Name: Avaliação do Consumo de Aminoácidos em Células Ósseas Cultivadas e Eixos Ósseos Isolados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Aprenda a avaliar o consumo de aminoácidos em células ósseas cultivadas e eixos ósseos isolados usando aminoácidos radiomarcados. Este método rápido e sensível permite quantificar a captação de nutrientes em diferentes condições experimentais.

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O laboratório Karner é apoiado por subsídios R01 do Instituto Nacional de Saúde (AR076325 e AR071967) para C.M.K.

Todos os procedimentos de camundongos aqui descritos foram aprovados pelos Comitês de Estudos Animais do Centro Médico do Sudoeste da Universidade do Texas, em Dallas. O protocolo de radiação foi aprovado pelo Comitê Consultivo de Segurança de Radiação do Centro Médico do Sudoeste da Universidade do Texas, em Dallas.
1. Absorção de aminoácidos nas células (Protocolo I)
<ol><li>Placa 5 x 104 células ST2 em cada poço de uma placa de cultura de tecido de 12 poços. Células de placa em α-MEM contendo 10% de FBS, 100 U/mL de penicilina e 0,1 μg/mL de estreptomicina (Pen/Strep). Placas de poços extras de células para quantificar o número de células por condição para as normalizações na etapa 1.12. Incubar células em uma incubadora de cultura de células umidificadas a 37 °C com 5% de CO2.</li>
	<li>Cultive as células por 2-3 dias até ficarem confluentes.</li>
	<li>No dia do experimento, preparar as seguintes soluções: 1x Fosfato Tamponado Salino (PBS), pH 7,4 e Krebs Ringers HEPES (KRH) tamponamento, pH 8,0: (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, NaHCO3, 5 mM HEPES, 1 mM D-Glicose). Pré-aqueça a 37 °C.</li>
	<li>Aspirar o meio e lavar as células duas vezes com 1 mL de 1x PBS, pH 7,4. NOTA: Este protocolo também é apropriado para a divisão rápida de células não confluentes. Neste caso, é importante normalizar a radioatividade para o número absoluto de células ou conteúdo de DNA. Além disso, considere aumentar o tamanho da placa de cultura ou do frasco para aumentar o número total de células e os valores de cpm. Isso é importante para determinar empiricamente em uma base individual.</li>
	<li>Aspirar 1x PBS e lavar as células uma vez com 1 mL de KRH.</li>
	<li>Fazer 4 μCi/mL L-[3,4-3 H]-Glutamina meio de trabalho diluindo 4 μL de [1 μCi μL-1] L-[3,4-3 H]-Glutamina por 1 mL de KRH. NOTA: Antes de usar materiais radioativos, entre em contato com o Escritório de Segurança de Radiação em sua instituição de origem para obter aprovações. Todos os procedimentos relacionados à radiação devem ser realizados atrás do escudo de plexiglass.</li>
	<li>Incubar células com 0,5 mL de KRH contendo 4 μCi/mL de L-[3,4-3 H]-Glutamina por 5 min.</li>
	<li>Recolher o meio radioactivo e dispensar no recipiente de resíduos líquidos. Lave as células três vezes brevemente com KRH gelado para terminar a reação. Recolha e descarte todas as lavagens no recipiente de resíduos líquidos radioactivos.</li>
	<li>Adicione 1 mL de SDS de 1% a cada poço e triture 10x para lisar e homogeneizar as células. Transfira os lisados celulares para tubos de 1,5 mL. Descarte placas de cultura celular, pipetas sorológicas e pontas de pipeta no recipiente de resíduos radioativos sólidos.</li>
	<li>Centrífuga a >10.000 x g durante 10 min. Transfira os sobrenadantes para frascos para injetáveis de cintilação contendo 8 ml da solução de cintilação. Misture agitando vigorosamente os frascos para injetáveis de cintilação. Descarte tubos e pontas de pipeta em recipiente de resíduos radioativos sólidos.</li>
	<li>Leia a radioatividade em contagens por minuto (cpm) usando um contador de cintilação. Rejeitar frascos para injetáveis de cintilação no recipiente de resíduos de frascos para injetáveis de cintilação.</li>
	<li>Tripsinar, ressuspender e contar as células das restantes placas não radioactivas de células (ver passo 1.1) para estimar o número de células nas culturas radioactivas lisadas. Usando um hemocitômetro, conte o número de células por poço não radioativo para cada condição experimental. Normalize o cpm da etapa 1.11 para o número estimado de células das placas não radioativas.</li>
	<li>Após a conclusão do experimento, descontaminar o exaustor de cultura celular, a bancada e todos os instrumentos com um spray descontaminante de radioatividade. Finalmente, realize testes de limpeza para garantir que a área de trabalho esteja livre de radiação.</li>
