Name: Geração organoide cerebral a partir de células-tronco pluripotentes induzidas em mini-bioreatores caseiros (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Aprenda a gerar organoides cerebrais a partir de células-tronco pluripotentes induzidas usando mini-bioreatores caseiros. Este método permite produzir modelos 3D de tecido cerebral humano para estudo de patologias do sistema nervoso central e testes farmacológicos.

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Este trabalho foi apoiado pela subvenção 075-15-2019-1669 do Ministério da Ciência e Educação Superior da Federação Russa (análise RT-PCR) e pela concessão nº 19-15-00425 da Fundação Russa de Ciência (para todos os outros trabalhos). Os autores também agradecem a Pavel Belikov por sua ajuda na edição de vídeo. Figuras do manuscrito foram criadas com BioRender.com.

NOTA : Utilize técnica estéril em todo o protocolo, excluindo as etapas 1.2 e 1.3. Aqueça todos os meios de cultura e soluções a 37 °C antes de aplicar em células ou organoides. Cultivar células em uma incubadora de CO2 a 37 °C em 5% de CO2 em 80% de umidade. O esquema de protocolo é mostrado na Figura 1.
1. Transformando placas de Petri em mini bioreatores
<ol><li>Corte tubos de centrífugas estéreis de 15 mL em anéis de 7-8 mm de altura; autoclave os anéis.</li>
	<li>Quebre a baixa adesão, placas de Petri não tratadas ou microbiológicas em migalhas. Dissolva cerca de 1 g de migalhas plásticas em 10 mL de clorofórmio durante a noite para preparar plástico líquido. ATENÇÃO: Trabalhe em um capô de fumaça.</li>
	<li>Verifique se o plástico líquido resultante é viscoso o suficiente para a pipetação; sua queda retém uma forma esférica e não se espalha na superfície. Se for muito líquido, adicione mais migalhas de plástico. Se for grosso, adicione clorofórmio.</li>
	<li>Faça um botão de plástico no centro de uma placa de Petri ultra-baixa estéril de 6 cm. Existem duas maneiras igualmente adequadas, conforme detalhado abaixo.<ol>
<li>Coloque o anel de plástico autoclavado no centro e solte o plástico líquido no interior do anel.</li>
		<li>Sem nenhum anel de plástico, deixe cair o plástico líquido no centro da placa de Petri.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Deixe os pratos abertos por 2-3 h em uma capa de fluxo laminar até que sequem completas. Trate os pratos secos com radiação ultravioleta por 15-20 min.</li>
</ol>2. Indução da diferenciação neuronal dos iPSCs
<ol><li>Cultivar iPSCs no meio para células-tronco pluripotentes até 75-90% de confluência em placas de Petri de 35 mm pré-revestidas com uma matriz composta por proteínas extracelulares.</li>
	<li>Prepare o meio A-SR. Consulte a Tabela 1 para obter detalhes.</li>
	<li>Aspire o meio de cultivo e adicione 2 mL de meio A-SR no dia 0 de diferenciação.</li>
	<li>Prepare o meio A (ver Tabela 2).</li>
	<li>Cultivar células em média A por duas semanas entre os dias 2 e 14, meio refrescante em pratos petri a cada dois dias.</li>
</ol>3. A formação de esferoides a partir de células precursoras neuroepiteliais no dia 14
<ol><li>No dia 14, faça esferoides a partir de células precursoras neuroepiteliais usando uma placa de cultura especial de 24 poços contendo aproximadamente 1.200 microwells em cada poço(Figura 2C). Acompanhe o procedimento abaixo. NOTA: Nesta fase de diferenciação, uma placa de Petri de 35 mm geralmente contém 3 - 3,5 x 106 células precursoras neuroepitheliais. Assim, uma placa de Petri de 35 mm com células precursoras neuroepitenelianas é suficiente para 3 - 4 poços de placa de cultura de 24 poços com microwells.</li>
