da gaiola visivelmente para que a intensidade de comportamento lid (Tabela 1) possa ser observada enquanto estima a frequência de qualquer comportamento dado (Tabela 2) durante o período de classificação.</li>
		<li>Após a classificação para o primeiro ponto ser completado comece novamente com o primeiro rato no ponto da próxima vez (por exemplo; 70 min pós-injeção) e continue no intervalo desejado (por exemplo, a cada 50 minutos) até que todos os pontos de tempo sejam concluídos. NOTA: Devido à sobreposição das tarefas de injeção L-DOPA e classificação LID, duas pessoas são necessárias nos dias de classificação, uma para injeção e outra para classificações comportamentais.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Nenhum conflito de interesses foi declarado.

Apresentados aqui estão detalhes para a indução reprodutível e classificação de LIDs em um modelo de rato parkinsoniano após a lesão unilateral 6-OHDA do sistema da DA nigrostriatal. Embora já se pensou que os roedores não desenvolveram LID e que a assimetria rotacional pode ser o analógico da LID em ratos31, os modelos de ratos e camundongos foram caracterizados nas últimas duas décadas e são uma ferramenta bem aceita para a pesquisa lid 15,32,33,34.<sup class="...

Embora já se passaram mais de 50 anos desde que levodopa (L-DOPA) foi introduzido pela primeira vez como um tratamento para indivíduos com DP 1,2, continua a ser a terapia mais eficaz para sintomas motores parkinsonianos. Os sintomas motores clínicos associados à DP decorrem da perda de neurônios de dopamina (DA) na substantia nigra (SN) pars compacta, resultando na diminuição dramática da dopamina disponível no estriado. O L-DOPA restaura efetivamente os níveis de DA striatal, resultando em benefício motor no início da doença 3,4. Inoportunamente, com tratamento de longo prazo, a maioria dos indivíduos com DP desenvolverá dyskinesias induzidas por L-DOPA (LID), incluindo corea, distonia e ateu, que muitas vezes impactam significativamente as atividades de vida diária 5,6,7.
Embora existam vários modelos comportamentais de LID em roedores, existem diferenças na modelagem e avaliação comportamental dos LIDs têm colocado em questão a reprodutibilidade dos resultados entre os laboratórios, bem como a confiabilidade dessas ferramentas experimentais para pesquisas pré-clínicas de DP. Desenvolvido em associação com um especialista em transtorno de movimento clínico8, o protocolo atual é um método simples para indução e classificação de LID e é apropriado para uso em um modelo de rato de DP utilizando 6-hidroxidopamina (6-OHDA)-induzida lesão nigral unilateral 9,10. A escala de classificação LID fornecida aqui inclui pontuação tanto para a intensidade quanto para a frequência do comportamento discinético em várias partes individuais do corpo. Informações pertinentes sobre a otimização do fluxo de trabalho dos experimentos e o cuidado e manuseio adequados de animais parkinsonianos e discinéticos também são fornecidas.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Grampos de Temporizador Digital de 100 Minutos</td><td></td><td>1111764</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Compass CX Compact Scale</td><td>Ohaus</td><td>30428202</td><td></td></tr><tr><td>5-(2-aminoetil)-1,2,4-benzenenoteriol, monobrometo</td><td>Cayman Chemicals</td><td>25330</td><td>6-OHDA é uma neurotoxina catecolaminérgica usada para induzir lesões dopaminérgicas e sintomas parkinsonianos em roedores.</td></tr><tr><td>Gaiolas</td><td>Allentown Allentown, LLC</td><td>Rat900</td><td>As gaiolas Allentown fornecem a capacidade de ver os ratos de todos os lados.</td></tr><tr><td>Bandejas de alergistas BD com agulha permanentemente anexada</td><td>BD</td><td>BD 305540</td><td>Para injeções subcutâneas de L-DOPA Cloridrato</td></tr><tr><td>de Benserazida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7283</td><td>A benserazida é um inibidor periférico da descarboxilase usado com L-DOPA para induzir discinesia em modelos de roedores de DP.</td></tr><tr><td>Frascos de cintilação âmbar de vidro</td><td>Thermo Scientific</td><td>B7921</td><td>Usado para armazenamento de L-DOPA/benserazida a -20 &deg; C até misturar com solução salina estéril.</td></tr><tr><td>L-3,4-Dihidroxifenilalanina metil ester cloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1507</td><td>L-3,4-Dihidroxifenilalanina metil éster é um precursor para&nbsp; L-DOPA que atravessa a barreira hematoencefálica e é usado para tratar sintomas parkinsonianos em roedores.</td></tr><tr><td>Grampos de Lapiseiras Paper Mate Sharpwriter</td><td></td><td>107250</td><td></td></tr><tr><td>Tratamento de enriquecimento nutricionalmente completo para roedores</td><td>Bio-Serv</td><td>F05478</td><td></td></tr><tr><td>Balde de Gelo Redondo com Tampa, 2.5 L</td><td>Corning</td><td>432129</td><td></td></tr><tr><td>Prancheta de Plástico Padrão</td><td>Grampos</td><td>1227770</td><td></td></tr><tr><td>Aço com fio 6' unidades de prateleiras móveis</td><td>longas Uline</td><td>H9488</td><td>A largura/altura pode ser ajustada à necessidade/número de ratos por experimento</td></tr><tr><td>Solução salina estéril 0,9%</td> <td>Covidien/Argyle</td><td>1020</td><td>Para misturar com L-DOPA/benserazida antes de injeções subcutâneas.</td></tr></tbody></table>

