Medição quantitativa assistida por software da espessura óssea subcondral osteoartrítica
18 de março de 2022
Este artigo de metodologia apresenta um protocolo de medição quantitativa assistido por software para quantificar a espessura óssea subcondral histológica nas articulações do joelho osteoartrrítico murina e articulações normais do joelho como controles. Este protocolo é altamente sensível ao espessamento sutil e é adequado para detectar alterações ósseas subcondriais osteoartríticas precoces.
O espessamento ósseo subcondral, ou esclerose, é uma das marcas da osteoartrite, tanto em modelos animais quanto em humanos. Atualmente, a gravidade do espessamento ósseo subcondral histológico é determinada principalmente pela estimativa visual baseada em sistemas de classificação semi-quantitativos. Este estudo tem como objetivo desenvolver um protocolo reprodutível e facilmente executado para medir quantitativamente a espessura óssea subcondral em um modelo de camundongo de joelho OA induzido pela desestabilização do menisco medial.
Criamos um modelo de camundongo para osteoartrite do joelho por desestabilização cirúrgica do menisco medial que é realizado sob microscópio cirúrgico e condição estéril. O processo histológico das articulações do joelho do rato inclui fixação tecidual, decalcificação, corte, processamento, incorporação, secção e coloração, seguido de imagem microscópica. A imagem na tela mostra osteoartrite do joelho do rato com lesões de cartilagem articular, formação de osteofito e espessamento de osso subcondral Medição quantitativa do osso subcondral osteoartrítico com o software ImageJ.
Baixe ImageJ de imagej.nih.gov/ij. Imagem abertaJ. Clique na guia Arquivo e clique em Abrir a opção Abrir a imagem histológica.
Encontre o endereço do diretório do arquivo, selecione o arquivo de imagem e clique em Abrir. Use a ferramenta linha reta para desenhar uma unidade de comprimento, um micrômetro e clique em Analisar, em seguida, definir escala. Defina a distância conhecida e a proporção de pixels para um e clique em Ok.ImageJ pode converter o comprimento do pixel para o comprimento da unidade, um micrômetro.
Defina o fator medido para a área. Clique em Analisar e definir medição e verificar área e caixa limite para limiar sob a nova janela. Esta etapa define ImageJ para medir a área do parâmetro dentro do limiar selecionado.
Área de interesse total subcondral definida como mostrado no rádio que cobre a placa cortical subcondral e uma parte do osso trabecular subjacente adjacente à placa cortical. Esboce o contorno da área óssea subcondral total usando a ferramenta de seleção sob a janela principal da imagem. As ferramentas de seleção dão ao sistema um limite para limitar a medição após a escolha do limiar.
Clique em Analisar e, em seguida, medir. Uma janela de resultado com medição de área será aberta. Clique em Editar e, em seguida, limpar para fora para excluir a área fora da área óssea subcondral total.
Apenas a área óssea subcondral total é visível depois de clicar na opção Limpar de fora. Clique em Imagem e, em seguida, ajuste o limiar de cor para abrir a janela de cor limiar. Clique em Original na parte inferior da janela de cores limiar para restaurar a imagem ao status original.
Use ferramentas de seleção para desenhar uma pequena caixa na região da substância óssea. Clique em Opção de Amostra na parte inferior da janela para definir a área da substância óssea. A área de substância óssea selecionada ficará vermelha.
Clique em Selecionar na parte inferior da janela de cor limiar para criar um limiar de medição de área. Clique em Analisar e, em seguida, medir no menu principal imageJ. O resultado da medição da área da substância óssea aparecerá na janela de resultados.
Guarde os dados da área óssea subcondral total e da área da substância óssea. A variabilidade inter e intraobservadora e a reprodutibilidade foram determinadas pela análise do coeficiente de correlação de Pearson. A significância da diferença entre os grupos de estudo foi determinada pelo uso do T-Test estudantil ou da ANOVA unidirecional, seguido do teste pós-hoc.
Esta figura mostra painéis superiores e inferiores. O painel superior mostra imagens fotomicômicas de imagens histológicas de grupos Sham e DMM para classificação óssea subcondral baseada em estimativa visual. Os painéis inferiores mostram imagens fotomicrômicas de imagens histólógicas de grupos sham e DMM para medição óssea subcondral assistida por ImageJ.
As caixas delineadas com uma linha amarela pontilhada feita com o Adobe Illustrator define a área óssea subcondral total de interesse. A área de substância óssea dentro das caixas é destacada em laranja. O notável espessamento do osso subcondral no condílo femoral medial e no planalto tibial medial pode ser quantificado usando o software ImageJ.
Nesta figura, os testes de variação interobservadora indicam uma alta reprodutibilidade entre observadores tanto para a primeira quanto para a segunda medições da espessura óssea subcondral no planalto tibial medial e nas regiões de condíle femoral medial de interesse. Nesta figura, os testes de variação intraobservadora indicam uma alta reprodutibilidade entre as primeira e segunda medições de espessura óssea subcondral no planalto tibial medial e regiões de condíle femoral medial de interesse. A Tabela 1 mostra análise comparativa da reprodutibilidade entre a classificação visual e a medição quantitativa assistida por ImageJ da espessura óssea subcondral.
O teste do coeficiente de correlação sugere que a medição quantitativa era relativamente mais reprodutível do que o sistema de classificação visual. Esta figura mostra a análise de sensibilidade comparativa da classificação visual e da medição quantitativa assistida pela ImageJ da espessura óssea subcondral no condíle femoral medial e no planalto tibial medial. As imagens histológicas para classificação de estimativa visual foram divididas em três grupos.