</ol>2. Absorção de aminoácidos em tecidos ósseos recém-isolados (Protocolo II)
<ol><li>Pré-aqueça KRH a 37 °C.</li>
	<li>Eutanasie um rato de 3 dias de idade e remova a pele dos braços. Desarticule o úmero do ombro usando uma tesoura e disseque os dois úmeros. Remova todos os tecidos extemporâneos usando um bisturi e fórceps. Remova as epífises do osso. NOTA: Além dos úmeros, este protocolo pode ser adaptado para fêmures, tíbias e calvárias neonatais, bem como úmeros, fêmures e tíbias isolados de camundongos de 2 e 4 meses de idade (dados não publicados).</li>
	<li>Lavar a medula do osso e pesar as hastes ósseas para normalizar na etapa 2.14.</li>
	<li>Ferva um úmero em 1x PBS a 100 °C por 10 min para descelularizar o osso. O osso fervido descelularizado é usado como um controle negativo. NOTA: Como controle de qualidade, a parafina incorpora os ossos cozidos e não fervidos para coloração histológica para confirmar visualmente que a ebulição foi eficaz na descelularização do osso.</li>
	<li>Equilibrar ambos os úmeros em 1 mL de KRH por 30 min na incubadora de cultura celular a 37 °C.</li>
	<li>Fazer uma solução de trabalho de 4 μCi/mL L-[2,3,4-3 H]-Arginina em KRH diluindo 4 μL de 1μCi/μL L-[2,3,4-3 H]- estoque de arginina por 1 mL de KRH. NOTA: Este protocolo é apropriado para avaliar a absorção de qualquer nutriente radiomarcado que seja escolhido. L-[2,3,4-3 H]-glutamina, L-[14CU]-alanina e L-[2,3-3 H]-prolina foram testados com resultados semelhantes. Os dados de arginina são mostrados para destacar a utilidade deste protocolo. ATENÇÃO: Todos os procedimentos que utilizam radiação devem ser realizados atrás do escudo de plexiglass enquanto se utiliza equipamento de proteção individual (EPI) adequado.</li>
	<li>Incubar o osso controle experimental e fervido separadamente em KRH contendo 4 μCi/mL de L-[2,3,4-3 H]-Arginina por até 90 min a 37 °C. NOTA: É importante determinar empiricamente os tempos de incubação para diferentes condições, incluindo a idade dos camundongos, diferentes elementos esqueléticos e os tipos de aminoácidos radiomarcados, realizando um curso de tempo. A saturação ocorre principalmente após aproximadamente 3-4 h. A captação deve ser avaliada em um ponto de tempo na raiva linear da absorção.</li>
	<li>Remova o meio radioativo e descarte no recipiente de resíduos radioativos líquidos. Lave o úmero três vezes usando 1 mL gelado de KRH para encerrar a reação. Descarte todas as lavagens no recipiente de resíduos radioativos líquidos.</li>
	<li>Transfira cada osso para um tubo de 1,5 mL. Adicionar 500 μL de tampão RIPA [150 mM NaCl; 5 mM EDTA; 50 mM Tris (pH 8,0); 0,5% NP40 (v/v); 0,5% DOX (p/v); 0,1% SDS (p/v)]. Descarte as placas de cultura, pipetas sorológicas e pontas de pipeta em um recipiente de resíduos sólidos radioativos.</li>
	<li>Homogeneize o úmero cortando 100 vezes com uma tesoura em um tampão RIPA.</li>
	<li>Sonicate (Amplitude: 35%, Pulse 1 s) o osso homogeneizado resultante por 10 s. NOTA: Sonication também é conhecido por produzir aerossóis. As etapas de sonicação podem ser realizadas em um gabinete de segurança biológica. Para reduzir a formação de aerossóis, é importante não encher demais os tubos. Sonicação de pequenos volumes de amostra pode resultar em sonicação incompleta ou perda de amostra devido à formação de espuma. Se ocorrer formação de espuma, centrifugar a amostra durante 5 minutos para assentar.</li>
	<li>Clarificar o lisado por centrifugação durante 10 min a >10.000 x g à temperatura ambiente. Transferir 200 μL do sobrenadante para frascos para frascos de cintilação contendo 8 ml da solução de cintilação. Misture agitando vigorosamente os frascos para injetáveis de cintilação. Rejeitar todos os resíduos radioactivos sólidos (por exemplo, tubos usados, pontas de pipeta, placas, etc.) no contentor de resíduos radioactivos sólidos.</li>
	<li>Leia a radioatividade (cpm) usando o contador de cintilação. Rejeitar frascos para injetáveis de cintilação utilizados no recipiente de resíduos radioativos designado para frascos para frascos de cintilação.</li>
	<li>Subtraia o cpm do osso fervido (valor basal) do cpm do osso experimental. Normalize a radioatividade com o peso ósseo a partir da etapa 2.3.</li>
	<li>Pulverize o exaustor de cultura celular, os instrumentos e a bancada com descontaminante de radioatividade. Realize testes de limpeza para confirmar que a área de trabalho está livre de radiação.</li>
</ol>