indução e avaliação de dyskinesias induzidas por levodopa em um modelo de rato da doença de parkinson

Induction and Assessment of Levodopa-induced Dyskinesias in a Rat Model of Parkinson's Disease

Levodopa (L-DOPA) continua sendo a terapia padrão-ouro usada para tratar sintomas motores da doença de Parkinson (DP). No entanto, movimentos involuntários indesejados conhecidos como dyskinesias induzidas por L-DOPA (LIDs) desenvolvem-se com o uso prolongado deste precursor de dopamina. Estima-se que a incidência de LIDs aumente para aproximadamente 90% dos indivíduos com DP dentro de 10 a 15 anos de tratamento. Compreender os mecanismos dessa doença e desenvolver tratamentos anti-dycinesesia novos e eficazes requer modelagem consistente e precisa para testes pré-clínicos de intervenções terapêuticas. Um método detalhado para indução confiável e classificação abrangente de LIDs após lesões nigrais induzidas por 6-OHDA em um modelo de rato de DP é apresentado aqui. A avaliação confiável da LID em ratos fornece uma ferramenta poderosa que pode ser facilmente utilizada em laboratórios para testar terapias emergentes focadas em reduzir ou eliminar essa carga comum induzida pelo tratamento para indivíduos com DP.

Lids em ratos parkinsonianos podem manifestar-se como uma série de movimentos involuntários anormais (AIMs), incluindo comportamentos disstônicos, hipercinéticos e estereotipados. Os critérios de classificação LID para tais comportamentos são apresentados aqui para incluir tanto a intensidade (Tabela 1) quanto a frequência (Tabela 2). Isso fornece uma pontuação geral de gravidade LID para cada rato que reflete tanto a qualidade (intensidade) quanto a quantidade de tempo gasto engajando (...

Este artigo descreve métodos para induzir e avaliar dyskinesias induzidas por levodopa em um modelo de rato da doença de Parkinson. O protocolo oferece informações detalhadas sobre a intensidade e frequência de uma série de comportamentos discinéticos, tanto disstônicos quanto hipercinéticos, fornecendo uma ferramenta confiável para testar tratamentos voltados a essa necessidade médica não atendida.

Indução e Avaliação de Dyskinesias induzidas por Levodopa em um modelo de rato da doença de Parkinson

Levodopa (L-DOPA) remains the gold-standard therapy used to treat Parkinson&#39;s disease (PD) motor symptoms. However, unwanted involuntary movements ...