	<li>Prepare uma placa de cultura de 24 poços com microwells: Para cada poço, adicione 1 mL de média A. Centrífuga brevemente a 1.300 x g por 5 min em rotor de balde balançando equipado com porta-placas. Controle sob o microscópio que não há bolhas em microwells.</li>
	<li>Prepare o meio B (Tabela 3).</li>
	<li>Remover o meio da placa de Petri com células precursoras neuroefitelais; lavar as células com 2 mL de DMEM/F12. Para o descolamento celular, trate as células com 1,5 mL de solução EDTA de 0,48 mM preparada em PBS. Controle o desprendimento celular sob o microscópio.</li>
	<li>Colhe as células em um tubo de 15 mL. Adicione 5 mL de DMEM/F12 no tubo para lavar as células. Centrifugar a 200 x g por 5 min. Remova as células supernascidas e resuspendes em 2 mL de média B.</li>
	<li>Verifique a concentração e viabilidade celular por staining Trypan Blue e um hemócitometro. Calcule o volume de suspensão necessário para conter 1 x 106 células viáveis no total.</li>
	<li>Transfira a suspensão celular contendo 1 x 106 células em cada poço de uma placa de 24 poços com microwells. Adicione b médio até 2 mL em cada poço, células de pipeta suavemente para cima e para baixo várias vezes, e centrífuga brevemente 100 x g por 1 min para capturar células nos microwells. NOTA: O número de células por poço não deve exceder 1 x 106. Caso contrário, esferoides de microwells vizinhos se fundem.</li>
	<li>Verifique sob o microscópio que as células são distribuídas uniformemente em microwells. Reincidente a pipetação e a centrifugação se as células forem distribuídas de forma irregular.</li>
	<li>Incubar a placa durante a noite para permitir que as células se acumulem em esferoides.</li>
</ol>4. Obtenção e cultivo de organoides
<ol><li>Na manhã seguinte (dia 15), verifique a qualidade dos esferoides sob o microscópio. Certifique-se de que são transparentes e suaves, se saudáveis(Figura 2A,B). Colete cuidadosamente os esferoides de cada poço em um tubo de 15 mL, deixe os esferoides precipitarem pela gravidade por 2-3 minutos e, em seguida, remova o sobrenante.</li>
	<li>Adicione aos esferoides 2 mL da matriz descongelada durante o mesmo tempo no gelo. Misture suavemente por pipetar e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos.</li>
	<li>Para lavar o excesso da matriz, adicione ao tubo 8 mL de B médio. Pipeta suavemente, em seguida, centrifugar o tubo por 1 min a 100 x g. NOTA: Não exceda o tempo e a velocidade da centrifugação para evitar a agregação irreversível de esferoides.</li>
	<li>Remova o supernatante. Adicione ao tubo 2 mL de B médio, pipeta suavemente. Divida a suspensão esferoide entre dois mini bioreatores, cada um contendo 4 mL de médio B. Coloque os mini bioreatores em uma placa de Petri de 15 cm para evitar a evaporação da água e para evitar contaminação.</li>
	<li>Coloque a placa de Petri com mini bioreatores em um agitador orbital. Cultive os organoides a uma taxa de rotação de 70-75 rpm.</li>
	<li>No dia 16, prepare o meio C (Tabela 4).</li>
	<li>Transfira os organoides para tubo de 15 mL. Por 5 min, deixe-os cair para o fundo, aspirar o supernante, adicionar 5 mL de C médio. Devolva os organoides para os mini bioreatores. NOTA: Tenha cuidado para não perder os esferoides, que são transparentes e pouco visíveis.</li>
	<li>Cultivar esferoides em C médio por duas semanas, refrescando o meio a cada dois dias. Ao final dessas duas semanas, deixe cerca de 100 esferoides por mini bioreator para o cultivo seguinte. Congele eferóides excessivos em um meio de congelamento em nitrogênio líquido.</li>
	<li>No dia 30, prepare o meio D (Tabela 5).</li>
	<li>Mude o cultivo médio para médio D, que é um meio de maturação. Atualize o meio de cultivo a cada 2-3 dias durante três semanas e use o médio D sem BDNF e GDNF.</li>
</ol>