<ol><li>Xiao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+%CE%B1-KG-dependent+histone+and+DNA+demethylases+by+fumarate+and+succinate+that+are+accumulated+in+mutations+of+FH+and+SDH+tumor+suppressors%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Inhibition of α-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors.</a> Genes & Development. 26 (12), 1326-1338 (2012).</li>
<li>Altman, B. J., Stine, Z. E., Dang, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Krebs+to+clinic%3A+glutamine+metabolism+to+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">From Krebs to clinic: glutamine metabolism to cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (10), 619-634 (2016).</li>
<li>Karner, C. M., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+and+cellular+metabolism+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling and cellular metabolism in osteoblasts.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 74 (9), 1649-1657 (2017).</li>
<li>Zarse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+insulin%2FIGF1+signaling+extends+life+span+by+promoting+mitochondrial+L-proline+catabolism+to+induce+a+transient+ROS+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal.</a> Cell Metabolism. 15 (4), 451-465 (2012).</li>
<li>Nagano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proline+dehydrogenase+promotes+senescence+through+the+generation+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Proline dehydrogenase promotes senescence through the generation of reactive oxygen species.</a> Journal of Cell Science. 130 (8), 1413-1420 (2017).</li>
<li>Comes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-Proline+induces+a+mesenchymal-like+invasive+program+in+embryonic+stem+cells+by+remodeling+H3K9+and+H3K36+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">L-Proline induces a mesenchymal-like invasive program in embryonic stem cells by remodeling H3K9 and H3K36 methylation.</a> Stem Cell Reports. 1 (4), 307-321 (2013).</li>
<li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine-driven+oxidative+phosphorylation+is+a+major+ATP+source+in+transformed+mammalian+cells+in+both+normoxia+and+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Glutamine-driven oxidative phosphorylation is a major ATP source in transformed mammalian cells in both normoxia and hypoxia.</a> Molecular Systems Biology. 9, 712(2013).</li>
<li>Hosios, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acids+rather+than+glucose+account+for+the+majority+of+cell+mass+in+proliferating+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Amino acids rather than glucose account for the majority of cell mass in proliferating mammalian cells.</a> Developmental Cell. 36 (5), 540-549 (2016).</li>
<li>Welbourne, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ammonia+production+and+glutamine+incorporation+into+glutathione+in+the+functioning+rat+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ammonia production and glutamine incorporation into glutathione in the functioning rat kidney.</a> Canadian Journal of Biochemistry. 57 (3), 233-237 (1979).</li>
<li>Sullivan, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supporting+aspartate+biosynthesis+is+an+essential+function+of+respiration+in+proliferating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Supporting aspartate biosynthesis is an essential function of respiration in proliferating cells.</a> Cell. 162 (3), 552-563 (2015).</li>
<li>Nelsen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acids+regulate+hepatocyte+proliferation+through+modulation+of+cyclin+D1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Amino acids regulate hepatocyte proliferation through modulation of cyclin D1 expression.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (28), 25853-25858 (2003).</li>
<li>Krall, A. S., Xu, S., Graeber, T. G., Braas, D., Christofk, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asparagine+promotes+cancer+cell+proliferation+through+use+as+an+amino+acid+exchange+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Asparagine promotes cancer cell proliferation through use as an amino acid exchange factor.</a> Nature Communications. 7, 11457(2016).</li>