Nosso protocolo fornece um método detalhado para uma indução confiável e classificação abrangente de dyskinesia induzida por levodopa em um modelo de rato da doença de Parkinson. A principal vantagem da nossa escala de classificação de dyskinesia é que ela permite quantificar tanto a intensidade de um dado movimento involuntário anormal quanto a quantidade de tempo gasto exibindo esse comportamento. Modelos animais confiáveis de dyskinesia induzida por levodopa são fundamentais para perceber o objetivo final de encontrar tratamentos eficazes para reduzir ou eliminar o efeito colateral em indivíduos com doença de Parkinson.Inicie a preparação para o experimento pesando ratos semanalmente para calcular a quantidade de droga apropriada com base nas mudanças de peso. Forneça aos ratos guloseimas nutricionalmente completas e altamente palatáveis. No primeiro dia de tratamento L-DOPA, os ratos de transferência para habitação única fornecidos com o Comitê institucional de Cuidados e Uso de Animais aprovaram o enriquecimento.E manter ratos na única carcaça durante todo o estudo para evitar interferências por pares nas avaliações comportamentais. Nos dias de classificação da dyskinesia, remova garrafas de água, racks de alimentos e o enriquecimento na gaiola para evitar interferências nas avaliações comportamentais, e coloque as gaiolas em um rack de arame de aço em um ângulo de aproximadamente 45 graus, em seguida, vire as etiquetas de identificação para cima. Antes da injeção L-DOPA, adicione o volume apropriado de soro fisiológico estéril à mistura L-DOPA pré-alumíniofilizada e benserazida no frasco âmbar e agite bem por 10 segundos.Imediatamente após a preparação, encha o volume necessário da mistura L-DOPA-Benserazida para cada animal em seringas individuais montadas com uma agulha de calibre 26 e rotule cada seringa com uma identificação animal individual. Depois de trazer a primeira gaiola para o banco de injeção, remova o rato de sua gaiola para colocá-lo na superfície de injeção. Use a mão nondominante para conter a cabeça e os ombros do rato com a palma contra a superfície e esfolar a pele nas costas sobreopendo a escápula com o polegar e o dedo indicador.Use a mão dominante para injetar o volume L-DOPA no espaço subcutâneo entre os dedos, mantendo a agulha paralela ao corpo para evitar a injeção intramuscular. Após a injeção, mova o rato para a gaiola. Em seguida, defina o temporizador por um a dois minutos e repita o procedimento injetando um rato a cada um a dois minutos até que todos os ratos sejam injetados.No dia da classificação, posicione um temporizador próximo à gaiola para observar a intensidade de comportamento induzida por levodopa ou LID, enquanto estima a frequência de qualquer comportamento durante o período de classificação. Avalie a intensidade e a frequência dos movimentos de dystônica e hipercinética da discinese, incluindo o início inicial do comportamento do LID, o comportamento de pico e a fase de declínio no número desejado de pontos de tempo. Se usar intervalos de classificação de um minuto, defina um temporizador por um minuto para classificar o primeiro rato e continuar a classificação através de todos os ratos em intervalos de um minuto.A classificação LID para comportamentos involuntários anormais nos ratos parkinsonianos foi categorizada para incluir intensidade e frequência dos comportamentos. Uma série de movimentos involuntários anormais, incluindo comportamentos tísônicos, hipercinéticos e estereotipados foram observados em ratos. A análise representativa fornece um exemplo dos dados apresentados como lid de dose máxima sobre todo o cronograma experimental e cronograma de dosagem.A dose máxima LID foi definida como um momento em que a pontuação lid média do grupo foi a maior. Além disso, os dados de classificação LID foram examinados ao longo de cada curso diário de tempo de classificação em diferentes concentrações de L-DPOA com os grupos combinados e plotados como animais individuais. O tecido pós-morte de sujeitos avaliados comportamentalmente pode ser usado para explorar mecanismos moleculares associados a dyskinesias induzidas por levodopa, e o impacto das intervenções terapêuticas nesses mecanismos moleculares.Modelos animais de dyskinesia induzida por levodopa têm sido úteis para elucidar vários mecanismos pensados para sustentar essa doença comportamental. Tal entendimento levou à avaliação pré-clínica e clínica de vários alvos.

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JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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Aprenda a induzir e avaliar discinesias induzidas por levodopa em modelo de rato da doença de Parkinson. Este método quantifica intensidade e frequência de movimentos anormais para testar tratamentos.

Indução e Avaliação de Dyskinesias induzidas por Levodopa em um modelo de rato da doença de Parkinson

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