<ol><li>Marchetto, M. C., Winner, B., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+in+neurodegenerative+and+neurodevelopmental+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases.</a> Human Molecular Genetics. 19, 71-76 (2010).</li>
<li>Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+brain+Organoids+derived+from+pluripotent+stem+cells%3A+promising+experimental+models+for+brain+development+and+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">3D brain Organoids derived from pluripotent stem cells: promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders.</a> Journal of Biomedical Science. 24 (1), 1-12 (2017).</li>
<li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+axial+polarity%2C+inside+out+layer+pattern%2C+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell-derived+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Self-organization of axial polarity, inside out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (50), 20284(2013).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+regionally+specified+hPSC+derived+organoids+models+human+brain+development+and+interneuron+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Fusion of regionally specified hPSC derived organoids models human brain development and interneuron migration.</a> Cell Stem Cell. 21, 383-398 (2017).</li>
<li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+polarized+cerebellar+tissue+in+3D+culture+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells.</a> Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).</li>
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<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+brain+region+specific+organoids+using+a+miniaturized+spinning+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of human brain region specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor.</a> Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).</li>
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<li>Chen, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cell+platforms+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cell platforms for drug discovery.</a> Trends in Molecular Medicine. 24 (9), 805-820 (2018).</li>
<li>Dang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+depletes+neural+progenitors+in+human+cerebral+organoids+through+activation+of+the+innate+immune+receptor+TLR3%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).</li>
<li>Tiwari, S. K., Wang, S., Smith, D., Carlin, A. F., Rana, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+tissue-specific+SARS-CoV-2+infection+and+host+responses+using+human+stem+cell-derived+lung+and+cerebral+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Revealing tissue-specific SARS-CoV-2 infection and host responses using human stem cell-derived lung and cerebral organoids.</a> Stem Cell Reports. 16 (3), 437-445 (2021).</li>
<li>Ao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-stop+microfluidic+assembly+of+human+brain+organoids+to+model+prenatal+cannabis+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">One-stop microfluidic assembly of human brain organoids to model prenatal cannabis exposure.</a> Analytical Chemistry. 92 (6), 4630-4638 (2020).</li>
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<li>Jo, J., Xiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midbrain+like+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+contain+functional+dopaminergic+and+neuro+melanin+producing+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).</li>
<li>Matsui, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Six-month+cultured+cerebral+organoids+from+human+ES+cells+contain+matured+neural+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Six-month cultured cerebral organoids from human ES cells contain matured neural cells.</a> Neuroscience Letters. 670, 75-82 (2018).</li>
<li>Trujillo, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+oscillatory+waves+emerging+from+cortical+organoids+model+early+human+brain+network+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Complex oscillatory waves emerging from cortical organoids model early human brain network development.</a> Cell Stem Cell. 25 (4), 558-569 (2019).</li>
<li>Eremeev, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necessity+Is+the+mother+of+invention%E2%80%9D+or+inexpensive%2C+reliable%2C+and+reproducible+protocol+for+generating+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+%28Moscow%29%22%5BJournal%5D)">Necessity Is the mother of invention” or inexpensive, reliable, and reproducible protocol for generating organoids.</a> Biochemistry (Moscow). 84 (3), 321-328 (2019).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+brain+region%E2%80%93specific+organoids+using+a+miniaturized+spinning+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of human brain region–specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor.</a> Nature Protocols. 13, 565-580 (2018).</li>
<li>Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularization+of+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Vascularization of human brain organoids.</a> Stem Cells. 39 (8), 1017-1024 (2021).</li>
<li>Hall, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned%2C+organoid-based+cartilaginous+implants+exhibit+zone+specific+functionality+forming+osteochondral-like+tissues+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Patterned, organoid-based cartilaginous implants exhibit zone specific functionality forming osteochondral-like tissues in vivo.</a> Biomaterials. 273, 120820(2021).</li>
<li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+enteroids%2Fcolonoids+and+intestinal+organoids+functionally+recapitulate+normal+intestinal+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 3759-3766 (2016).</li>
<li>Eremeev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids%E2%80%94challenges+to+establish+a+brain+prototype%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids—challenges to establish a brain prototype.</a> Cells. 10 (7), 1790(2021).</li>
<li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+axial+polarity%2C+inside-out+layer+pattern%2C+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+Cell-derived+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES Cell-derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110, 20284-20289 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O protocolo descrito tem duas etapas cruciais que permitem a geração de organoides de alta qualidade de tamanho uniforme. Primeiro, os organoides crescem a partir de esferoides que são quase idênticos no número celular e na maturidade celular. Em segundo lugar, os bioreatores caseiros fornecem a cada organoide um ambiente uniforme, onde organoides não se aglomeram ou se mantêm unidos.
A qualidade celular e o estado de maturação celular são essenciais para a execução do protocolo. É fundamental...