<li>Green, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branched-chain+amino+acid+catabolism+fuels+adipocyte+differentiation+and+lipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Branched-chain amino acid catabolism fuels adipocyte differentiation and lipogenesis.</a> Nature Chemical Biology. 12 (1), 15-21 (2016).</li>
<li>Shiraki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methionine+metabolism+regulates+maintenance+and+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Methionine metabolism regulates maintenance and differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Cell Metabolism. 19 (5), 780-794 (2014).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+metabolism+regulates+proliferation+and+lineage+allocation+in+skeletal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).</li>
<li>Shen, L., Sharma, D., Yu, Y., Long, F., Karner, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biphasic+regulation+of+glutamine+consumption+by+WNT+during+osteoblast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Biphasic regulation of glutamine consumption by WNT during osteoblast differentiation.</a> Journal of Cell Science. 134 (1), (2021).</li>
<li>Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+glutamine+catabolism+mediates+bone+anabolism+in+response+to+WNT+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).</li>
<li>Hu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amino+acid+sensor+Eif2ak4%2FGCN2+is+required+for+proliferation+of+osteoblast+progenitors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">The amino acid sensor Eif2ak4/GCN2 is required for proliferation of osteoblast progenitors in mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (10), 2004-2014 (2020).</li>
<li>Rached, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO1+is+a+positive+regulator+of+bone+formation+by+favoring+protein+synthesis+and+resistance+to+oxidative+stress+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">FoxO1 is a positive regulator of bone formation by favoring protein synthesis and resistance to oxidative stress in osteoblasts.</a> Cell Metabolism. 11 (2), 147-160 (2010).</li>
<li>Elefteriou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATF4+mediation+of+NF1+functions+in+osteoblast+reveals+a+nutritional+basis+for+congenital+skeletal+dysplasiae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">ATF4 mediation of NF1 functions in osteoblast reveals a nutritional basis for congenital skeletal dysplasiae.</a> Cell Metabolism. 4 (6), 441-451 (2006).</li>
<li>Maleknia, S. D., Johnson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+of+amino+acids+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%2C+Peptides+and+Proteins+in+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry of amino acids and proteins.</a> Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry. , 1-50 (2011).</li>
<li>Rennie, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+the+use+of+tracers+in+nutrition+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Proceedings+of+the+Nutrition+Society%22%5BJournal%5D)">An introduction to the use of tracers in nutrition and metabolism.</a> The Proceedings of the Nutrition Society. 58 (4), 935-944 (1999).</li>
<li>Hahn, T. J., Downing, S. J., Phang, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+transport+in+adult+diaphyseal+bone%3A+contrast+with+amino+acid+transport+mechanisms+in+fetal+membranous+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Amino acid transport in adult diaphyseal bone: contrast with amino acid transport mechanisms in fetal membranous bone.</a> Biochimica Biophysica Acta. 183 (1), 194-203 (1969).</li>
<li>Rosenbusch, J. P., Flanagan, B., Nichols, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+transport+of+amino+acids+into+bone+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Active transport of amino acids into bone cells.</a> Biochimica Biophysica Acta. 135 (4), 732-740 (1967).</li>
<li>Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+transporters+revisited%3A+New+views+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Amino acid transporters revisited: New views in health and disease.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).</li>
</ol>

