Produção de nanopartículas lipídicas carregadas de siRNA usando um dispositivo microfluido
22 de março de 2022
Os métodos de produção de nanopartículas lipídicas à base de microfluídica (LNP) têm atraído atenção em sistemas de entrega de medicamentos (DDSs), incluindo a entrega de RNA. Este protocolo descreve os processos de fabricação, produção de LNP (LNP carregado de siRNA) e processos de avaliação do LNP usando nosso dispositivo microfluido original chamado iLiNP.
O tamanho da nanopartícula lipídica afeta a biodistribução, o efeito anti-tumor e o desempenho do silenciamento genético. Portanto, o método de controle de tamanho lnp é uma técnica eficaz para a produção de nano medicamentos, incluindo sistemas de entrega de RNA. Este dispositivo microfluido original, chamado dispositivo iLiNP, foi capaz de controlar o tamanho do LNP variando de 20 a 100 nanômetros em intervalos de 10 nanômetros.
O dispositivo iLiNP pode produzir não apenas LNPs carregados de siRNA, mas todos também LNPS carregados de mRNA, e LNPs carregados de ribonucleoproteína. Para começar, pegue as soluções de etanol lipídudo e produza os LNPs carregados de siRNA misturando soluções DOTAP, DSPC, colesterol e DMG-PEG2k a uma relação molar de 50 a 10 a 38,5 a 1,5. Ajuste a concentração lipídica total para oito milimiliar.
Em seguida, pegue as soluções aquosas de soro fisiológico de 154 milimil e tampão de acetato de 25 milialares no pH 4 e filtre-as através de filtros de membrana de 0,2 micrômetros ou filtros de seringa. Prepare a solução de tampão siRNA dissolvendo 70 microgramas de siGL4 em um mililitro de tampão de acetato de 25 milimil. Encha uma seringa de vidro mililitro com soluções lipídicas e aquosas, respectivamente.
Conecte as seringas de vidro ao pico de capilares usando conectores de seringa, em seguida, defina a taxa de fluxo das soluções lipídicas e aquosas e introduza as soluções lipídicas e aquosas separadamente no dispositivo iLiNP usando bombas de seringa. Colete as suspensões do LNP em um microtubo da tomada do dispositivo iLiNP. Dialisar a suspensão do LNP usando uma membrana de diálise de 12 a 14 quiloDalton cortes de peso molecular a quatro graus é Celsius durante a noite contra soro fisiológico ou DPBS para LNPs POPC e LNPs carregados de sirna, respectivamente.
Colete as suspensões dialisados do LNP em microtubos e, em seguida, pipet 20 a 30 microliters da suspensão LNP para uma célula micro quartzo. Finalmente, meça o tamanho do LNP, a distribuição do tamanho do LNP e o índice de poli dispersão por dispersão dinâmica de luz. A distribuição do tamanho do POPC LNP produzida em diferentes condições de fluxo, como a taxa de fluxo total e as taxas de fluxo são mostradas aqui.
Tamanhos precisos do LNP que variam de 20 a 100 nanômetros podem ser controlados usando este dispositivo iLiNP. LNPs de pequeno porte são formados em altas condições de fluxo total. Além disso, os tamanhos do LNP que são formados na FRR 5 são menores do que os da FRR 3, independentemente da taxa de fluxo total.
A distribuição de tamanho dos LNPs carregados de siRNA é mostrada aqui. siRNAs são encapsulados nos LNPs por interação eletrostática entre o DOTAP lipídico e os siRNAs carregados negativamente. O dispositivo iLiNP produziu LNPs cationic carregados de 90 nanômetros com uma distribuição estreita.
A eficiência de encapsulamento do siRNA foi de 95% devido à interação eletrostática entre o lipídio cationico e os siRNAs carregados negativamente. Citotoxicidade e a atividade de silenciamento genético dos LNPs carregados de siRNA de 19 nanômetros foram avaliados. LNPs carregados de siRNA mostraram citotoxicidade em uma dose de 10 a 100 siRNA nanomolar.
O nível de expressão da luciferase foi diminuído dependendo da concentração de siRNA. O SiRNA carregado LNPs suprimiu 80% de expressão de luciferase a uma dose de 100 siRNA nanomolar. As otimizações das condições de fluxo são os passos mais importantes no protocolo para obter os LNPs de tamanho desejado.
O método de produção de LNP baseado em microfluido, incluindo o dispositivo iLiNP, não requer nenhum procedimento complicado e espera-se que seja empregado como o método padrão de produção do LNP.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para a produção de nanopartículas lipídicas (LNPs) carregadas com siRNA utilizando um dispositivo microfluídico chamado iLiNP. O método permite um controle preciso sobre o tamanho das LNPs, o que é crucial para sistemas eficazes de entrega de fármacos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Sistemas de liberação de fármacos
- Nanopartículas lipídicas
- Microfluídica
Contexto
- O tamanho das nanopartículas lipídicas influencia a biodistribuição e a eficácia terapêutica.
- O controle do tamanho das nanopartículas lipídicas é essencial para otimizar a entrega de RNA.
- O dispositivo iLiNP permite o controle do tamanho entre 20 e 100 nanômetros.
- Interações eletrostáticas facilitam a encapsulação de siRNA em nanopartículas lipídicas.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para a produção de LNPs carregadas com siRNA.