Modelos derivados do iPSC humano são amplamente utilizados nos estudos de distúrbios neurodesenvolvimentantes e neurodegenerativos1. Na última década, modelos de tecido cerebral 3D, os chamados organoides cerebrais, essencialmente complementaram as culturas neuronais 2D tradicionais2. Os organoides recapitulam até certo ponto a arquitetura 3D do cérebro embrionário e permitem uma modelagem mais precisa. Muitos protocolos são publicados para a geração de organoides representando diferentes regiões cerebrais: córtex cerebral3,4,5, cerebelo6, cérebro médio, cérebro, hipotálamo7,8,9e hipocampo10. Houve vários exemplos de uso de organoides para estudar doenças do sistema nervoso humano11. Além disso, os organoides foram implementados em descobertas de medicamentos12 e utilizados em estudos de doenças infecciosas, incluindo SARS-Cov-213,14.
Os organoides cerebrais podem atingir até vários milímetros de diâmetro. Assim, a zona interna do organoide pode sofrer de hipóxia ou desnutrição e eventualmente se tornar necrosada. Portanto, muitos protocolos incluem bioreatores especiais8,shakers ou sistemas microfluidos15. Esses dispositivos podem exigir grandes volumes de mídia de cultura celular cara. Além disso, o custo desses equipamentos geralmente é alto. Alguns bioreatores consistem em muitas partes mecânicas que os tornam difíceis de esterilizar para reutilização.
A maioria dos protocolos sofre do "efeito lote"16, que gera variabilidade significativa entre organoides obtidos a partir de iPSCs idênticos. Essa variabilidade dificulta o teste de drogas ou estudos pré-clínicos que requerem uniformidade. O alto rendimento de organoides suficientes para selecionar organoides de tamanho uniforme pode resolver parcialmente este problema.
O fator tempo também é um problema significativo. Matsui et al. (2018) mostraram que os organoides cerebrais requerem pelo menos seis meses para atingir a maturidade17. Trujillo et al. (2019) também demonstraram que a atividade eletrofisiológica ocorreu apenas em organoides após seis meses de cultivo18. Devido ao longo tempo de maturação organoide, os pesquisadores frequentemente lançam uma nova diferenciação antes de completar a anterior. Múltiplos processos paralelos de diferenciação exigem despesas adicionais, equipamentos e espaço de laboratório.
Recentemente desenvolvemos um mini bioreator que resolve principalmente os problemas mencionados acimade 19. Este bioreator caseiro consiste em uma placa de Petri ultra-baixa ou não tratada com um botão plástico no centro. Este botão plástico evita a aglomeração de organoides e sua conglutinação no centro da placa de Petri, que é causada pela rotação do agitador. Este artigo descreve como este mini bioreator caseiro barato e simples permite gerar organoides cerebrais de alta qualidade em grandes quantidades.

<table><tbody><tr><td>Advanced DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td>DMEM/F-12</td></tr><tr><td>AggreWell400</td><td>STEMCELL Technologies Inc</td><td>34425</td><td>Placa de cultura de 24 poços com micropoços</td></tr><tr><td>Suplemento B-27</td><td>Suplemento</td><td>Gibco 17504044</td><td>Neuronal B</td></tr><tr><td>Suplemento GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>200 mM L-alanil-L-glutamina</td></tr><tr><td>BDNF humano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-285</td><td></td></tr><tr><td>Humano FGF-2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-839</td><td></td></tr><tr><td>Humano GDNF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-290</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Substituição</td><td>de Soro Gibco</td><td>10828028</td><td>Substituição de Soro</td></tr><tr><td>mTESR1</td><td>STEMCELL Technologies Inc</td><td>85850</td><td>Meio de células-tronco pliripotentes</td></tr><tr><td>N2 Suplemento</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>17502001</tr><tr><td>Meio Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>Meio basal para manutenção das células neuronais</td></tr><tr><td>Solução de Penicilina-Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140130</td><td></td></tr><tr><td>Plasmocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-mpt-1</td><td>Antimicrobianos</td></tr><tr><td>Purmorlamina</td><td>EMD Millipore</td><td>540220</td><td></td></tr><tr><td>StemMACS Y27632</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-106-538</td><td>Y27632</td></tr><tr><td>StemMACS Dorsomorphin</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-466</td><td>Dorsomorphin</td></tr><tr><td>StemMACS LDN-193189</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-106-540</td><td>LDN-193189</td></tr><tr><td>StemMACS SB431542</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-106-543</td><td>SB431542</td></tr><tr><td>Solução Trypan Blue</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Solução Versen</td><td>Gibco</td><td>15040066</td><td>EDTA 0,48 mM em PBS</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td></td></tr></tbody></table>

geração organoide cerebral a partir de células-tronco pluripotentes induzidas em mini-bioreatores caseiros

Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors

O organoide cerebral derivado do iPSC é uma tecnologia promissora para modelar in vitro as patologias do sistema nervoso e o rastreamento de drogas. Essa tecnologia surgiu recentemente. Ainda está em sua infância e ainda tem algumas limitações não resolvidas. Os protocolos atuais não permitem que a obtenção de organoides seja consistente o suficiente para a descoberta de drogas e estudos pré-clínicos. O amadurecimento dos organoides pode levar até um ano, pressionando os pesquisadores a lançar múltiplos processos de diferenciação simultaneamente. Impõe custos adicionais para o laboratório em termos de espaço e equipamentos. Além disso, organoides cerebrais geralmente têm uma zona necrosada no centro, que sofre de deficiência de nutrientes e oxigênio. Assim, a maioria dos protocolos atuais utiliza um sistema circulante para o meio cultural para melhorar a nutrição.
Enquanto isso, não há sistemas dinâmicos baratos ou bioreatores para o cultivo organoide. Este artigo descreve um protocolo para a produção de organoides cerebrais em minirepartores caseiros compactos e baratos. Este protocolo permite a obtenção de organoides de alta qualidade em grandes quantidades.

O esquema de protocolo é mostrado na Figura 1. O protocolo incluiu cinco mídias nas quais os iPSCs se diferenciaram em organoides cerebrais durante pelo menos um mês. A diferenciação foi iniciada, então os iPSCs atingiram a confluência de 75-90% (Figura 2A,B). Os primeiros sinais de diferenciação em relação aos neurônios foram observados nos dias 10-11 do cultivo do iPSC no médio A, quando as células começaram a se agrupar em "rosetas"<strong cl...

Aqui descrevemos um protocolo para a geração de organoides cerebrais a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs). Para obter organoides cerebrais em grandes quantidades e de alta qualidade, usamos mini bioreatores caseiros.

Geração organoide cerebral a partir de células-tronco pluripotentes induzidas em mini-bioreatores caseiros

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology ...