Os autores não têm divulgações.

O protocolo aqui descrito fornece uma abordagem rápida e sensível para avaliar a absorção de aminoácidos em resposta a várias permutações experimentais in vitro ou ex vivo. Quando comparado aos kits comercialmente disponíveis (por exemplo, Kit de Determinação de Glutamina e Glutamato), esse método é muito mais sensível, mais rápido e menos trabalhoso16,17,25. Em nosso protocolo, avaliamos a captação no buffer K...

Os aminoácidos são compostos orgânicos que contêm um grupo funcional amino (-NH2) e carboxila (-COOH) com uma cadeia lateral variável que é específica para cada aminoácido. Em geral, os aminoácidos são bem conhecidos como o constituinte básico da proteína. Mais recentemente, novos usos e funções dos aminoácidos foram elucidados. Por exemplo, aminoácidos individuais podem ser metabolizados para gerar metabólitos intermediários que contribuem para a bioenergética, funcionam como cofatores enzimáticos, regulam espécies reativas de oxigênio ou são usados para sintetizar outros aminoácidos 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Muitos estudos demonstram que o metabolismo de aminoácidos é crítico para a pluripotência, proliferação e diferenciação celular em vários contextos 3,6,11,12,13,14,15,16,17.
Os osteoblastos são células secretoras que produzem e secretam a rica matriz óssea extracelular rica em colágeno tipo 1. Para sustentar altas taxas de síntese de proteínas durante a formação óssea, os osteoblastos exigem um suprimento constante de aminoácidos. Para atender a essa demanda, os osteoblastos devem adquirir ativamente aminoácidos. Consistente com isso, estudos recentes revelam a importância da absorção e metabolismo de aminoácidos na atividade dos osteoblastos e na formação óssea 15,16,17,18,19,20.
Os osteoblastos adquirem aminoácidos celulares de três fontes principais: meio extracelular, degradação de proteínas intracelulares e biossíntese de aminoácidos de novo. Este protocolo se concentrará na avaliação da absorção de aminoácidos do ambiente extracelular. Os métodos mais comuns para medir a absorção de aminoácidos dependem de aminoácidos marcados radiomarcados (por exemplo, 3H ou 14C) ou isotopos pesados (por exemplo, 13C). Ensaios pesados de isotopômeros podem analisar a absorção e o metabolismo de aminoácidos de forma mais completa e segura, mas são mais demorados, levando vários dias para serem concluídos, pois leva um dia para preparar e derivar amostras e vários dias para analisar no espectrômetro de massa, dependendo do número de amostras21,22. Em comparação, os ensaios de captação de aminoácidos radiomarcados não são informativos sobre o metabolismo a jusante, mas são baratos e relativamente rápidos, podendo ser concluídos dentro de 2-3 h a partir do início do experimento23,24. Aqui, descrevemos um protocolo básico facilmente modificável projetado para avaliar a captação de aminoácidos radiomarcados em células primárias cultivadas ou linhagens celulares in vitro ou eixos ósseos individuais ex vivo. A aplicação desses dois protocolos pode ser estendida a outros aminoácidos radiomarcados e outros tipos de células e tecidos associados ao osso.

<table><tbody><tr><td>0,25% de tripsina</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 12 poços</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 1 mL</td><td></td> BD <td>precisão 309628</td><td></td></tr><tr><td>30G Agulha</td><td>BD precisão</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de arginina L-[2,3,4-3H]-, 1mCi</td><td>PerkinElmer</td><td>NET1123001MC</td><td></td></tr><tr><td>Beckman LS6500 contador de cintilação</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de colina</td><td>Sigma</td><td>C7077</td><td></td></tr><tr><td>Solução de D-(+)-glicose</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Ferramenta</td><td></td><td></td> de dissecção <td>Fórceps, tesouras, escapos</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético</td><td>Sigma</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>HEPES(1M)</td><td>Gibco</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>L-[3,4-3H(N)]-Glutamina</td><td>PerkinElmer</td><td>NET551250UC</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de cintilação líquida</td><td>Sigma</td><td>Z190535</td><td></td></tr><tr><td>Solução de cloreto de lítio,</td><td>8M Sigma</td><td>L7026</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>MEM&alpha;</td>Tubo de microcentrífuga <td>Gibco</td><td>12561</td><td></td></tr><tr><td>, 15mL</td><td>Biotix</td><td>89511-256</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Desoxicolato de sódio</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio</td><td>Sigma</td><td>436143</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Sonic& Materiais</td><td>VCX130</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma</td><td>648311</td><td></td></tr><tr><td>Ultima Gold (solução de cintilação)</td> <td>PerkinElmer</td><td>6013329</td><td></td></tr><tr><td>&alfa; - (Metilamino) ácido isobutírico</td><td>Sigma</td><td>M2383</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação do consumo de aminoácidos em células Ósseas cultivadas e eixos Ósseos isolados

