Name: Dissociação Mecânica e Enzimática Combinada do Tecido Hipocampal cerebral do rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Aprenda a dissociar tecido neural do hipocampo de camundongos C57BL/6J usando digestão enzimática e dissociação mecânica. Este protocolo produz suspensões de células viáveis para análises funcionais detalhadas.

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Agradecemos à Aimee Rogers por fornecer treinamento prático e suporte contínuo ao produto. Agradecemos à Dra. Agradecemos a Meredith Joheim e ao Grupo de Comunicação Científica da UAMS pela edição gramatical e formatação deste manuscrito. Este estudo foi apoiado pelo NIH R25GM083247 e NIH 1R01CA258673 (A.R.A).

Os experimentos foram realizados de acordo com os padrões éticos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UAMS. Camundongos fêmeas C57Bl6/J de 6 meses de idade foram comprados e agrupados (4 ratos por gaiola) sob um ciclo constante de 12 horas de luz/escuridão.
1. Preparação de reagentes
<ol><li>Prepare a solução de estoque de manchas vivas/mortas fixas. Reconstitua a mancha fluorescente com 20 μL de sulfóxido de dimetila (DMSO).</li>
	<li>Enrole o frasco em papel alumínio, rotule-o como "Reconstituído", e armazene-o a -20 °C por até seis meses.</li>
	<li>Prepare uma solução salina de 0,9% com heparina. Diluir o conteúdo de um frasco de sódio heparina (10.000 unidades usp por 10 mL) em 1 L de água dupla destilada (ddH2O).</li>
	<li>Prepare o suficiente para aproximadamente 45 mL por animal e armazene a 4 °C por até uma semana.</li>
	<li>Faça 1% de paraformaldeído (PFA).<ol>
<li>Em um capô de fumaça, aqueça uma placa quente a 50 °C. Em um micro-ondas, aqueça 100 mL de ddH2O em um copo de vidro a aproximadamente 60 °C. Adicione uma barra de agitação magnética e transfira para a placa quente.</li>
		<li>No capô da fumaça, pese 1 g de PFA e adicione ao béquer de ddH2O. Adicione 0,1125 g de cristais NaOH e misture até dissolver (5-10 min).</li>
		<li>Adicione 0,4 g de NaPO4- monobásico e misture até dissolver (2-5 min). Filtrar a solução e ajustar o pH para 7.4 com HCl e NaOH.</li>
		<li>Esfrie no gelo ou a 4°C por 30 minutos antes de armazenar. NOTA: As alíquotas de 1,5 mL podem ser armazenadas a -20 °C durante um ano. Evite ciclos de congelamento. Se, após o descongelamento, a solução ficar nublada ou um precipitado tiver se formado, a solução não deve ser utilizada. ATENÇÃO: Tóxico, inflamável. Sempre trabalhe com PFA sob um capô ventilado usando equipamento de proteção individual adequado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enzima liofilizada resuspend com 1 mL de Tampão A. Não vórtice a solução. NOTA: Enzima A e Buffer A, bem como buffers A, Y e Z são reagentes no kit comercial de dissociação do cérebro adulto17.</li>
	<li>Divida a enzima P em alíquotas de 50 μL e resuspend Enzima A em alíquotas de 10 μL. Por instruções de kit, armazene a -20 °C por até seis meses. Evite ciclos de congelamento.</li>
</ol>2. Dia de experimento
<ol><li>Esfrie a centrífuga de mesa a 4 °C.</li>
	<li>Coloque aliquot(s) de PFA na geladeira para descongelamento gradual.</li>
	<li>Coloque a mancha viva/morta reconstituída no escuro (por exemplo, uma gaveta) para descongelar à temperatura ambiente.</li>
	<li>Prepare o tampão de soro bovino (BSA). Adicione 0,5 g de BSA a 100 mL da solução tamponada de fosfato de 1x Dulbecco sem cálcio e magnésio (D-PBS), pH 7.2.</li>
	<li>Adicione uma barra de mexida e misture em uma placa de mexida por 30 minutos. Transfira para tubos cônicos de 50 mL e armazene a 4 °C. NOTA: Use sempre o buffer BSA recém-preparado.</li>
	<li>Prepare a diluição de trabalho de mancha viva/morta. Adicione 1 μL da solução de estoque de manchas vivas/mortas reconstituídas a 360 μL D-PBS e armazene-a no escuro (por exemplo, uma gaveta ou caixa) à temperatura ambiente. Prepare 50 μL da diluição de trabalho por amostra.</li>
</ol>3. Perfusão
<ol><li>Coloque a solução salina com heparina no gelo.</li>
	<li>Ligue o oxigênio, coloque a bola indicadora do medidor de fluxo no sistema vaporizador de anestesia animal de pequeno porte para 1 L/min. Certifique-se de que há pressão adequada de oxigênio e isoflurane.</li>
	<li>Ajuste o mostrador vaporizador para 3,5% (para indução e manutenção).</li>
	<li>Prime as linhas de bomba de perfusão com a solução salina/heparina. Defina a velocidade para 6 mL/min.</li>
