Name: Imagem de molécula única de condensados EWS-FLI1 montados no DNA (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Aprenda a técnica de DNA Curtains para visualizar a formação de condensados de EWS-FLI1 em moléculas únicas de DNA. Este método revela a dinâmica da separação de fases de fatores de transcrição no sarcoma de Ewing.

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Os autores não têm conflitos de interesse.

Como as abordagens de molécula única são extremamente sensíveis ao conteúdo do sistema de reação, um esforço extra deve ser investido para garantir a boa qualidade de todos os materiais e soluções durante os experimentos de cortinas de DNA, especialmente os lipídios preparados nas seções 1 e 2 e os tampões usados na seção 5. Reagentes de maior pureza devem ser usados para preparar tampões, e os tampões devem ser preparados recentemente para o ensaio de molécula única
Quando o EWS-FLI1 marcado ...

A regulação transcricional é um passo crucial para a expressão gênica precisa em células vivas. Muitos fatores, como modificação cromossômica, fatores de transcrição (FTs) e RNAs não codificantes, participam desse complicado processo 1,2,3. Dentre esses fatores, os FTs contribuem para a especificidade da regulação transcricional, reconhecendo e ligando-se a sequências específicas de DNA conhecidas como promotores ou potenciadores e, posteriormente, recrutando outras proteínas funcionais para ativar ou reprimir a transcrição 4,5,6,7. Como esses TFs conseguem procurar seus locais-alvo no genoma humano e interagir com o DNA revestido com histonas e proteínas não vinculadoras de DNA de histonas tem deixado os cientistas perplexos há décadas. Nos últimos anos, vários modelos clássicos para o mecanismo de busca de alvos de FTs foram construídos para descrever como eles "deslizam", "saltam", "saltam" ou "transferem entre segmentos" ao longo da cadeia de DNA 8,9,10,11. Esses modelos são focados no comportamento de busca no DNA de uma única molécula de FT. No entanto, estudos recentes mostram que alguns FTs sofrem separação de fase líquido-líquido (LLPS) isoladamente no núcleo ou com o complexo Mediador12. As gotículas observadas dos FTs estão associadas às regiões promotoras ou potenciadoras, destacando o papel da formação de condensado biomolecular na transcrição e no genoma tridimensional13,14,15. Estes condensados biomoleculares estão ligados a compartimentos sem membrana in vivo e in vitro. Elas são formadas via LLPS, na qual biomacromoléculas modulares e regiões intrinsecamente desordenadas (IDRs) de proteínas são duas das principais forças motrizes das interações multivalentes16. Assim, os FTs não apenas buscam o DNA, mas também funcionam sinergicamente dentro desses condensados 4,17,18. Até o momento, a propriedade biofísica desses condensados de transcrição no DNA permanece obscura.
Portanto, este trabalho teve como objetivo aplicar um método de molécula única - Cortinas de DNA - para visualizar diretamente a formação e a dinâmica dos condensados de transcrição formados por TFs no DNA in vitro. DNA Curtains, uma plataforma de imagem in vitro de alto rendimento para estudar a interação entre proteínas e DNA, tem sido aplicada no reparo de DNA 19,20,21, busca de alvos22 e LLPS17,23,24. A célula de fluxo das cortinas de DNA é revestida com bicamadas lipídicas biotiniladas para passivar a superfície e permitir que as biomoléculas se difundam na superfície. Os padrões de zigue-zague nanofabricados limitam o movimento do DNA. Os substratos de DNA Lambda biotinilados podem se alinhar ao longo das bordas da barreira e ser esticados pelo fluxo tampão orientado. As mesmas sequências inicial e final de todas as moléculas permitem o rastreamento da proteína no DNA e descrevem a distribuição de posição dos eventos de ligação25,26. Além disso, a combinação de cortinas de DNA com microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM) ajuda a minimizar o ruído de fundo e detectar sinais em um nível de molécula única. Assim, as cortinas de DNA podem ser um método promissor para investigar a dinâmica da formação de condensado de transcrição em motivos de DNA. Este artigo descreve o exemplo de uma oncoproteína de fusão da família FUS/EWS/TAF15 (FET), EWS-FLI1, gerada por translocação cromossômica. DNA lambda contendo 25× GGAA - a sequência de ligação do EWS-FLI127 - foi usado como substrato de DNA nos experimentos de DNA Curtains para observar como as moléculas EWS-FLI1 sofrem LLPS no DNA. Este manuscrito discute detalhadamente o protocolo experimental e os métodos de análise de dados.