Até o momento, os organoides cerebrais diferenciados das células-tronco pluripotentes é um modelo 3D vitro mais próximo do tecido cerebral humano nativo. Além disso, os organoides cerebrais são igualmente adequados para modelar várias patologias do sistema nervoso central, testar substâncias farmacologicamente ativas e também para uso em medicina regenerativa. Enquanto isso, essa tecnologia ainda está em fase inicial de desenvolvimento.O protocolo pode ser dividido em dois grupos, dependendo do método de obtenção de agregados e do cultivo posterior com diferenciação. O primeiro inclui protocolo e esquemas de diferenciação, diferentes no tempo de cultivo e indutores de diferenciação com posterior maturação de organoide no shaker em dispositivos especiais de baixa adesão, como tubos de mercado ou placas. Outro grupo inclui o uso de um bioreatores especial.A análise de vários protocolos demonstrou que os organoides devem ser cultivados em condições com meio de nutrientes circulante. No entanto, a ausência de sistemas simples e baratos para a obtenção de organoides com tamanho padrão e morfologia exigem o desenvolvimento de tais dispositivos para dimensionamento do processo. Neste trabalho, descrevemos nosso método de obtenção e teste mini bioreatores simples e baratos que possibilitam a obtenção de grandes quantidades de organoides de alta qualidade.Corte os tubos de centrífugas estéreis de 15 mililitros nos anéis, 7 ou 8 milímetros de altura. Autoclave os anéis. Quebre baixas agregações em placas de Petri tratadas ou microbiológicas em migalhas.Dissolva cerca de 1 gramas de migalhas plásticas em 10 mililitros de clorofórmio durante a noite para preparar um plástico líquido. Faça um botão de plástico no centro de uma placa de Petri ultra baixa adesão estéril de 6 centímetros. Há duas maneiras igualmente adequadas.O primeiro, coloque a autoclave em um anel de plástico em um centro e aplique meio mililitro de plástico líquido no interior do anel. O segundo, sem nenhum anéis de plástico, derrube meio mililitro de plástico líquido no centro da placa de Petri. Deixe os pratos abertos por 2 ou 3 horas em um capô de fluxo laminar até a secura completa.Cultivar células-tronco pluripotentes induzidas no meio para células-tronco pluripotentes, até 75 ou 90% de confluência nas placas de Petri de 35 milímetros, pré-revestidas com uma matriz dissolida no frio Dulbecco Modified Eagle Medium, e fisher-12 médio. Prepare o meio A mais substituição de soro. Cultivar células-tronco pluripotentes induzidas por 1 dia no meio com substituição de soro.Mude o meio para células-tronco pluripotentes para um meio de substituição de soro no dia zero de diferenciação. Prepare o médio A.Mude o médio para médio A no dia 2 de diferenciação. Cultivar células no meio A por 2 semanas, meio refrescante em pratos petri a cada 2 dias.No dia 14, inicie a formação de esferoide usando uma placa de cultura especial de 24 poços que contém aproximadamente 1.200 microwells em cada poço. Prepare uma placa de cultura de 24 poços com microwells. Adicione a cada poço 1 mililitro de médio A, centrífuga brevemente a 1,300g por 5 minutos em um rotor de balde balançando equipado com suporte de placa.Controle sob o microscópio que não há bolhas em microwells. Prepare o B médio.Retire o meio da placa de Petri. Para o descolamento celular, trate as células com solução EDTA de 1,5 mililitros preparadas em PBS.Controle o desprendimento celular sob o microscópio. Colme a célula em tubo de 15 mililitros. Adicione 5 mililitros misturados Dulbecco e fisher médio no tubo em direção às células.Centrífuga a 200g por 5 minutos. Remova as células supernasceres e suspendam-se em 2 mililitros de B médio.Transfira a suspensão das células contendo 1 bilhão de células em cada poço de uma placa de 24 poços com microwells. Células de pipeta suavemente até e para baixo várias vezes e centrífuga brevemente 100g por 1 minuto para capturar células em microwells.Controle sob o microscópio que a célula é distribuída uniformemente em microwells. Incubar a placa durante a noite para agregação celular em esferoides. Na manhã seguinte, dia 15, verifique sob os microscópios a qualidade dos esferoides, que são transparentes e suaves se saudáveis.Colete cuidadosamente os esferoides de cada poço em um tubo de 15 mililitros, deixe os esferoides precipitarem pela gravidade por 2 e 3 minutos, e depois remova o sobrenatante. Adicione aos eferóides 2 mililitros da matriz, descongelado e ex tempore no gelo. Misture suavemente por pipetar e incubar em temperatura ambiente por 30 minutos.Para lavar o excesso da matriz, adicione ao tubo 8 mililitros de B.Pipette média suavemente, em seguida, centrifugar o tubo por 1 minuto a 100g. Remova o supernatante. Adicione ao tubo 20 mililitros de B médio, pipeta suavemente, em seguida, divida a suspensão esferoide entre mini bioreatores.Em seguida, coloque os mini bioreatores em uma placa de Petri de 15 centímetros, o que impede a evaporação da água e a contaminação. Coloque a placa de Petri com mini bioreatores em um agitador orbital. Cultive os organoides a velocidade de rotação 70, 75rpm.No dia 16, prepare organoide médio de transferência para tubo de 50 mililitros. Por 5 minutos, deixe-os cair no fundo. Aspire o supernatante e adicione 5 mililitros do médio C.Junte os organoides nos mini bioreatores.Cultivar esferoides em C médio por 2 semanas, refrescando o meio a cada 2 dias. Durante essas 2 semanas, selecione cerca de 100 esferoides por mini bioreators para o seguinte cultivo. No dia 30, prepare o médio D.Mude o cultivo de médio para médio D, que é um meio de maturação.Refrescar o meio de cultivo a cada 2 ou 3 dias durante 3 semanas. Em seguida, use o D médio dissolvido em F e GDNF. Após 1 mês de cultivo consecutivo nos médios A e B, são obtidos organoides padronizados em tamanho e morfologia.À medida que cresce, eles precisam mudar o meio com mais frequência, até 4 vezes por semana também aumenta. Após 2 meses de cultivo, atingem 4 e 5 milímetros de diâmetro. E depois de mais um mês, 5 e 6 milímetros e o crescimento pára.A figura mostra o aparecimento de enzima organoide, seções claras pintadas com hematoxilina e eosina. A análise imunohistoquímica por 1 mês mostra a presença de grupos positivos SOX2 de células progenitoras, inclusive dentro da parte central. No periférico dos organoides, proteína ácida fibrilar gliana, proteína associada a microtúbulos 2 e hidrolase de tiazina positiva.As células estão concentradas, o que corresponde à forma madura de neurônios. Em alguns casos, grupos de brancos na área necrosada são formados na parte central. Isso indica a limitação deste protocolo para a obtenção de organoides maiores.Provavelmente, o fator limitante do crescimento é a taxa de difusão de nutrientes e oxigênio. Os vários tipos de esferoides de mídia e células e testando nosso sistema para alguns tipos de organoides. Muitos cérebros e retinas, organoides combinados de células carcinoma hepáticas e células-tronco mesenquimais, organoides combinados de chamadas de tronco mesenquimal de explosão capital e a diferenciação de células-tronco hematopoiéticas de células-tronco pluripotentes induzidas e organoides intestinais.Foi variável na composição inicial das células? Fatores de diferenciação, cultura e matriz média, extracelular, e possivelmente também a composição da mistura de gás, a taxa de rotação da plataforma e outros parâmetros. Será possível obter organoide com a mesma forma, tamanho ou modelo de morfologia em vários órgãos e tecidos.O uso de mini bioreatores propostos neste trabalho.