	<li>Coloque o mouse na câmara de indução, ligue o respirador e espere vários minutos até que o mouse não responda. Confirme a profundidade suficiente da anestesia através da ausência de retirada do pedal para beliscar nociva.</li>
	<li>Coloque o mouse de costas na bandeja de dissecção com o nariz no cone do nariz. Realize uma confirmação secundária de anestesia total através da ausência de retirada do pedal para beliscar nociva. Coloque as quatro patas na bandeja.</li>
	<li>Pulverize o abdômen do animal com 20% de etanol.</li>
	<li>Usando fórceps, belisque o abdômen inferior e levante a pele. Use uma tesoura para cortar a pele e a pele até o fundo da caixa torácica.</li>
	<li>Faça duas incisões diagonais abaixo da caixa torácica em direção a cada ombro.</li>
	<li>Ressesseça cuidadosamente o diafragma (evitando os pulmões e o coração). Ressecante a caixa torácica para expor o coração.</li>
	<li>Corte cuidadosamente qualquer tecido conjuntivo ao redor do coração. NOTA: As etapas 3.10-3.11 são críticas; realizar com proficiência e destreza.</li>
	<li>Use a tesoura para prender o átrio direito (lobo escuro no canto superior esquerdo do coração). Desligue o fluxo de isoflurane para o respiro.</li>
	<li>Mantenha o coração firme com fórceps. Com o bisel da agulha borboleta virado para cima, fure o ventrículo esquerdo mantendo o nível da agulha e paralelo ao animal.</li>
	<li>Segure a agulha no lugar, ligue a bomba e perfunda pelo menos 30 mL da solução salina/heparina até que o fluido que sai do coração fique opaco e o fígado e pulmões pálidos em cores. NOTA: As etapas 3.13-3.14 são críticas; realizar com proficiência e destreza.</li>
	<li>Desligue a bomba, remova a agulha e transfira o mouse para a área de dissecção.</li>
</ol>4. Dissecção
<ol><li>Usando uma tesoura cirúrgica grande, decapite a cabeça.</li>
	<li>Corte a pele da parte de trás da cabeça até os olhos. Descasque a pele para trás para expor o crânio.</li>
	<li>Corte o crânio entre os olhos. Faça dois cortes na parte de trás do crânio, nas posições das 10 e 2 horas, em seguida, faça um corte longo (mantenha as pontas para evitar danificar o cérebro) ao longo da linha midsagittal do crânio até o corte original entre os olhos.</li>
	<li>Use fórceps para descascar as duas metades do crânio para os lados. Use uma espátula para remover o cérebro e coloque-o em uma placa de petri de vidro de 60 mm no gelo cheio de D-PBS frio (Figura 1).</li>
	<li>Use um bisturi ou navalha para separar cada hemisfério. Em seguida, remova as lâmpadas olfativas e o cerebelo.</li>
	<li>Use fórceps para remover o cérebro médio até que o hipocampo seja exposto.</li>
	<li>Proteja o cérebro com fórceps. Usando um segundo conjunto de fórceps, provoque suavemente o hipocampo de cada hemisfério, e transfira ambos o hipocampi para um tubo de 1,5 mL rotulado contendo D-PBS frio.</li>
	<li>Coloque o tubo de amostra contendo os dois hipocampi do rato no gelo.</li>
</ol>5. Prepare a enzima Mix 1 e 2 para cada amostra
NOTA: Para volumes superiores a 2 mL, utilize uma pipeta sorológica de 10 mL; para volumes, 200 μL-2 mL, use uma pipeta de 1000 μL; para volumes, 21-199 μL, use uma pipeta de 200 μL; para volumes, 2-20 μL, use uma pipeta de 20 μL; para volumes abaixo de 2 μL, use uma pipeta de 0-2 μL.
<ol><li>Para cada amostra, descongele uma alíquota cada de Enzima P e Enzima A à temperatura ambiente.</li>
	<li>Para enzime mix 1, combine 50 μL de Enzima P e 1900 μL de Buffer Z em um tubo C rotulado (Tabela de Materiais).</li>
	<li>Para enzima mix 2, adicione 20 μL de Buffer Y ao aliquot de 10 μL descongelado da Enzima A.</li>
</ol>6. Protocolo de dissociação cerebral adulto17
NOTA: Ao trabalhar com amostras, os tubos devem ser colocados em um rack de tubo em temperatura ambiente, enquanto BSA e D-PBS permanecem no gelo, a menos que observados de outra forma.
<ol><li>Ligue o dissociador.</li>
	<li>Use fórceps para transferir os pedaços de tecido hipocampi para o tubo C.</li>
	<li>Transfira 30 μL de enzima mistura 2 para o tubo C. Torça a tampa até sentir a tensão, em seguida, aperte até que clique.</li>
	<li>Coloque o tubo C de cabeça para baixo em uma posição do dissociador; a amostra será atribuída ao status Selecionado (Figura 2). Fixar o aquecedor sobre o tubo C.</li>
	<li>Pressione o ícone da pasta, selecione A pasta Favoritos , role e selecione o programa 37C_ABDK_02 . Clique em OK para aplicar o programa a todos os tubos C selecionados e toque em Iniciar (Figura 2).</li>
	<li>Rotule um tubo cônico de 50 mL por amostra.</li>