- Avaliar o impacto do tamanho das LNPs na eficiência de silenciamento gênico.
- Otimizar as condições de fluxo para obter características desejadas nas LNPs.
Métodos Utilizados
- Preparação das soluções lipídica e aquosa para a produção de LNP.
- Uso do dispositivo iLiNP para mistura e formação de LNP.
- Dialise das suspensões de LNP para remover materiais em excesso.
- Dispersão dinâmica de luz para medir o tamanho e distribuição de LNP.
Resultados Principais
- O dispositivo iLiNP produziu LNPs carregadas com siRNA com tamanho de 90 nanômetros e eficiência de encapsulação de 95%.
- LNPs pequenas foram formadas sob condições de alta taxa de fluxo total.
- As LNPs carregadas com siRNA demonstraram citotoxicidade e silenciamento gênico eficaz.
- Condições de fluxo otimizadas foram essenciais para obter tamanhos desejados de LNPs.
Conclusões
- O método microfluídico que utiliza o dispositivo iLiNP simplifica a produção de LNP.
- Espera-se que esta abordagem padronize a produção de LNP na pesquisa.
- Estudos futuros podem explorar a aplicação deste método em diversos sistemas de entrega de RNA.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O controle preciso do tamanho de nanopartículas lipídicas (LNP) é essencial para otimizar a biodistribuição, a eficácia terapêutica e o desempenho do silenciamento gênico em sistemas de liberação de fármacos baseados em RNA. O dispositivo microfluídico iLiNP permite a produção reprodutível de LNP com tamanho ajustável entre 20 e 100 nanômetros, apoiando fluxos de trabalho de validação precoce de alvos e identificação de compostos líderes. Essa capacidade aumenta a confiança preditiva em modelos pré-clínicos ao reduzir a variabilidade no desempenho das nanopartículas, um fator crucial para minimizar riscos no avanço translacional.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar a atividade biológica dependente do tamanho para LNPs carregadas com siRNA em ensaios de validação de alvos.
- Valor Operacional: Fornece formulações padronizadas de LNPs para reduzir o ruído em triagens fenotípicas e estudos de desvio de mecanismo.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera LNPs com siRNA monodispersos com tamanho definido e eficiência de encapsulação de 95% para avaliação confiável de compostos.
- Valor Operacional: Apoia a padronização de ensaios por meio do controle reprodutível do tamanho de LNPs mediante ajuste da vazão no dispositivo iLiNP.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Facilita a correlação entre o tamanho das LNPs e a eficiência de silenciamento gênico e citotoxicidade em sistemas relevantes para doenças.
- Valor Operacional: Permite a produção escalonável de LNPs carregadas com mRNA, siRNA e ribonucleoproteínas para continuidade pré-clínica.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método microfluídico iLiNP insere-se na sequência de descobertas, desde a validação inicial de alvos até a identificação de compostos líderes e o desenvolvimento pré-clínico, especialmente para terapias com RNA, nas quais a eficácia é afetada pela entrega dependente do tamanho.
- Biologia de Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao permitir a variação sistemática do tamanho de LNP para avaliar o impacto na captação celular e no engajamento do alvo.
- Triagem: Fornece formulações de LNP prontas para ensaios com distribuição de tamanho consistente e alta encapsulação de siRNA para triagem reprodutível de compostos.
- Análises: Oferece dados quantitativos de tamanho, polidispersão e potencial zeta por meio de espalhamento dinâmico de luz para subsidiar decisões de continuidade ou interrupção.
- Pesquisa Translacional: Conecta a otimização de LNP na fase de descoberta à avaliação pré-clínica por meio de nanomedicamentos padronizados com controle de tamanho.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma reutilizável para produção de diversos LNPs carregados com RNA (siRNA, mRNA, RNP) em múltiplos projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Melhora a confiança no alvo ao associar propriedades físico-químicas de LNPs a resultados funcionais, como silenciamento gênico.
- Valor Operacional: Aumenta a reprodutibilidade e escalabilidade da produção de LNPs por meio da precisão microfluídica.
- Valor Estratégico: Reduz o risco biológico em estágios avançados ao permitir a eliminação precoce de riscos no desempenho do veículo de entrega.
- Impacto no Portfólio: Orienta a priorização ajustada ao risco de candidatos a terapêuticas de RNA com base na eficiência de entrega.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em formulação de lipídios, manipulação microfluídica e carregamento de ácidos nucleicos.
- Depende de bombas de seringa, seringas de vidro e infraestrutura de diálise para a purificação de LNPs.
- Necessita padronização das razões de vazão e das condições totais de fluxo entre equipes.
- Envolve considerações de adaptação ao alterar composições lipídicas ou tipos de carga de RNA.
- Limitado pela necessidade de diálise pós-produção e espalhamento dinâmico de luz para controle de qualidade.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:54
Preparation of Lipid Solutions and the siRNA/ Buffer Solution
1:58
Set-Up of the iLiNP Device and Production of LNPs
2:35
Dialysis of the LNP Suspension and LNP Size Measurement
3:24
Results: POPC LNP Size Distributions Produced by the iLiNP Device at Different Flow Rate Ratios and Characterization and Cytotoxicity of siRNA-Loaded LNPs
5:22
Conclusion
