Automatizando quantificação agregada em caenorhabditis elegans
October 14th, 2021
O protocolo a seguir descreve o desenvolvimento e otimização de um fluxo de trabalho de alto rendimento para cultivo de vermes, imagens de fluorescência e processamento automatizado de imagens para quantificar agregados de poliglutamina como uma avaliação de mudanças na proteostase.
Uma abordagem simples foi tomada para monitorar as mudanças na proteostase, avaliando a agregação de poliglutamina e fornecendo uma estrutura que pode ser usada para aplicações de alto rendimento. Marcar um fenótipo como o número de agregados por eu posso me tornar subjetivo. Automatizar a contagem agregada nos permite eliminar esse viés, aumentar o throughput e a reprodutibilidade.
Este método ajuda a identificar genes bacterianos que contribuem para a interrupção da proteostase hospedeira. Compreender a contribuição de genes bacterianos individuais nos ajudará a entender sua implicação na patogênese de doenças como Alzheimer, Parkinson e Huntington. Comece removendo as placas contendo vermes do congelador e deixando-os descongelar em temperatura ambiente.
Em seguida, limpe o excesso de condensação e remova a tampa antes da imagem. Use as configurações do microscópio com tempo de exposição de 500 milissegundos, ampliação de 40 X com adaptador de câmera 0,63 X e intensidade GFP definida para 100% durante a captura de imagem. Agora ajuste os controles de luz transmitidos até que os vermes pareçam brilhantemente iluminados em comparação com o fundo escuro, evitando a superexposição.
Altere as posições dos vermes dentro do poço para evitar o desatoamento excessivo usando uma ponta de pipeta de 10 microliter para empurrar suavemente os vermes para a posição desejada. Defina o canal para o filtro GFP para estabelecer um plano focal para ambas as imagens. Capture uma imagem de campo brilhante.
Pegue uma imagem de fluorescência correspondente sem perturbar a placa ou mude o foco do microscópio. Agora, para avaliar as imagens, primeiro baixe o CellProfiler. Abra o software e arraste e solte as imagens de interesse na caixa de imagens.
Clique nas imagens na lista de arquivos para abri-las. Selecione o vidro da lupa para destacar uma região de interesse e o ícone de seta para medir o comprimento de ambos os worms e agregados. Passe o mouse sobre o objeto desejado para determinar seu valor de intensidade, que pode ser visto na parte inferior da tela.
Para utilizar o pipeline de análise de imagens CellProfiler, nomeie os pares de imagens corretamente conforme descrito no manuscrito do texto após o download do CellProfiler do site oficial. Baixe o pipeline e carregue-o no CellProfiler selecionando arquivo, importação e pipeline a partir de arquivos. Selecione o módulo de worms desemaranhados para abrir suas configurações para carregar um conjunto de treinamento usado para identificar worms no módulo de worms desemaranhados.
Em seguida, identifique o nome do arquivo do conjunto de treinamento. Selecione o ícone do arquivo de upload e carregue o arquivo suplementar também. Carregue imagens selecionando o módulo de imagens no canto superior esquerdo.
E, em seguida, arrastar e soltar imagens devidamente nomeadas. Antes de analisar as imagens, selecione a pasta de saída desejada que será usada para armazenar os resultados clicando no botão de configurações de saída localizado perto do canto inferior esquerdo do programa. Em seguida, selecione o ícone da pasta à direita da saída padrão para escolher o local de saída desejado.
Selecione o ícone de imagens de análise para iniciar a análise da imagem. Se a análise demorar muito para ser concluída e estiver presa ao processamento de uma única imagem, aborte a execução e identifique a imagem não processada, classificando-se através da pasta de saída e observando qual nome de imagem não é encontrado. Após a análise completa, o software organizará os resultados em uma planilha do Excel contendo worms individuais na coluna N e o respectivo número de agregados na coluna K.Baixe o organizador de metadados para organizar convenientemente os dados do arquivo CSV de saída do CellProfiler.
Para o Sistema operacional Windows, localize o arquivo baixado e extraia-o para o local desejado. Localize e abra a pasta extraída chamada gui_Windowsos_64x. E inicie o aplicativo clicando no ícone do aplicativo GUI.
Um prompt pode abrir solicitando permissão para executar. Selecione mais informações e clique em executar de qualquer maneira. O organizador de metadados está agora pronto para arrastar e soltar arquivos CSV de saída do CellProfiler.
Para o Mac OS, localize o arquivo baixado e extraia o arquivo do aplicativo organizador de metadados de arquivo. Abra a pasta extraída encontrada em downloads. Clique com o botão direito do mouse no aplicativo GUI e selecione aberto.
Um aviso aparecerá pedindo permissão para abrir devido à falta de uma licença oficial. Selecione aberto. Uma vez que o aplicativo organizador de metadados esteja aberto no respectivo SISTEMA OPERACIONAL, clique em carregar seus arquivos aqui ou arraste e solte os arquivos CSV desejados do CellProfiler.
Clique no botão organizar, que trará o usuário para uma nova tela com um botão de arquivos de download. Clique no botão e selecione o local desejado para salvar o arquivo de saída. O arquivo de saída aparecerá como o nome do arquivo original com _organized extensão adicionada ao nome do arquivo.