	<li>Coloque um coador de células de 70 μm em cada tubo cônico de 50 mL e molhado com 2 mL de tampão BSA.</li>
	<li>Após a conclusão do programa, remova o aquecedor e o tubo C do dissociador.</li>
	<li>Adicione 4 mL de tampão BSA à amostra e aplique a mistura ao coador celular no tubo cônico de 50 mL.</li>
	<li>Adicione 10 mL de D-PBS ao tubo C, feche-o e gire a solução suavemente. Aplique-o no coador de células no tubo cônico de 50 mL.</li>
	<li>Descarte o coador de células e o tubo C. Centrifugar a suspensão a 300 x g por 10 min a 4 °C. Então, aspire e descarte o supernatante.</li>
</ol>7. Remoção de detritos
<ol><li>Resuspenda a pelota com 1550 μL de D-PBS frio e transfira a suspensão para um tubo cônico de 15 mL rotulado.</li>
	<li>Adicione 450 μL de solução de remoção de detritos frios e pipeta para cima e para baixo (não vórtice). NOTA: A Solução de Remoção de Detritos é um reagente no kit comercial de dissociação de Brian17.</li>
	<li>Sobreponha suavemente 1 mL de D-PBS frio em cima da suspensão da célula, mantendo a ponta contra a parede do tubo cônico. Repita até que a sobreposição total seja de 2 mL. NOTA: Este passo é crítico; realizar com proficiência e destreza.</li>
	<li>Centrifugar a 3000 x g por 10 min a 4 °C com aceleração total e freio total. NOTA: Se as fases não estiverem claramente separadas, repita as etapas 7.2-7.3. Centrifugar um tempo final em 1000 x g para 10 min a 4 °C.</li>
	<li>A suspensão deve agora consistir em três camadas distintas (Figura 3). Aspire a camada mais alta. Varrer a ponta pipeta para frente e para trás para aspirar a camada média branca. Remova o máximo possível da camada média sem perturbar a camada mais baixa. NOTA: Este passo é crítico; realizar com proficiência e destreza.</li>
	<li>Adicione 2 mL de D-PBS frio e pipeta para cima e para baixo para misturar.</li>
	<li>Centrifugar a 1000 x g por 10 min a 4 °C com aceleração total e freio completo. Aspire e descarte o supernaspe. Resuspense a pelota em 1 mL de buffer BSA. NOTA: As células podem ser resuspendidas no buffer apropriado e, em seguida, rotuladas magneticamente e isoladas em preparação para sequenciamento de células únicas neste momento.</li>
</ol>8. Contagem celular
<ol><li>Execute a contagem de células de acordo com o protocolo do fabricante do contador de células disponível (uma opção é notada na Tabela de Materiais)</li>
</ol>9. Mancha viva/morta
<ol><li>Centrifugar os 900 μL restantes (de 7,7) a 1000 x g por 10 min a 4 °C com aceleração total e freio completo.</li>
	<li>Enquanto a amostra estiver girando, rotule um tubo de fluxo por amostra e enrole-o em papel alumínio para limitar a exposição à luz.</li>
	<li>Aspire e descarte o supernaspe.</li>
	<li>Resuspend a pelota em 50 μL de mancha viva/morta diluída (previamente preparada). NOTA: Esta etapa deve ser realizada em uma configuração de baixa luz. Desligue as luzes da sala aérea para conseguir isso.</li>
	<li>Transfira cada amostra para o tubo de fluxo rotulado correspondente e incubar à temperatura ambiente por 8-10 min no escuro (por exemplo, uma gaveta ou caixa).</li>
	<li>Adicione 500 μL de tampão BSA e centrífuga a 1000 x g por 10 min a 4 °C com aceleração total e freio completo.</li>
	<li>Aspire e descarte o supernaspe. NOTA: A pelota pode não ser visível; Deixe uma pequena quantidade de tampão para trás para não aspirar involuntariamente a pelota. As células podem ser resuspendidas no buffer apropriado, bloqueadas e manchadas com anticorpos específicos das células neste momento. Consulte o Arquivo Suplementar 1 para o protocolo de amostra18.</li>
</ol>10. Fixação (opcional)
<ol><li>Resuspense a pelota em 200 μL de 1% pfa (previamente preparado). Incubar por 15 min a 4 °C.</li>
	<li>Lave adicionando 500 μL de D-PBS e centrífuga a 300 x g por 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Aspire o supernatante. NOTA: A pelota pode não ser visível; Deixe uma pequena quantidade de tampão para trás para não aspirar involuntariamente a pelota.</li>
	<li>Resuspense a pelota em 200 μL de D-PBS e armazene a 4 °C por até 3 dias.</li>
</ol>11. Citometria de fluxo
<ol><li>Rotule as tampas do filtro nos novos tubos.</li>
	<li>Usando uma pipeta de 1 mL, pipeta cada amostra na tampa do filtro.</li>
	<li>Centrifugar brevemente a 200 x g a 4 °C, permitindo apenas que a centrífuga atinja 200 x g antes de parar a corrida.</li>
	<li>Prossiga para o núcleo de citometria de fluxo para análise a jusante.</li>
</ol>

