Análise Citométrica de Fluxo para Identificação das Células Imunes Inatas e Adaptativas do Pulmão murino
16 de novembro de 2021
Neste estudo, apresentamos um protocolo eficaz e reprodutível para isolar as populações imunes do sistema respiratório murino. Também fornecemos um método para a identificação de todas as células imunes inatas e adaptativas que residem nos pulmões de camundongos saudáveis, usando um painel de citometria de fluxo baseado em 9 cores.
Como o pulmão possui um sistema imunológico muito complexo e único, várias estratégias de identificação de células imunes pulmonares foram desenvolvidas e relatadas. A existência de diversas abordagens diferentes dificulta a comparação de resultados gerados por diferentes laboratórios. Nossa estratégia de gating fornece uma maneira abrangente e reprodutível de identificar até 12 populações imunes pulmonares e não mieloides usando nove marcadores.
O presente protocolo descreve a caracterização e identificação de populações imunes pulmonares em condições de estado estável. No entanto, este protocolo pode ser empregado para identificar alterações dessas populações de células em vários modelos de doenças, onde pode ajudar a identificar alterações específicas da doença da paisagem imunológica pulmonar. Os pesquisadores que realizam essa técnica pela primeira vez devem prestar atenção às condições de digestão e reagentes, pois fazem uma grande diferença na liberação de células imunes do tecido pulmonar.
Comece preparando o animal eutanizado para a cirurgia. Estabilize o rato dorsalmente usando agulhas ou fitas nas quatro extremidades, depois use 70% de etanol para higienizar a pele da área ventral. Faça uma incisão do pescoço para o abdômen.
Remova a pele da área torácica, juntamente com as costelas e o esterno. Lave os pulmões injetando 10 mililitros de PBS frio no ventrículo direito usando uma agulha de 18 a 21 graus até ficarem completamente brancos. Em seguida, remova o timo e o coração sem tocar nos pulmões.
Retire os pulmões dos tecidos circundantes e transfira-os para um tubo contendo tampão BSA frio. Transfira o pulmão para uma placa de Petri, pique-o usando dois bisturis finos, e, em seguida, coloque-o em um tubo cônico de 50 mililitros. Adicione cinco mililitros de tampão de digestão para lavar a placa.
Fixar a tampa do tubo e digerir o pulmão por 30 minutos em um agitador orbital a uma velocidade de 150 rotações por minuto a 37 graus Celsius. Pare a reação adicionando 10 mililitros de tampão BSA frio. Após a digestão, misture e dissolva os pedaços pulmonares usando uma agulha de calibre 18.
Coloque um filtro de filtro de 70 micrômetros em cima de um novo tubo cônico de 50 mililitros e transfira a mistura pulmonar digerida para o coador. Use o lado de borracha de um êmbolo de seringa de 10 mililitros para esmagar as peças de pulmão restantes no filtro e lavá-lo com tampão BSA. Centrifugar a suspensão unicelular a 350 G por oito minutos a sete graus Celsius.
Descarte o supernatante e resuspenja as células em um mililitro de tampão de lise ACK. Misture a suspensão usando uma pipeta de um mililitro e incuba-a por 90 segundos à temperatura ambiente. Adicione 10 mililitros de tampão BSA frio à mistura de reação e centrifuse-o a 350 G por sete minutos a quatro graus Celsius.
Descarte o supernatante, resuspenque a pelota no tampão de coloração e conte as células usando um hemótmetro. Resuspend as células a uma concentração de 5 milhões de células por mililitro para coloração superficial. Transfira 1 milhão de células em 200 microliters por poço em uma placa de 96 poços e centrifugar a placa a 350 G por sete minutos a quatro graus Celsius.
Prepare uma solução de bloco de citometria de fluxo diluindo anticorpos anti-1632 no tampão de coloração. Resuspense as células em 50 microliters da solução de bloco de citometria de fluxo. Incubar a suspensão por 15 a 20 minutos a quatro graus para Celsius ou no gelo.