Evaluation of Amino Acid Consumption in Cultured Bone Cells and Isolated Bone Shafts

O desenvolvimento ósseo e a homeostase dependem da diferenciação e da atividade dos osteoblastos formadores de ossos. A diferenciação de osteoblastos é caracterizada sequencialmente por proliferação seguida de síntese proteica e, finalmente, secreção da matriz óssea. A proliferação e a síntese de proteínas requerem um fornecimento constante de aminoácidos. Apesar disso, muito pouco se sabe sobre o consumo de aminoácidos em osteoblastos. Aqui descrevemos um protocolo muito sensível que é projetado para medir o consumo de aminoácidos usando aminoácidos radiomarcados. Este método é otimizado para quantificar as mudanças na absorção de aminoácidos que estão associadas à proliferação ou diferenciação de osteoblastos, tratamentos com drogas ou fatores de crescimento ou várias manipulações genéticas. É importante ressaltar que este método pode ser usado de forma intercambiável para quantificar o consumo de aminoácidos em linhagens celulares cultivadas ou células primárias in vitro ou em eixos ósseos isolados ex vivo. Finalmente, nosso método pode ser facilmente adaptado para medir o transporte de qualquer um dos aminoácidos, bem como glicose e outros nutrientes radiomarcados.

O transporte de aminoácidos é regulado por muitos transportadores de aminoácidos ligados à membrana que foram categorizados em sistemas de transporte distintos com base em inúmeras características, incluindo especificidade do substrato, cinética, bem como dependência de íons e pH25. Por exemplo, a absorção de glutamina pode ser mediada pelos sistemas de transporte dependentes de Na+ A, ASC, γ+L e N ou pelo Sistema L independente de Na+. Os sistemas dependentes de Na+</su...

Este protocolo apresenta um ensaio de captação de aminoácidos radiomarcado, que é útil para avaliar o consumo de aminoácidos em células primárias ou em ossos isolados.

Avaliação do Consumo de Aminoácidos em Células Ósseas Cultivadas e Eixos Ósseos Isolados

Bone development and homeostasis is dependent upon the differentiation and activity of bone forming osteoblasts. Osteoblast differentiation is ...