<ol><li>Andersen, P., Morris, R., Amaral, D., Bliss, T., O'Keefe, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAndersen%2C+P+%22The+Hippocampus+Book%22">The Hippocampus Book</a>. , Oxford University Press, Inc. (2007).</li>
<li>Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+influence+on+neurogenesis+in+the+dentate+gyrus+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genetic influence on neurogenesis in the dentate gyrus of adult mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 10409-10414 (1997).</li>
<li>Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+Functional+Implications+of+Adult+Neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis.</a> Cell. 132, 645-660 (2008).</li>
<li>Kempermann, G., Song, H., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+adult+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the adult hippocampus.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, 018812(2015).</li>
<li>Bond, A. M., Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mammalian+neural+stem+cells+and+neurogenesis%3A+Five+decades+later%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult mammalian neural stem cells and neurogenesis: Five decades later.</a> Cell Stem Cell. 17, 385-395 (2015).</li>
<li>Sato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+microglia+on+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Effects of microglia on neurogenesis.</a> Glia. 63, 1394-1405 (2015).</li>
<li>Lee, V. M., Scientist, S., Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neural stem cells. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.stemcell.com/media/files/minireview/MR29019-Neural_Stem_Cells.pdf">http://www.stemcell.com/media/files/minireview/MR29019-Neural_Stem_Cells.pdf</a> (2015).</li>
<li>Mu, Y., Lee, S. W., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+in+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Signaling in adult neurogenesis.</a> Current Opinion in Neurobiology. 20, 416-423 (2010).</li>
<li>Fares, J., Diab, Z. B., Nabha, S., Fares, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+adult+hippocampus%3A+history%2C+regulation%2C+and+prospective+roles%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the adult hippocampus: history, regulation, and prospective roles.</a> International Journal of Neuroscience. 129, 598-611 (2018).</li>
<li>Tosun, M., Semerci, F., Maletic-Savatic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+stem+cells+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of stem cells in the hippocampus.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1169, 31-53 (2019).</li>
<li>Abbott, L. C., Nigussie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+in+the+mammalian+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Medicine+Series+C%3A+Anatomia+Histologia+Embryologia%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis in the mammalian dentate gyrus.</a> Journal of Veterinary Medicine Series C: Anatomia Histologia Embryologia. 49, 3-16 (2020).</li>
<li>Rodrigues, G. M., Fernandes, T. G., Rodrigues, C. A., Cabral, J. M., Diogo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neural+precursors+using+magnetic+activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Purification of human induced pluripotent stem cell-derived neural precursors using magnetic activated cell sorting.</a> Methods in Molecular Biology. 1283, Clifton, N.J. 137-145 (2015).</li>
<li>Ko, I. K., Kato, K., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+analysis+of+multiple+surface+markers+expressed+on+rat+neural+stem+cells+using+antibody+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Parallel analysis of multiple surface markers expressed on rat neural stem cells using antibody microarrays.</a> Biomaterials. 26, 4882-4891 (2005).</li>
<li>Jager, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+enzymatic+and+mechanical+methods+of+dissociation+on+neural+progenitor+cells+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells.</a> Advances in Medical Sciences. 61 (1), 78-84 (2017).</li>
<li>Volovitz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-aggressive%2C+highly+efficient%2C+enzymatic+method+for+dissociation+of+human+brain-tumors+and+brain-tissues+to+viable+single-cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells.</a> BMC Neuroscience. 17, 1-10 (2016).</li>
<li>Reiß, S., Herzig, I., Schmitz, J., Bosio, A., Pennartz, S. Semi-automated tissue dissociation and preserved epitope integrity optimize immunomagnetic sorting of neural cells. , Available from: 
 <a target="_blank" href="www.miltenyibiotec.com">www.miltenyibiotec.com</a> (2021).</li>
<li>Adult brain dissociation kit: mouse and rat. Miltenyi Biotec. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.miltenyibiotec.com/upload/assets/IM0011920.pdf">https://www.miltenyibiotec.com/upload/assets/IM0011920.pdf</a> (2020).</li>
<li>Cell surface flow cytometry staining protocol. Miltenyi Biotec. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.miltenyibiotec.com/US-en/applications/all-protocols/cell-surface-flow-cytometry-straining-protocol-pbs-bsa-1-50.html">https://www.miltenyibiotec.com/US-en/applications/all-protocols/cell-surface-flow-cytometry-straining-protocol-pbs-bsa-1-50.html</a> (2021).</li>
<li>Finak, G., Jiang, W., Gottardo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CytoML+for+cross-platform+cytometry+data+sharing%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">CytoML for cross-platform cytometry data sharing.</a> Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 93, 1189-1196 (2018).</li>
<li>Turaç, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+flow+cytometric+analysis+of+surface+and+intracellular+antigens+reveals+surface+molecule+markers+of+human+neuropoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Combined flow cytometric analysis of surface and intracellular antigens reveals surface molecule markers of human neuropoiesis.</a> PLoS One. 8, 1-14 (2013).</li>
<li>Schwarz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+fluorescence+activated+cell+sorting+to+examine+cell-type-specific+gene+expression+in+rat+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537(2015).</li>
<li>Brummelman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((application+and+computational+analysis+of+high-dimensional+fluorescent+antibody+panels+for+single-cell+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">application and computational analysis of high-dimensional fluorescent antibody panels for single-cell flow cytometry.</a> Nature Protocols. 14, 1946-1969 (2019).</li>
<li>Recommended controls for flow cytometry. Abcam. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.abam.com/protocols/recommended-conntrols-for-flow-cytometry">https://www.abam.com/protocols/recommended-conntrols-for-flow-cytometry</a> (2021).</li>
<li>Fixing cells with paraformaldehyde (PFA) for flow cytometry. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://flowcytometry.utoronto.ca/wp-content/uploads/2016/02/FixingCells_PFA.pdf">https://flowcytometry.utoronto.ca/wp-content/uploads/2016/02/FixingCells_PFA.pdf</a> (2021).</li>
<li>Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+fluorescence+intensity+of+selected+leukocyte+surface+markers+following+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation.</a> Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 71, 379-385 (2007).</li>
<li>Armand, E. J., Li, J., Xie, F., Luo, C., Mukamel, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+of+brain+cell+transcriptomes+and+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing of brain cell transcriptomes and epigenomes.</a> Neuron. 109, 11-26 (2021).</li>
<li>Ho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+single-cell+transcriptomics+in+adult+rodent+brain%3A+The+medium+spiny+neuron+transcriptome+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A guide to single-cell transcriptomics in adult rodent brain: The medium spiny neuron transcriptome revisited.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 1-16 (2018).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+technologies+in+studying+brain+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Oxidative+Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">Novel technologies in studying brain immune response.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 6694566(2021).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+atlas+of+the+mouse+brain+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">DNA methylation atlas of the mouse brain at single-cell resolution.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Mattei, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+dissociation+induces+transcriptional+and+proteotype+bias+in+brain+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21, 1-20 (2020).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+microdissected+mouse+brain+tissue+for+artifact+free+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100590(2021).</li>
<li>Delmonte, O. M., Fleisher, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+Surface+markers+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: Surface markers and beyond.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143, 528-537 (2019).</li>
<li>O'Connor, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relevance+of+flow+cytometry+for+biochemical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">The relevance of flow cytometry for biochemical analysis.</a> IUBMB Life. 51, 231-239 (2001).</li>
<li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized.+Experiments%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> Journal of Visualized. Experiments. (94), e52241(2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Várias etapas neste protocolo de dissociação neural requerem técnica proficiente e destreza-perfusão, aspiração supernante e remoção de mielina. Durante todo o processo de perfusão, os órgãos internos devem permanecer intactos (além de remover o diafragma e cortar o coração); isso inclui evitar as câmaras superiores do coração com a agulha borboleta. Enquanto a quantidade de soro fisiológico com heparina necessária varia, o fluido transparente que flui do coração indica que o processo está completo. O cérebro deve ser co...