<table><tbody><tr><td>Laser de estado sólido bombeado por diodo de 488 nm</td><td>Laser de</td> estado sólido <td>OBIS488LS</td><td></td></tr><tr><td>diodo de 561 nm Rhawn de ágar</td><td>OBIS561LS</td><td></td><td>coerente</td></tr><tr><td></td><td></td><td>R003215-50g</td><td></td></tr><tr><td>biotinilado DOPE</td><td>Avanti</td><td>870273P</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Amresco</td><td>1595C027</td><td></td></tr><tr><td>Revestimento Electra 92</td><td>Allresist GmbH</td><td>AR-PC 5090.02</td><td>O revestimento protetor condutor</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I bovino</td><td>Sigma</td><td>D5139-2MG</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti</td><td>850375P</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>Lamínula de vidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Sigma</td><td>Z805939-1EA</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>60130</td><td></td></tr><tr><td>Lambda DNA</td><td>NEB</td><td>N3013S</td><td></td></tr><tr><td>Lambda Packs Extratos de Embalagem</td><td>Epicentro</td><td>MP5120</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>s3014</td><td></td></tr><tr><td>Nanoport</td><td>Idex</td><td>N-333-01</td><td></td></tr><tr><td>NheI-HF</td><td>NEB</td><td>R3131S</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Microscópio Invertido</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>NZCYM Caldo</td><td>Sigma</td><td>N3643-250G</td><td></td></tr><tr><td>PEG-2000 DOPE</td><td>Avanti</td><td>880130P-1G</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Amresco</td><td>25322-68-3</td><td></td></tr><tr><td>PMMA 200K, LACTATO DE ETILA 4%</td><td>Allresist GmbH</td><td>AR-P 649.04</td><td></td></tr><tr><td>PMMA 950K, ANISOLE 2%</td><td>Allresist GmbH</td><td>AR-P 672.02</td><td></td></tr><tr><td>Prime 95B Câmera CMOS Científica</td><td>FOTOMETRIA</td><td>Prime95B</td><td></td></tr><tr><td>proteinase K</td><td>NEB</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Corrediça de vidro de sílica</td><td>G.Finkenbeiner</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Válvula de injeção de seis vias</td><td>Idex</td><td>MXP9900-000</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidina</td><td>Thermo</td><td>S888</td><td>Diluído com ddH2O Bomba de</td></tr><tr><td>seringa</td><td>Harvard Apparatus</td><td>Pump11 Elite</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>NEB</td><td>R0146V</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-1 Iodeto (491/509)</td><td>Invitrogen</td><td>Y3601</td><td>Diluído com DMSO</td></tr></tbody></table>

imagem de molécula única de condensados ews-fli1 montados no dna

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

Os genes de fusão resultantes da translocação cromossômica foram encontrados em muitos tumores sólidos ou leucemia. EWS-FLI1, que pertence à família FUS/EWS/TAF15 (FET) de oncoproteínas de fusão, é um dos genes de fusão mais frequentemente envolvidos no sarcoma de Ewing. Essas proteínas de fusão da família FET tipicamente abrigam um domínio de baixa complexidade (LCD) da proteína FET em seu terminal N e um domínio de ligação ao DNA (DBD) em seu terminal C. Foi confirmado que o EWS-FLI1 forma condensados biomoleculares em seus loci de ligação alvo devido às interações LCD-LCD e LCD-DBD, e esses condensados podem recrutar RNA polimerase II para melhorar a transcrição gênica. No entanto, como esses condensados são montados em seus locais de ligação ainda não está claro. Recentemente, um método biofísico de molécula única - Cortinas de DNA - foi aplicado para visualizar esses processos de montagem de condensados EWS-FLI1. Aqui, o protocolo experimental detalhado e as abordagens de análise de dados são discutidos para a aplicação de cortinas de DNA no estudo dos condensados biomoleculares que se reúnem no DNA alvo.

O esquema das cortinas de DNA é mostrado na Figura 1A, Figura 1B e Figura 1D. A sequência alvo clonada contendo 25 repetições ininterruptas de GGAA é encontrada no promotor NORB1 no sarcoma de Ewing. Essa sequência-alvo é crucial para o recrutamento do EWS-FLI128. As moléculas EWS-FLI1 foram visualizadas detectando-se os sinais EWS-FLI1 marcados com mCherry obtidos com laser de 561 nm (Figura <strong...

Aqui, descrevemos o uso do método de imagem de molécula única, Cortinas de DNA, para estudar o mecanismo biofísico dos condensados EWS-FLI1 que se reúnem no DNA.

Imagem de molécula única de condensados EWS-FLI1 montados no DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