Na presença de FUDR, os vermes que foram alimentados com várias bactérias tinham um tamanho corporal mais consistente que permitia uma detecção mais uniforme e precisa de vermes, resolvendo assim o problema da superlotação. O congelamento dos worms melhorou a detecção de agregados de poliqu, eliminando a fluorescência de fundo, bem como a precisão da contagem automatizada comparável à contagem manual. A iluminação de campo brilhante invertida foi usada para detectar todo o canal C.elegans e GFP para imagem de agregados polyQ YFP.
A detecção, desembaraçar e quantificação agregada para cada worm foram feitas aplicando um pipeline otimizado de processamento de imagens CellProfiler, que permite obter o número de agregados por worm individual. A diferença entre a eficácia da quantificação agregada automatizada e usando o pipeline CellProfiler foi mínima, indicando que o método automatizado pode ser aplicado a telas de grande escala. Das 90 cepas bacterianas testadas, a colonização do intestino C.elegans com um candidato mostrou uma diminuição significativa no número de agregados.
Os experimentos de confirmação por contagem manual revelaram que nenhum dos mutantes, incluindo o que diminuiu significativamente o número de agregados afetou a agregação de polq. Os pesquisadores que decidirem usar esse quadro devem entender que as etapas traçadas não são absolutas. Modificações e uma compreensão fundamental de como manipular o CellProfiler são essenciais para o sucesso.
Abordagens bioquímicas adicionais, como a mancha ocidental, podem ser usadas para confirmar a agregação de polq.
Visão Geral
Este estudo desenvolve um fluxo de trabalho de alto rendimento para cultivo de vermes, imagem de fluorescência e processamento automático de imagens para quantificar agregados de poliglutamina como uma medida de mudanças na proteostase. O método aprimora a avaliação desses agregados, particularmente na exploração de seu papel em doenças neurodegenerativas.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Proteostase
- Doenças neurodegenerativas
- Triagem de alto rendimento
Fundamento
- A agregação de poliglutamina está ligada a doenças como Alzheimer, Parkinson e Huntington.
- Entender as contribuições dos genes bacterianos para a disrupção da proteostase é essencial.
- Métodos tradicionais de pontuação para agregados podem ser subjetivos.
Métodos Utilizados
- Imagem e análise de alto rendimento usando CellProfiler
- C. elegans como o modelo biológico
- Quantificação automatizada de agregados de poliglutamina
Principais Resultados
- O processamento automático de imagens permite a eliminação de viés e maior reprodutibilidade na contagem de agregados.
- Identificados genes bacterianos que afetam a proteostase do hospedeiro com descobertas significativas nos números de agregados em vermes.
- Resultados validados indicam que a automação é comparável à contagem manual, apoiando triagens em larga escala.
Conclusões
- Este estudo fornece uma estrutura confiável para estudar a proteostase através da agregação de poliglutamina.
- As percepções obtidas com este método são relevantes para entender os mecanismos em doenças neurodegenerativas.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Automating aggregate quantification in C. elegans addresses the need for high-throughput, bias-free assessment of proteostasis in neurodegenerative disease models. By standardizing image acquisition and CellProfiler-based analysis, the method enables reproducible screening of large compound or genetic libraries. This supports early target validation and mechanistic de-risking in discovery pipelines for protein conformational diseases.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying polyglutamine aggregation as a proxy for proteostasis disruption.
- Operational Value: Reduces subjectivity in phenotypic scoring, improving data reliability for target validation campaigns.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing quantitative, reproducible readouts for mechanism-based compound prioritization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative aggregate counts per worm, enabling robust assay readouts for screening campaigns.
- Operational Value: Increases throughput and reproducibility through automation, reducing manual labor and inter-operator variability.
- Assay Readiness: Produces structured output (Excel spreadsheet with worm and aggregate counts) compatible with downstream data analysis workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links C. elegans proteostasis models to human neurodegenerative disease mechanisms via conserved polyQ aggregation pathways.
- Mechanistic De-risking: Facilitates identification of bacterial or genetic modifiers of aggregation, supporting target validation in disease-relevant systems.
- Predictive Confidence: Enables cross-functional teams to compare conditions using normalized, automated aggregate quantification.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing quantitative proteostasis readouts that inform go/no-go decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on proteostasis mechanisms by enabling objective, high-content aggregation phenotyping.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized worm imaging and analysis compatible with 96-well or larger format screens.
- Analytics: Produces quantifiable dependent variable measurements (aggregates per worm) that allow statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects invertebrate model findings to human disease pathways through conserved aggregation biology.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis pipeline adaptable to multiple proteostasis targets and screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by eliminating bias from manual aggregate counting.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized image processing and automated data output.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling large-scale screens with reduced hands-on time and higher data quality.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions through reliable, quantitative proteostasis biomarkers.
Implementation Considerations
- Requires familiarity with fluorescence microscopy and GFP/YFP imaging parameters for polyQ detection.
- Depends on CellProfiler software and associated pipeline configuration for automated worm and aggregate segmentation.
- Necessitates standardized image naming and folder organization for successful batch processing.
- Benefits from FUDR treatment to reduce worm size variability and improve detection accuracy in high-density wells.
- Relies on user training to adapt the pipeline for different worm strains, expression patterns, or imaging setups.