brain-organoid-generation-from-induced-pluripotent-stem-cells-home

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

O vídeo demonstra um método para gerar organoides cerebrais humanos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas. Ele mostra como a neuroesfera forma uma camada neuroectodérmica, que suprime a formação de outras camadas germinativas. As neuroesferas são incorporadas em uma matriz de gel 3D e formam brotos neuroepiteliais. Quando incubados com meios organoides, esses brotos neuroepiteliais se diferenciam em regiões cerebrais específicas, resultando na formação de organoides cerebrais...

Um método in vitro para gerar organoides cerebrais humanos

Este vídeo demonstra um ensaio para gerar organoides cerebrais a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). As iPSCs humanas são induzidas a formar corpos embrióides (EBs). Os EBs são cultivados sobre um andaime de polímero usando um meio de indução, promovendo a diferenciação em células-tronco neurais, células progenitoras e neurônios imaturos. Finalmente, os EBs são embutidos em uma matriz e transferidos para um meio de manutenção para a formação de organoides cerebrais.

Geração de Organoides Cerebrais Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas

Este vídeo demonstra uma técnica para gerar organoides cerebelares maduros a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando um biorreator 3D de uso único. O biorreator facilita a formação de agregados iPSC, que então passam por tratamento com uma série de meios de cultura enriquecidos em fatores de crescimento e quimiocinas que induzem a diferenciação dos agregados iPSC em organoides cerebelares maduros. Posteriormente, os organoides são colhidos e criopreservados para análise...

Geração de organoides cerebelares maduros a partir de células-tronco pluripotentes induzidas usando biorreatores de uso único

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Geração de padronizada e reprodutível Forebrain-tipo Organoids Cerebral de humanos induzida por células-tronco pluripotentes

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Um método estática auto-direcionado para gerar organoides cerebrais a partir de células-tronco embrionárias humanas

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Geração escalável de organoides cerebelares maduros de células-tronco pluripotentes humanas e caracterização por imunostaining

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Geração de organoides intestinais derivados de hiPSC para aplicações de modelagem de doenças e desenvolvimento

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Geração, manutenção e caracterização de organoides intestinais e colônicos derivados de células-tronco pluripotentes humanas

Aqui, descrevemos um protocolo para criar organoides cardíacos humanos relevantes de desenvolvimento (hHOs) usando eficientemente células-tronco pluripotentes humanas por auto-organização. O protocolo conta com a ativação sequencial de pistas de desenvolvimento e produz tecidos cardíacos humanos altamente complexos e funcionalmente relevantes.

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Aprenda a gerar organoides cerebrais a partir de células-tronco pluripotentes induzidas usando mini-bioreatores caseiros. Este método permite produzir modelos 3D de tecido cerebral humano para estudo de patologias do sistema nervoso central e testes farmacológicos.

Geração organoide cerebral a partir de células-tronco pluripotentes induzidas em mini-bioreatores caseiros

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