O hipocampo foi descrito pela primeira vez por um anatomista bolonhesa, Giulio Cesare Aranzio, em 1500. Ao nomear esta nova estrutura, Aranzio foi provavelmente inspirado por sua estranha semelhança com o cavalo-marinho do gênero Hipocampo1. O hipocampo está envolvido em respostas ao estresse, mas é amplamente conhecido por seu papel no aprendizado e na memória. Mais especificamente, o hipocampo é responsável pela codificação e recuperação da memória declarativa e espacial1.
O hipocampo, ou hipocampo propriamente dito, é dividido nos subcampos CA1 (cornu ammonis), CA2 e CA31. Comparado com o resto do sistema nervoso, o hipocampo tem várias características únicas de definição, incluindo sua plasticidade e potencial para neurogênesecontínua 2. Neurogênese é o processo de proliferação e diferenciação de células-tronco neurais, seguida por sua integração na rede neuronal pré-existente. A neurogênese é restrita à zona subgranular do giro dentado e da zona subventricular dos ventrículos laterais (e das lâmpadas olfativas)3. Embora a neurogênese seja abundante em embriogênese, é um processo ao longo da vida 3,4. Como tal, essa discussão se concentrará na neurogênese adulta no hipocampo.
As zonas subventricular e subgranular são nichos neurogênicos contendo células ependísicas e vasculares, bem como linhagens imaturas e maduras de células-tronco neurais5. A microglia contribui para esses nichos como células imunes para regular a neurogênese6. Progenitoras neurais são progenias não-progenias de células-tronco de células-tronco neurais7. Três tipos de progenitores neurais estão presentes na zona subventricular: células tipo B radial, progenitores progenitores do tipo C e neuroblastos tipo A 3,8. As células progenitoras neurais do tipo B na zona subventricular podem se diferenciar em células tipo C que dividem lentamente8. Posteriormente, as células tipo C se diferenciam em células tipo A8. Esses neuroblastos migram através do fluxo migratório rostral para a lâmpada olfativa antes de se diferenciarem em interneurons ou oligodendrocytes9. Estes interneurônios de bulbo olfativos são fundamentais para a memória olfativa de curto prazo, e aprendizado associativo, enquanto os oligodendrocitos myelinatos axônios do corpus calosum9. A maioria da neurogênese adulta ocorre na zona subgranular do giro dentado, onde progenitores neurais radiais tipo 1 e não racial 2 são encontrados3. A maioria das células progenitoras neurais estão destinadas a se tornar neurônios dentes e astrócitos10. Conectados por junções de lacunas, os astrócitos formam redes para modular plasticidade, atividade sináptica e excitabilidade neuronal5. Como o neurônio excitatório primário do giro dentado, as células de grânulo fornecem entrada do córtex entorhinal para a regiãoCA3 11.
As populações de células-tronco neurais podem ser isoladas usando estratégias de isolamento imunomagnético ou imunofluorescente12,13. O tecido neural é particularmente difícil de dissociar; esforços para fazê-lo muitas vezes resultam em amostras com má viabilidade celular e/ou não produzem a suspensão de célula única necessária para análise a jusante. A dissociação neural pode ser conduzida por meio de dissociação mecânica (como o uso de filtros, técnicas de corte ou trituração de pipetas), digestão enzimática ou uma combinação de técnicas14,15. Em estudo que avaliou os métodos de dissociação neural, foram comparadas15 a viabilidade e a qualidade da dissociação mecânica manual por trituração de pipetas versus combinações de trituração de pipetas e digestão com várias enzimas. A qualidade foi classificada com base na quantidade de aglomerados celulares e DNA ou detritos subcelulares na suspensão preparada15. As suspensões de tumores gliais submetidos apenas à dissociação mecânica manual apresentaram viabilidade celular significativamente menor do que os tratamentos com dispase ou uma combinação de DNase, colagenase e hialuronidase15. Volovitz et al. reconheceram a variação da viabilidade e da qualidade entre os diferentes métodos e enfatizaram que a dissociação inadequada pode reduzir a precisão da análise a jusante15.
Em um estudo separado, os autores compararam mais de 60 métodos diferentes e combinações de dissociação de células neuronais cultivadas14. Estes métodos incluíram oito variações diferentes de dissociação mecânica manual por trituração de pipetas, comparação da incubação com cinco enzimas individuais em três intervalos diferentes, e várias combinações de dissociação mecânica com digestão enzimática ou a combinação de duas enzimas14. Nenhum dos métodos mecânicos resultou em uma suspensão de célula única14. Quatro dos tratamentos enzimáticos únicos, dez dos tratamentos enzimáticos combinados, e quatro das combinações de dissociação mecânica com digestão enzimática produziram uma suspensão unicelular14. Digestão enzimática com TrypLE seguido por Trypsin-EDTA mais efetivamente dissociado amostras14. Aliás, amostras tratadas com TrypLE e/ou Trypsin-EDTA tendem a formar aglomerados gelatinosos14. Embora este estudo tenha sido realizado em células cultivadas, ele fala apenas das deficiências da trituração de pipetas ou da digestão enzimática.
Faltam comparações lado a lado de dissociação mecânica manual versus automatizada. No entanto, um grupo executou citometria de fluxo para comparar a dissociação mecânica manual e semi-automatizada de cérebros inteiros de camundongos em conjunto com os kits comerciais de dissociação enzimática papain ou trypsin16. O processamento com o dissociador produziu de forma mais consistente células viáveis16. Após a dissociação, os autores também isolaram células prominina-1, células precursoras neuronais e microglia16. Para duas das três populações celulares isoladas, a pureza das células isoladas foi ligeiramente maior quando as amostras foram processadas com o dissociador, em comparação commanualmente 16. Reiß et al. observaram que a variabilidade de pessoa para pessoa na técnica de pipetagem dificulta a reprodutibilidade do rendimento da população celular viável na dissociação tecidual16. Os autores concluíram que a dissociação mecânica automatizada padroniza o processamento da amostra16.
O método de dissociação descrito neste manuscrito é uma combinação de dissociação mecânica totalmente automatizada e digestão enzimática, utilizando soluções que acompanham um kit comercial de dissociação cerebral adulta17. Ao contrário dos protocolos padrão, este protocolo otimizado reduz a manipulação da amostra, produz uma suspensão de célula única altamente viável, e destina-se a processar quantidades mínimas de tecido inicial.