O valor quantitativo de espessura óssea subcondral de todos os três observadores para as imagens DMM com pontuação visual zero foi significativamente maior do que o das imagens de Sham com um escore visual zero, indicando que a medição quantitativa é mais sensível do que a classificação visual para leve espessamento ósseo subcondral. O protocolo recém-desenvolvido para medição quantitativa da espessura óssea subcondral osteoartrítica é mais sensível a alterações ósseas subcondriais leves do que os sistemas de classificação visual amplamente utilizados. E este protocolo pode ser usado para detectar alterações ósseas subcondriais osteoartriticas precoces e para avaliar a eficácia in vivo dos tratamentos de osteoartrite em conjunto com a classificação da cartilagem osteoartrite.
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Visão Geral
Este artigo de metodologia apresenta um protocolo de medição quantitativa assistido por software para quantificar a espessura histológica do osso subcondral em articulações do joelho de camundongos com osteoartrite e em articulações do joelho normais como controle. O protocolo foi projetado para ser altamente sensível a espessamentos sutis, tornando-o adequado para detectar alterações osteoartríticas precoces.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Pesquisa em Osteoartrite
- Histologia
Antecedentes
- O espessamento do osso subcondral é uma característica marcante da osteoartrite.
- Os métodos atuais baseiam-se na estimativa visual e na graduação semi-quantitativa.
- É necessário um protocolo reprodutível para medição precisa.
- O estudo utiliza um modelo murino induzido pela desestabilização do menisco medial.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo de medição quantitativa da espessura do osso subcondral.
- Melhorar a sensibilidade na detecção de alterações osteoartríticas precoces.
- Fornecer um método padronizado para pesquisas futuras.
Métodos Utilizados
- Destabilização cirúrgica do menisco medial em camundongos.
- Processos histológicos, incluindo fixação, descalcificação e coloração.
- Imagem microscópica para análise.
- Medição quantitativa utilizando o software ImageJ.
Resultados Principais
- Criação bem-sucedida de um modelo murino para osteoartrite do joelho.
- Demonstração de lesões na cartilagem articular e formação de osteófitos.
- Avaliação quantitativa do espessamento do osso subcondral realizada.
- O protocolo demonstra alta sensibilidade a alterações na espessura óssea.
Conclusões
- O protocolo desenvolvido permite a medição precisa da espessura do osso subcondral.
- Este método pode aprimorar a compreensão da progressão da osteoartrite.
- Estudos futuros podem utilizar este protocolo para pesquisas adicionais em osteoartrite.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A medição quantitativa da espessura do osso subcondral aborda uma lacuna crítica na validação de alvos na osteoartrite, substituindo a classificação visual subjetiva por uma análise reprodutível assistida por software. Esta abordagem aumenta a confiança preditiva em modelos pré-clínicos ao permitir a detecção de alterações estruturais precoces e sutis que precedem a degradação evidente da cartilagem. O método auxilia na redução de riscos mecanicistas de terapêuticas para OA ao fornecer um biomarcador padronizado e transponível para vias de remodelação óssea.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas direcionadas a vias de remodelação óssea subcondral na osteoartrite.
- Valor Operacional: Fornece leituras quantitativas e reprodutíveis para a validação funcional de alvos em modelos murinos de OA.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao detectar espessamento ósseo leve invisível aos sistemas de classificação visual.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Prepara amostras histológicas validadas para análise padronizada e de alto rendimento utilizando o ImageJ.
- Saída Quantitativa: Gera medições contínuas e independentes de limiares da área óssea subcondral para triagem de compostos.
- Escalabilidade: Permite a reutilização da plataforma em diferentes estudos de OA com definições consistentes de região de interesse no côndilo femoral medial e no platô tibial.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Alinha-se à patologia da OA humana, na qual a esclerose subcondral é uma característica marcante da progressão.
- Continuidade Tradutiva: Conecta descobertas e fluxos de trabalho pré-clínicos ao fornecer um biomarcador compatível com a classificação da cartilagem.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Apoia critérios de prosseguimento ou interrupção com base em alterações quantitativas na espessura óssea em estudos de eficácia terapêutica.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O protocolo insere-se no continuum de descoberta da osteoartrite, desde a validação do alvo até a otimização do composto líder e a avaliação da eficácia pré-clínica, especialmente quando a remodelação óssea é o foco mecanicista.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre alvos envolvidos na esclerose óssea subcondral e na mecanotransdução.
- Triagem: Fornece saídas quantitativas reprodutíveis e prontas para ensaio para avaliar os efeitos de compostos na espessura óssea.
- Análises: Permite a comparação estatística da espessura óssea entre grupos utilizando correlação de Pearson e teste t/ANOVA conforme descrito.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à validação pré-clínica ao oferecer um biomarcador que reflete métricas clínicas de progressão da OA.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um fluxo de trabalho de análise histológica reutilizável, aplicável em múltiplos modelos de OA e braços de tratamento.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança na validação do alvo ao reduzir a ambiguidade na avaliação do fenótipo ósseo.
- Valor Operacional: Padroniza as medições entre observadores e sessões com baixa variabilidade intra e inter.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar ao detectar alterações estruturais precoces não identificadas pela pontuação semi-quantitativa.
- Impacto no Portfólio: Permite o avanço ajustado ao risco com base em desfechos quantitativos sensíveis de remodelação óssea.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência na preparação histológica e na análise de limiar no ImageJ.
- Depende de microscopia calibrada e definição consistente da região de interesse.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de medição para garantir reprodutibilidade.
- As considerações para adaptação incluem a anatomia óssea específica do modelo e os protocolos de coloração.
- Limitação prática: o delineamento manual pode introduzir variabilidade se as definições da região de interesse não forem rigorosamente padronizadas.