A absorção e o metabolismo de aminoácidos são essenciais para a especificação, diferenciação e formação óssea de osteoblastos. Este protocolo fornece um método rápido e sensível para avaliar a absorção de aminoácidos. Nosso protocolo usa aminoácidos radiomarcados para quantificar a absorção de aminoácidos.É um método barato, sensível e rápido que pode ser facilmente modificado para diferentes condições. Este protocolo pode ser facilmente modificado para avaliar a absorção de outros nutrientes radiomarcados como glicose e ácidos graxos em uma variedade de tecidos, bem como células primárias ou transformadas. Para iniciar a placa de ensaio de absorção de aminoácidos cinco vezes 10 para a quarta célula ST2 em cada poço de uma placa de cultura de tecido de 12 poços em meio alfa MEM suplementado com FBS, penicilina e estreptomicina.Placa de poços extras de células para quantificar o número de células por condição para as normalizações. Em seguida, incube as células em uma incubadora de cultura de células umidificadas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por dois a três dias até ficar confluente. Após incubação aspirar o meio e lavar as células duas vezes com um mililitro de PBS a pH 7,4.Em seguida, aspirar o PBS antes de lavar as células uma vez com um mililitro de Krebs-Ringer HEPES ou KRH. Incubar células com 0,5 mililitros de KRH recém-preparado contendo quatro microcuries por mililitro L34 tritiada glutamina durante cinco minutos. Após a incubação, colete o meio radioativo para dispensar no recipiente de resíduos líquidos.Em seguida, lave as células três vezes com KRH gelado para encerrar a reação. Em seguida, adicione um mililitro de dodecil sulfato de sódio a 1% a cada poço e triture a mistura 10 vezes para lisar e homogeneizar as células. Em seguida, transfira os lisados celulares para um tubo de 1,5 mililitro e esclareça o lisado centrifugando a uma velocidade mínima de 10.000 G por 10 minutos.Transfira o sobrenadante para um frasco para injetáveis de cintilação contendo oito mililitros da solução de cintilação e leia a atividade de rádio e as contagens por minuto utilizando o contador de cintilação. A partir das placas não radioativas restantes das células, tripsinize, ressuspenda e conte as células para estimar o número de células nas culturas radioativas lisadas. Usando um hemacitômetro, conte o número de células por poço não radioativo para cada condição experimental.Para determinar a absorção de aminoácidos, lave a medula do osso antes de pesar o eixo ósseo. Para descelularizar o osso, ferva um úmero em PBS a 100 graus Celsius por 10 minutos. Equilibre os úmeros vivos e cozidos em um mililitro de KRH por 30 minutos na incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius.Em seguida, incube os ossos de controle experimentais e cozidos separadamente em KRH recém-preparado contendo quatro microcaril por mililitro de arginina triciada L234 por até 90 minutos a 37 graus Celsius. Depois de remover o meio radioativo, termine a reação lavando o úmero três vezes com um mililitro de KRH gelado. Transfira cada osso para um tubo de 1,5 mililitro com 500 microlitros de buffer RIPA.Em seguida, homogeneize o úmero e o tampão RIPA cortando 100 vezes com uma tesoura, seguido de sonicação a 35% de amplitude e um segundo de pulso por 10 segundos. Clarificado o lisado por centrifugação durante 10 minutos a 10.000 vezes G à temperatura ambiente. Após a centrifugação, transferir 200 microlitros do sobrenadante para frascos de cintilação contendo oito mililitros da solução de cintilação.Leia a atividade de rádio usando o contador de cintilação. As propriedades cinéticas da captação de glutamina tritiada in vitro L34 e das células ST2 confluentes foram avaliadas na presença ou ausência de ácido metil aminoisobutírico ou lítio. A remoção de sódio levou a uma redução de 90% na absorção de glutamina.A presença de lítio aumentou a absorção de glutamina em 2% em comparação com a condição livre de sódio. Considerando que o ácido metil aminoisobutírico não afetou a absorção de glutamina. As contribuições percentuais de estimação do sistema A, N, L ou ASC e gama mais L indicaram que a maior parte da absorção de glutamina é mediada pelos sistemas ASC e gama mais L.O sistema N é responsável por aproximadamente 2% de absorção de glutamina dependente de sódio.E o sistema A mostrou 0% de contribuição e absorção. A captação de arginina tritiada X-VIVO L34 em úmeros neonatais cozidos e vivos foi analisada ao longo de um período de tempo de duas horas. A absorção de arginina aumentou linearmente ao longo do experimento e do úmero vivo.Os úmeros cozidos não apresentaram aumento dinâmico da captação de arginina no experimento. A análise representativa mostra a captação de arginina normalizada e corrigida. É importante ferver o osso contralateral como um controle ativo.Esta etapa é essencial, pois a matriz óssea pode absorver aminoácidos radioativos, resultando em resultados imprecisos. O protocolo nos permitiu confirmar a cinética de absorção de aminoácidos tanto in vitro quanto in vivo.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Uma biblioteca de mostrar fago foi utilizado para identificar seqüências de peptídeos que o osso alvo. O objetivo foi investigar o efeito destes peptídeos sobre a diferenciação de células mesenquimais e determinar seus efeitos sobre a regeneração óssea.