<table><tbody><tr><td>Tubos de Microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-682-003</td><td>Basix, cor sortida</td></tr><tr><td>15 mL Falcon Tubes</td><td>Becton Dickinson Labware Europe</td><td>352009</td><td>Poliestireno</td></tr><tr><td>25 mL Pipetas Sorológicas</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-235</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Ensaio de Poliestireno de Fundo Redondo de 5 mL</td><td>Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de Vácuo/ Armazenamento de 500 mL Sistema de Garrafas</td><td>Corning</td><td>431097</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; Filtro de células M</td> Kit de Dissociação Cerebral Adulto <td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Miltenyi Biotec</td><td>&nbsp; 130-107-677</td><td>Contém Enzima P, Tampão Z, Tampão Y, Enzima A, Tampão A, Solução de Remoção de Detritos</td></tr><tr><td>Folha de Alumínio</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-105</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ACSA-2-PE-Vio770, camundongo, clone REA969</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-116-246</td><td></td></tr><tr><td>Proteína Básica Anti-Mielina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3821-100UG</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PSA-NCAM-PE, humano, camundongo e rato, Clone 2-2B</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-117-394</td><td></td></tr><tr><td>BD LSRFortessa</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-50G</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-VioBlue, mouse, Clone REA592</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-113-810</td><td></td></tr><tr><td>CD31 Anticorpo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-111-541</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de placa quente de cerâmica</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-100-100SH</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido Fisher</td><td>Scientific</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Pharmco da Greenfield Global</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tubos de Centrífuga Cônicos de 50 mL</td><td>Tesoura Fina Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>- Sharp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td>Perfusão</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>BD(</td><td></td><td>v10.7.0)</td></tr><tr><td>gentleMACS C Tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Octo Dissociator com Aquecedores</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-427</td><td></td></tr><tr><td>Gibco DPBS (1X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Copo de Vidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-555-25A</td><td></td></tr><tr><td>Heparina sódica</td><td>Fresenius Kabi</td><td>504011</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Mancha de Células Mortas Aqua Fixável VIVO/MORTO</td><td>ThermoFisher</td><td>L34965</td><td></td></tr><tr><td>Barra de Agitação Magnética</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-513-51</td><td></td></tr><tr><td>Noyes Tesoura de Mola Fine</td><td>Science Tools</td><td>15012-12</td><td>Dissecção</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441244-3KG</td><td>Prilled, 95%</td></tr><tr><td>Pontas de pipeta GP LTS 20 &micro; L 960A/10</td><td>Rainin</td><td>30389270</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de Pipeta GP LTS 250 &micro; L 960A/10</td><td>Ponteiras</td> de pipeta <td>Rainin 30389277</td><td></td></tr><tr><td>RT LTS 1000 &micro; L FL 768A/8</td><td>Rainin</td><td>30389213</td><td></td></tr><tr><td>Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 &mu; L)</td><td>Rainin</td><td>30386597</td><td></td></tr><tr><td>RBXMO FITC XADS</td><td>Fisher Scientific</td><td>A16167</td><td></td></tr><tr><td>Balde de gelo redondo com tampa</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-210-129</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de fundo redondo com tampa do filtro de célula</td><td>Falcon</td><td>100-0087</td><td></td></tr><tr><td>S1 Enchimentos de pipeta</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>9541</td><td></td></tr><tr><td>Espátula e Sonda</td><td>Fine Science Tools</td><td>10090-13</td><td>Dissecção & </td></tr><tr><td>Conjunto de Infusão Asada Perfusion Surflo 23 G x 3/4"</td><td>Termuno</td><td>SV-23BLK</td><td>Agulha de borboleta</td></tr><tr><td>Rack de Tubo de Ensaio</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-809-37</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Legend XTR Centrifuge</td><td>ThermoFisher</td><td>descontinuado</td><td>Ou outra centrífuga de mesa padrão</td></tr><tr><td>Bomba Peristáltica de Fluxo Variável</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-2</td><td>Modelo de fluxo baixo</td></tr><tr><td>Kit Inicial VetFlo para Ratos</td><td>Máscara</td><td>de Anestesia Kent Scientific VetFlo-MSEKIT</td><td>, tubulação, câmara de indução, latas de carvão</td></tr><tr><td>Sistema de Anestesia de Canal Único Vaporizador VetFlo</td><td>Kent Scientific</td><td>VetFlo-1210S</td><td>0.2&ndash; 4 LPM</td></tr><tr><td>Vi-CELL XR Analisador de Viabilidade de Células</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>731196</td><td>Contagem de Células</td></tr><tr><td>Vi-CELL XR 4 Sacos de Frascos de Amostra</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>383721</td><td>Contagem de Células</td></tr></tbody></table>