Fornecemos um único ensaio de molécula para observar a separação de fases dos fatores de transcrição no DNA Esta técnica permite a realização em tempo real do processo dinâmico de montagem de fatores de transcrição como uma gota líquida no DNA. O EWS-FL1 é um dos genes de fusão mais frequentemente envolvidos na tumorigênese do sarcoma de Ewing. Nossa pesquisa poderia identificar a relação entre o número de motivos de DNA e a formação de condensado EWS-FL1, que está associada a uma transcrição de genes estéreis em células tumorais e talvez útil para o prognóstico.Este método poderia ser aplicado para estudar quaisquer condensados de transcrição ou complexos in vitro, como P53 e MED1. Para preparar uma célula de fluxo com barreiras nano fabricadas em ziguezague para um experimento de cortina de DNA, conecte os tubos de entrada e saída na direção correta. Em seguida, lave a célula de fluxo com 2,5 mililitros de tampão lipídico usando duas seringas de três mililitros, garantindo que não haja bolha na célula de fluxo.Remova a seringa da saída e injete um mililitro da solução de lipossomo três vezes com uma incubação de cinco minutos entre cada injeção. Para a cicatrização, relave a célula de fluxo com 2,5 mililitros de tampão lipídico lentamente e incube à temperatura ambiente por 30 minutos. Durante a incubação, prepare o buffer BSA conforme mencionado no manuscrito do texto.Em seguida, após 30 minutos de cicatrização, lave a célula de fluxo com 2,5 mililitros de tampão BSA do lado de saída. Em seguida, injete 800 microlitros de tampão de estreptavidina na célula de fluxo do lado de entrada em duas etapas com uma incubação de 10 minutos após cada etapa. Em seguida, lave a célula de fluxo com 2,5 mililitros de tampão BSA para remover todas as moléculas de estreptavidina livres.Em seguida, dilua o DNA Lambda de biotina com motivos clonados usando tampão BSA e injete-o quatro vezes lentamente em intervalos de cinco minutos. Durante a injeção, ligue o microscópio no sistema científico complementar de semicondutores de óxido de metal. Em seguida, lave a tubulação com 10 mililitros de água destilada dupla e lave o prisma e o conector da tubulação com água, limpador de cuvete líquido a 2% e etanol a 99%.Em seguida, desenhe pelo menos 20 mililitros do tampão de imagem em uma seringa de 30 mililitros. Configure a célula de fluxo no estágio do microscópio e conecte-a ao sistema microfluídico. Usando uma taxa de fluxo de 0,03 mililitros por minuto, lave as moléculas de DNA para a barreira por 10 minutos.Em seguida, desligue o sistema microfluídico e incube por 30 minutos. com o fluxo interrompido, permitindo que o DNA se difunda lateralmente. Para obter a imagem da formação de condensação do EWS-FLI1 em cortinas de DNA, abra o software de imagem e encontre e marque as posições dos nove padrões em ziguezague sob campo brilhante.Em seguida, ligue o fluxo a 0,2 mililitros por minuto para manchar o DNA com corante de DNA de fita dupla por 10 minutos. Em seguida, dilua a proteína mCherry EWS-FLI1 com o tampão de imagem a uma concentração de 100 nanomoles em 100 microlitros. Em seguida, carregue a amostra de proteína através da válvula com uma seringa de vidro de 100 microlitros e altere a taxa de fluxo para 0,4 mililitros por minuto.Depois de ligar o laser de 488 nanômetros, faça a pré-varredura de cada região para verificar o estado de distribuição do DNA e selecionar a região na qual as moléculas de DNA se distribuem uniformemente. Em seguida, defina a potência do laser para 10% para o laser de 488 nanômetros e 20% para o laser de 561 nanômetros. E usando o medidor de energia, meça a potência real do laser perto do prisma.Comece a adquirir imagens em intervalos de dois segundos com lasers de 488 e 561 nanômetros simultaneamente. Em seguida, altere a válvula do modo manual para o modo de injeção para permitir que o tampão de imagem libere a amostra de proteína na célula de fluxo após 60 segundos. Para remover o EWS-FLI1 livre, lave a célula de fluxo com o buffer de imagem por cinco minutos com apenas o laser de 561 nanômetros ligado.Em seguida, pare o fluxo e incube a 37 graus Celsius por 10 minutos. Após 10 minutos, ligue o fluxo a 0,4 mililitros por minuto para deixar o DNA se estender e adquirir imagens em intervalos de dois segundos entre diferentes quadros para obter dados de alto rendimento da formação de condensado EWS-FLI1. As moléculas EWS-FLI1 foram visualizadas detectando-se os sinais EWS-FLI1 marcados com mCherry obtidos com um laser de 561 nanômetros.A formação in vitro de condensado EWS-FLI1 no local das 25 repetições GGAA no substrato de DNA pôde ser visualizada diretamente. A especificidade do mCherry EWS-FLI1 utilizado em cortinas de DNA foi confirmada por um ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforética usando um molde de DNA com e sem as 25 repetições GGAA separadamente. Quando a concentração de EWS-FLI1 foi titulada de 20 a 500 nanomoles, a intensidade de EWS-FLI1 aumentou drasticamente.Considerando que a mudança na intensidade do FLI de um DBD foi insignificante quando as proteínas foram saturadas para cobrir as repetições GGAA, sugerindo que o EWS-FLI1 formou condensados no DNA. A injeção deve ser muito lenta e macia para que o lipossomo e o DNA possam se distribuir uniformemente na célula de fluxo. É importante realizar a MSA para confirmar que um fator de transcrição purificado se liga especificamente à sequência alvo in vitro.Essa técnica permite que as pessoas explorem se o condensado facilitará a busca alvo dos fatores de transcrição e seu efeito na transcrição.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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