Em seguida, adicione 150 microliters de tampão de coloração à placa e centrífuga 350 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Prepare a solução de anticorpos superficiais diluindo os anticorpos superficiais no tampão de coloração. Resuspenque as células em 50 microliters da solução de anticorpos superficiais e incuba a placa a quatro graus Celsius no escuro.
Em seguida, lave as células duas vezes com tampão de coloração. Prepare o tampão de fixação e permeabilização misturando três partes de fixação e diluente de permeabilização e uma parte do tampão de coloração. Resuspenque as células em 50 microliters do buffer pré-preparado por poço da placa de 96 poços e incuba-as por 20 a 25 minutos a quatro graus Celsius no escuro.
Diluir o tampão de permeabilização com água deionizada purificada para preparar uma vez o tampão de permeabilização e usá-lo para lavar as células. Prepare uma solução de anticorpos intracelulares diluindo com um mililitro de tampão de permeabilização. Resuspenque as células em 50 microlitres da solução de anticorpos intracelular diluídos por poço da placa de 96 poços e incubar por 40 minutos a quatro graus Celsius no escuro.
Lave as células com tampão de permeabilização e, em seguida, com tampão de coloração. Após a lavagem final, resuspenja as células em 200 microliters de tampão de coloração. Adquira um mínimo de 1,5 milhão de células por amostra no citômetro de fluxo.
Após uma cirurgia bem sucedida e procedimento pós-operatório adequado, os detritos e dobras foram excluídos por meio de uma estratégia de gating. As células imunes foram identificadas utilizando o marcador CD45+hematopoiético por citometria de fluxo. As células eram distinguidas como vivas ou mortas.
As células pulmonares imunes foram categorizadas em três grupos usando anticorpos anti-GR-1 e anti-CD68. Os neutrófilos foram identificados e verificados utilizando-se Ly6G como um marcador único. A população CD45+também contém células assassinas naturais, células T e células B.
Estas células foram manchadas e verificadas por anticorpos assassinos naturais 1.1, CD3 e B220. A lavagem broncoalveolar identificou eosinófilos positivos para o marcador CD11b, e macrófagos alveolares que não expressaram altos níveis de CD11b. CÉLULAs CD45+dendríticas foram encontradas e confirmadas pela expressão CD24.
Essas células apresentaram uma resposta positiva ou negativa em relação aos marcadores CD103 e CD11b. As células negativas CD103 foram classificadas como células dendríticas convencionais e derivadas de monócitos com base na expressão CD64. as células dendríticas derivadas do monócito foram baixas positivas para o marcador dendrático CD24 e positivas para o marcador pan-macrófago CD64.
Macrófagos intersticiais com monócitos clássicos e não clássicos foram distinguidos com base na expressão CD64 e GR-1. Estas células mostraram expressão positiva para o receptor de quimioterapia CX3C um. Os passos mais importantes neste procedimento são a colheita adequada de tecidos, digestão e preparação de suspensão unicelular, e gating em células vivas e singlets.
Além de caracterizar células imunes do pulmão por citometria de fluxo, a cultura celular e ensaios funcionais podem ser realizados em populações celulares isoladas. Essa técnica pode abrir caminho para os pesquisadores explorarem novas questões em doenças do pulmão, como infecções, doenças autoimunes e câncer.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo abrangente para o isolamento de populações imunes no sistema respiratório murino. Ele detalha um método reprodutível para identificar células imunes inatas e adaptativas nos pulmões de camundongos saudáveis utilizando um painel de citometria de fluxo com 9 cores.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imunologia
- Biologia Respiratória
- Citometria de Fluxo
Contexto
- O pulmão possui um sistema imunológico complexo.
- Existem diversas estratégias de seleção para identificar células imunes pulmonares.
- A comparação de resultados entre laboratórios pode ser desafiadora.
- Compreender as populações imunes pulmonares é crucial para a pesquisa de doenças.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um método padronizado para identificar células imunes pulmonares.
- Facilitar comparações entre populações de células imunes em diferentes estudos.
- Permitir a identificação de alterações específicas da doença na imunidade pulmonar.