dissociação mecânica e enzimática combinada do tecido hipocampal cerebral do rato

Combined Mechanical and Enzymatic Dissociation of Mouse Brain Hippocampal Tissue

Este protocolo de dissociação neural (uma adaptação do protocolo que acompanha um kit comercial de dissociação cerebral adulta) otimiza o processamento de tecidos em preparação para análises detalhadas a jusante, como citometria de fluxo ou sequenciamento unicelular. A dissociação neural pode ser conduzida através de dissociação mecânica (como o uso de filtros, técnicas de corte ou trituração de pipetas), digestão enzimática ou uma combinação dela. A natureza delicada das células neuronais pode complicar os esforços para obter a suspensão de célula única altamente viável e verdadeira com detritos celulares mínimos necessários para análise unicelular. Os dados demonstram que essa combinação de dissociação mecânica automatizada e digestão enzimática consistentemente produz uma suspensão unicelular altamente viável (>90%), superando as dificuldades acima mencionadas. Embora algumas das etapas exijam destreza manual, essas etapas diminuem o manuseio da amostra e a perda potencial de células. Este manuscrito detalha cada etapa do processo para equipar outros laboratórios para dissociar com sucesso pequenas quantidades de tecido neural em preparação para análise a jusante.

As amostras foram processadas com um citômetro de fluxo em uma instalação central, e os dados resultantes foram avaliados com um pacote de software para análise de fluxo. Anteriormente, foram analisados os controles de compensação- a mancha viva/morta e o controle negativo. Se forem utilizados vários fluorochromes, os controles de fluorescência menos um (FMO) e os controles de uma única mancha devem ser preparados para cada anticorpo. A compensação pela sobreposição espectral para as amostras experimentais foi calculada ...

Este protocolo de dissociação de células neurais destina-se a amostras com uma baixa quantidade de material inicial e produz uma suspensão de célula única altamente viável para análise a jusante, com medidas de fixação e coloração opcionais.

Dissociação Mecânica e Enzimática Combinada do Tecido Hipocampal cerebral do rato

This neural dissociation protocol (an adaptation of the protocol accompanying a commercial adult brain dissociation kit) optimizes tissue processing in ...

Dissociando com sucesso pequenas quantidades de tecido neural pode equipar laboratórios para obter uma visão específica da estrutura sobre a eficácia do tratamento, a função celular, bem como os mecanismos de ação de doenças e tratamentos. Este protocolo de dissociação neural consistentemente produz uma suspensão de célula única altamente viável e real. Além disso, podemos processar amostras que são apenas uma fração daquelas para as que os kits comerciais são destinados.O planejamento e a preparação adequados são fundamentais para um resultado bem-sucedido para esta técnica. Executar várias rodadas de prática para se familiarizar com o protocolo seria benéfico. Depois de anestesiar um rato C57BL/6J fêmea de seis meses de idade, belisque o abdômen inferior e levante a pele usando fórceps.Em seguida, usando uma tesoura, corte a pele e a pele até o fundo da caixa torácica. Faça duas incisões diagonais começando abaixo da caixa torácica e movendo-se em direção a cada ombro. Em seguida, ressecaça cuidadosamente o diafragma e a caixa torácica para expor o coração.Depois de remover cuidadosamente qualquer tecido conjuntivo ao redor do coração, use uma tesoura para cortar o átrio direito. Em seguida, desligue o fluxo isoflurane para o respirador. Segurando o coração firme com fórceps e com o bisbilhoteiro da agulha borboleta virado para cima, fure o ventrículo esquerdo mantendo o nível da agulha e paralelo ao animal.Em seguida, segurando a agulha no lugar, ligue a bomba e peruse pelo menos 30 mililitros da solução salina ou heparina até que o fluido deixando o coração seja opaco e o fígado e pulmões pálidos em cores. Após a perfusão, desligue a bomba, remova a agulha e transfira o mouse para a área de dissecção. Após a decapitação, corte a pele da parte de trás da cabeça até os olhos e descasque a pele para trás para expor o crânio.Em seguida, corte o crânio entre os olhos e faça dois cortes na parte de trás do crânio às posições das 10 e 2 horas. Em seguida, faça um corte longo ao longo da linha midsagittal do crânio para o corte original entre os olhos. Em seguida, usando fórceps, descasque as duas metades do crânio para os lados.Em seguida, use uma espátula para remover o cérebro e colocá-lo em uma placa de vidro de 60 milímetros de Petri cheia de DPBS frio e mantida no gelo. Usando um bisturi ou navalha, separe cada hemisfério e remova as lâmpadas olfativas e o cerebelo. Em seguida, remova o cérebro médio até que o hipocampo seja exposto.Em seguida, proteja o cérebro com fórceps. Em seguida, usando um segundo conjunto de fórceps, gentilmente provocar o hipocampo fora de cada hemisfério. Transfira ambos o hipocampi para um tubo de 1,5 mililitro rotulado contendo DPBS frio e coloque o tubo no gelo.Usando fórceps, transfira os pedaços de tecido hipocampi para um tubo C e adicione 30 microliters de enzima mistura 2 no tubo. Depois de torcer a tampa e apertar até clicar, coloque o tubo em um dissociador e execute o programa apropriado. Enquanto o programa está em execução, pré-molhado um coador de células de 70 mícrons colocado em um tubo cônico de 50 mililitros com dois mililitros de tampão BSA.Após o programa de dissociação ser concluído, adicione quatro mililitros de tampão BSA ao tecido dissociado e filtre a mistura através do coador celular no tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, adicione 10 mililitros de DPBS ao tubo C. Em seguida, feche o tubo, gire a solução suavemente e filtre-a através do coador de células no tubo cônico de 50 mililitros.Centrifugar a suspensão celular filtrada, descartar o sobrenatante sem perturbar a pelota e armazenar a pelota. Para a remoção dos detritos, resuspenja a pelota com 1.550 microliters de DPBS frios e transfira a suspensão para um tubo cônico de 50 mililitros rotulados. Em seguida, adicione 450 microliters de solução de remoção de detritos frios e pipeta para cima e para baixo.Sobreponha suavemente a suspensão celular com um mililitro de DPBS frio, mantendo a ponta contra a parede do tubo cônico. Repita o procedimento até que a sobreposição total seja de dois mililitros. Em seguida, centrifugar a suspensão a 3.000 vezes G por 10 minutos com aceleração total e quebra total.Aspire a camada mais alta e, em seguida, varrer a ponta pipeta para frente e para trás para aspirar a camada média branca. Remova o máximo possível da camada média sem perturbar a camada mais baixa. Em seguida, adicione dois mililitros de DPBS frios e pipeta para cima e para baixo para misturar.Em seguida, centrifufique a suspensão a 1.000 vezes G por 10 minutos com aceleração total e quebra total. Após a centrifugação, descarte o supernasciente e resuspenque a pelota em um amortecedor BSA mililitro. Após a contagem de células, centrifugar a suspensão restante da célula e resuspensar a pelota em 50 microliters de mancha morta viva diluída.Em seguida, transfira a amostra para um tubo de fluxo rotulado e incubar à temperatura ambiente por 8 a 10 minutos no escuro. Após a incubação, adicione 500 microliters de tampão BSA e repita a etapa de centrifugação. Em seguida, descarte o supernatante, deixando uma pequena quantidade de tampão no tubo.O portão primário excluiu detritos na dispersão dianteira versus parcelas de dispersão lateral e as células mortas foram posteriormente excluídas. O segundo portão excluiu células positivas para a proteína básica da mielina. E das células remanescentes, foram criadas parcelas de densidade de células positivas para cada fluorocromo.A frequência de cada população de células neuronais foi calculada a partir do terceiro portão. As amostras processadas com dissociação mecânica manual e digestão enzimática produziram uma população substancialmente menor de células de interesse, enquanto amostras frescas e fixas processadas com dissociação mecânica automatizada e digestão enzimática mostraram uma população várias vezes maior de células de interesse. Embora as etapas de perfusão e remoção de detritos possam ser desafiadoras inicialmente, manter uma mão suave e firme pode ajudar a garantir o sucesso.