Peptídeos de Phage Biblioteca Mostrar modular a expressão de genes em células mesenquimais e potenciar a osteogênese em defeitos ósseos unicorticais

Neste vídeo, descrevemos um método para a detecção de depósitos de cálcio secretados por osteoblastos usando um corante aniônico, Vermelho de Alizarina S. Os osteoblastos cultivados são primeiro corados e, em seguida, o corante é recuperado para quantificação colorimétrica dos depósitos de cálcio ou do grau de mineralização dos osteoblastos.

Ensaio de mineralização in vitro: um método colorimétrico para quantificar depósitos de cálcio osteoblástico em substituto de enxerto ósseo por coloração e extração de vermelho de alizarina S

Este vídeo demonstra uma técnica in vitro para estimar a absorção de aminoácidos por células estromais derivadas da medula óssea. Os transportadores de aminoácidos dependentes de Na+ medeiam a captação de aminoácidos radiomarcados dentro das células, e a captação celular é estimada medindo a radioatividade.

Ensaio de captação de aminoácidos radiomarcados para quantificar a captação celular de aminoácidos

Descrevemos aqui como preparar meio-bone condicionado (BCM) e testar a sua actividade in vitro.

Osso meio condicionado: Preparação e Bioensaio

Urânio é conhecido por afetar o metabolismo ósseo. Aqui, apresentamos um protocolo que visa investigar o efeito da exposição de urânio natural sobre a viabilidade, a diferenciação e a função dos osteoclastos, as células responsável pela reabsorção óssea.

Métodos para analisar os impactos de urânio Natural em In Vitro Osteoclastogenesis

Apresentamos um protocolo para comparar o estado de minerais em vesículas lançadas por duas linhas de células de osso humano: hFOB 1.19 e Saos-2. Seus perfis de mineralização foram analisados por alizarina Red-S (AR-S) coloração, visualização de luz ultravioleta (UV), imagem de microscopia eletrônica (TEM) de transmissão e microanálise de raios-x energia dispersiva (EDX).

Análise de minerais produzidos por hFOB 1.19 e Saos-2 células usando microscopia eletrônica de transmissão com energia dispersiva microanálise de raios-x

Aqui, nós apresentamos um método para a cultura ex vivo de ossos murino longos em estágios fetal e recém-nascido, apropriados para analisar o desenvolvimento do osso e da cartilagem e o homeostase em circunstâncias controladas ao recapitulando o processo in vivo.

Cultivando e medindo ossos longos de murine fetal e recém-nascido

O ensaio de fluxo metabólico celular em tempo real mede a taxa de consumo de oxigênio e a taxa de acidificação extracelular, que corresponde à produção de triptosfato de adenosina mitocondrial e glicolítico, usando sensores de pH e oxigênio. O manuscrito explica um método para compreender o estado energético dos osteoblastos e a caracterização e interpretação do estado bioenergéstico celular.

Usando o analisador de fluxo metabólico de células em tempo real para monitorar bioenergetics osteoblast

Aqui, apresentamos um procedimento de ensaio simples e eficaz para ensaios de poço de resorção usando placas de cultura celular revestidas de fosfato de cálcio.

Um protocolo simples de ensaio de poços para visualizar e quantificar a resorção osteoclástica in vitro

Este protocolo descreve a fabricação de construções ósseas 3D utilizando osteócitos humanos embutidos em hidrogéis de gelatina metacrilada (GelMA) suplementados com matriz extracelular descelularizada. O método é de baixo custo, escalável e compatível com equipamentos laboratoriais básicos, fornecendo uma plataforma translacional para o estudo dos processos de doenças musculoesqueléticas.

Uma plataforma de cultura óssea 3D usando osteócitos humanos e matriz extracelular descelularizada para modelagem de doenças musculoesqueléticas

Aprenda a avaliar o consumo de aminoácidos em células ósseas cultivadas e eixos ósseos isolados usando aminoácidos radiomarcados. Este método rápido e sensível permite quantificar a captação de nutrientes em diferentes condições experimentais.

Avaliação do Consumo de Aminoácidos em Células Ósseas Cultivadas e Eixos Ósseos Isolados

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