Métodos Utilizados
- Desenvolvimento de um painel de citometria de fluxo com 9 cores.
- Aplicação de estratégias específicas de seleção para identificação de células imunes.
- Caracterização de populações imunes em condições de estado estável.
- Adaptação do protocolo para uso em diversos modelos de doenças.
Resultados Principais
- Identificação de até 12 diferentes populações imunes pulmonares.
- Demonstração da reprodutibilidade no isolamento de células imunes.
- Conhecimentos sobre a paisagem imune pulmonar em estado estável.
- Potencial para aplicação no estudo de alterações relacionadas a doenças.
Conclusões
- O protocolo oferece um método confiável para análise de células imunes pulmonares.
- Pode aprimorar a compreensão da imunidade pulmonar em condições de saúde e doença.
- A atenção às condições de digestão é essencial para resultados ideais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A identificação padronizada de populações imunes pulmonares murinas permite a imunofenotipagem pré-clínica reprodutível entre modelos de doenças. Essa abordagem de citometria de fluxo auxilia na validação de alvos ao fornecer leituras quantitativas de células imunes que esclarecem as vias mecanicistas na fisiopatologia respiratória. O protocolo aumenta a confiança preditiva na fase inicial de descoberta, reduzindo a variabilidade biológica nas avaliações da paisagem imune.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da quantificação precisa de subpopulações de células imunes inatas e adaptativas no pulmão de camundongos.
- Valor Operacional: Fornece uma estratégia reprodutível de seleção de eventos para identificação consistente de células imunes entre laboratórios e estudos.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos biológicos ao esclarecer as contribuições das células imunes para a homeostase pulmonar e os mecanismos da doença.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Gera suspensões padronizadas de células individuais adequadas para ensaios funcionais e triagem de compostos.
- Valor Operacional: Fornece resultados quantitativos de citometria de fluxo que permitem padronização e reprodutibilidade de ensaios no perfilhamento imune.
- Escalabilidade: Facilita a preparação de populações de células imunes validadas para avaliação em alto rendimento de compostos imunomoduladores.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Permite a identificação de alterações específicas da doença na paisagem imunológica pulmonar em modelos de infecção, autoimunidade e câncer.
- Continuidade Translacional: Apoia a transição da descoberta à validação pré-clínica, permitindo o monitoramento imunológico longitudinal.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Esclarece fenótipos e funções de células imunes para orientar estratégias de seleção de alvos e modulação de vias.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho da biologia de descoberta ao fornecer fenotipagem imunológica padronizada que orienta as etapas de validação de alvos e desenvolvimento de ensaios.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias por meio da análise quantitativa de subpopulações de células imunes no tecido pulmonar.
- Triagem: Permite a preparação do ensaio ao gerar populações reprodutíveis de células imunes para avaliação de compostos e análise de biomarcadores.
- Análises: Fornece leituras multiparamétricas de citometria de fluxo que facilitam a comparação de respostas imunes entre diferentes condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas iniciais à continuidade pré-clínica ao permitir o monitoramento imune em modelos de doenças.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma capacidade padronizada de perfilagem imune que pode ser aplicada em diversos programas de doenças respiratórias.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece confiança preditiva na validação de alvos por meio da quantificação precisa de células imunes e resolução de subpopulações.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade dos procedimentos de isolamento e marcação de células imunes entre diferentes locais.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avanço ou interrupção de projetos ao reduzir a ambiguidade mecanicista nas respostas imunes pulmonares.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos imunomoduladores com base em dados quantitativos do panorama imunológico.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em citometria de fluxo, coloração celular e identificação de células imunes.
- Necessita de acesso a citômetro de fluxo, equipamentos de centrifugação e instalações estéreis de cultura de tecidos.
- Exige padronização dos protocolos de digestão de tecidos para garantir rendimento e viabilidade consistentes de células imunes.
- Requer otimização de painéis de anticorpos e condições de coloração para subpopulações imunes específicas de interesse.
- Envolve consideração do tempo de processamento do tecido e dos efeitos da estabilidade dos reagentes sobre a preservação de epítopos celulares imunes.