combined-mechanical-enzymatic-dissociation-mouse-brain-hippocampal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Dissociar as células de tipos de tecido específico requer parâmetros específicos para aggitation tecido para obter um volume elevado de viáveis, as células cultiváveis. A Miltenyi gentleMACS Dissociator otimiza essa tarefa com um protocolo simples e prática. Nesta publicação o uso deste aparelho no tecido nerual é explicado.

Geração de Single-Cell Tissue Suspensões de rato Neural

Este vídeo demonstra um protocolo para obter uma suspensão unicelular altamente viável do hipocampo do cérebro de camundongo usando uma combinação de dissociação mecânica automatizada e uma mistura de enzimas para auxiliar na digestão enzimática.

Obtenção de uma suspensão unicelular do tecido hipocampal de camundongo

Este vídeo demonstra um protocolo para extrair células microgliais de lesões desmielinizantes em cérebros de camundongos usando classificação magnética de células. O protocolo envolve a dissecação do tecido cerebral lesionado contendo células microgliais, o tratamento do tecido com enzimas específicas para obter uma suspensão unicelular e a utilização de esferas magnéticas específicas do receptor microglial para isolar as células microgliais.

Isolando a microglia de lesões desmielinizantes do cérebro de camundongos usando classificação de células ativadas por magnetismo

Este vídeo demonstra um protocolo para isolar células do hipocampo de ratos, incluindo neurônios, astrócitos e microglia.

Obtenção de várias populações de células neurais de um hipocampo de rato

Este vídeo demonstra a gravação da atividade da rede neuronal rítmica, também conhecida como oscilações, em um hipocampo isolado. Os eletrodos são inseridos em várias camadas e posições espaciais para detectar e analisar as oscilações. Isso mostra as composições neuronais únicas e a conectividade da rede neuronal em diferentes camadas do hipocampo.

Registro in vitro de oscilações no hipocampo de camundongos

Culturas neuronais embrionárias primárias dissociadas do hipocampo são úteis para investigar os mecanismos de sinalização envolvidos na morte dos neurônios. A sexagem dos embriões antes do isolamento e dissociação do hipocampo permite a preparação de culturas masculinas e femininas separadas, o que permite ao pesquisador identificar e investigar a sinalização celular específica do sexo.

Culturas neuronais estratificadas por sexo para estudar vias de morte celular isquêmica

Um protocolo para gerar um sistema de co-cultura consistindo de neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), neurônios corticais primários e astrócitos é descrito. Este sistema de co-cultura permite a detecção da formação de contatos e circuitos sinápticos entre novos neurônios derivados de iPSC e neurônios corticais pré-existentes que expressam channelrhodopsina-2.

Uma Abordagem Optogenetic para Avaliar Formação das conexões neuronais em um sistema de co-cultura

Este protocolo descreve a preparação de fatias horizontais do córtex hipocampal-entorhinal (HEC) de camundongos que exibem atividade espontânea de ondulação de ondas afiadas. As fatias são incubadas em uma câmara de realização de interface simplificada e as gravações são realizadas em condições submersas com fluido cerebrospinal artificial de fluxo rápido para promover a oxigenação tecidual e o surgimento espontâneo da atividade em nível de rede.

Corte cerebral aguda do rato para investigar atividade espontânea da rede hipocampal

Este artigo tem como objetivo descrever um protocolo sistemático para obter fatias cerebrais hipocampais horizontais em camundongos. O objetivo desta metodologia é preservar a integridade das vias de fibra hipocampal, como o caminho perfurante e o trato de fibra de musgo para avaliar processos neurológicos relacionados ao giro dento.

Fatias hipocampais horizontais do cérebro do rato

Aqui, demonstramos como combinar a transfecção de neurônios primários de roedores do hipocampo com imagens confocais de células vivas para analisar os efeitos patológicos induzidos por proteínas no transporte axonal e identificar vias mecanicistas que medeiam esses efeitos.

Usando imagens de células vivas para medir os efeitos de proteínas patológicas no transporte axonal em neurônios primários do hipocampo

O presente protocolo descreve como isolar e purificar a micróglia primária do hipocampo de camundongos adultos, seguido de instruções para a realização de gravações de patch-clamp de células inteiras nessas células agudamente isoladas.

Isolamento e registro de patch-clamp de células inteiras da microglia hipocampal de camundongos adultos

Aprenda a dissociar tecido neural do hipocampo de camundongos C57BL/6J usando digestão enzimática e dissociação mecânica. Este protocolo produz suspensões de células viáveis para análises funcionais detalhadas.

Dissociação Mecânica e Enzimática Combinada do Tecido Hipocampal cerebral do rato

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