Detecção indel seguindo CRISPR/Cas9 Mutagenesis usando análise de derretimento de alta resolução no mosquito Aedes aegypti
10 de setembro de 2021
Este artigo detalha um protocolo para identificação rápida de indels induzidos pelo CRISPR/Cas9 e seleção de linhas mutantes no mosquito Aedes aegypti utilizando análise de derretimento de alta resolução.
Este protocolo é uma maneira muito simples e eficiente de detectar mutantes gerados pela tecnologia CRISPR/Cas9 de inúmeros indivíduos. As duas principais vantagens dessa técnica são que ela pode ser feita em poucas horas e que é aplicável a uma infinidade de organismos. O design primer pode ser desafiador para certos genes e várias rodadas de design e verificação de primer podem ser necessários para tornar o HRMA eficiente.
Para realizar um PCR gradiente, comece preparando uma mistura mestra. Em seguida, remova 19 microliters da mistura mestre para o controle não-modelo ou NTC em uma placa de 96 poços. Em seguida, adicione o modelo à mistura principal restante.
Aliquot 20 microliters da mistura de amostra na placa de 96 poços. Realize o PCR seguindo os parâmetros de ciclismo e, em seguida, gere os perfis de derretimento térmico utilizando os parâmetros mencionados no manuscrito. Depois de reunir todo o material necessário, prepare uma mistura mestre com 0,5 microliters do reagente de liberação de DNA e 20 microliters de tampão de diluição por indivíduo para ser genótipado.
Usando um pipet multicanal, aliquot 20 microliters da mistura em uma placa PCR e deixe a placa PCR no gelo. Em seguida, coloque os mosquitos G1 anestesiados em uma placa de vidro petri para mantê-los sedados e coloque oito mosquitos selvagens na segunda placa de Petri. Limpe um par de pinças com 70% de etanol e use a pinça desinfetada para remover uma das pernas traseiras dos mosquitos.
Em seguida, submergir a perna na solução de reagente de liberação de DNA. Coloque o mosquito no frasco correspondente e feche o frasco com uma esponja. Uma vez feito, limpe as pinças com 70% de etanol antes de prosseguir com a remoção da perna do próximo mosquito até que a placa de 96 poços seja concluída.
Mais tarde, sele a placa com uma vedação óptica de placa PCR e incubar a placa PCR contendo as pernas em temperatura ambiente por dois a cinco minutos, seguida de incubação a 98 graus Celsius por dois minutos. Deixe a placa esfriar até a temperatura ambiente. Para PCR, prepare uma mistura mestre contendo os componentes preferidos e, em seguida, use uma pipeta multicanal para transferir 19 microliters da mistura mestre em cada poço da placa de 96 poços.
Depois de transferir um microliter da solução de liberação de DNA contendo DNA de mosquito previamente preparado para a placa, sele a placa com uma vedação óptica de placa PCR. Execute o PCR com os parâmetros de ciclismo apropriados para gerar perfis de derretimento térmico seguindo os parâmetros descritos no manuscrito e, em seguida, examine os perfis de derretimento atribuindo controle do tipo selvagem ao cluster de referência. Marque os diferentes clusters com cores correspondentes no modelo de 96 poços.
Em seguida, selecione os indivíduos com curvas de interesse e remova os indivíduos selecionados dos tubos para trás cruzado. O sangue alimenta as fêmeas, seguido pela coleta de G2As. Na análise representativa, mostra-se a análise sequencial do mutante ZIP11 do Aedes aegypti.
O eletroferograma do Aedes aegypti ZIP11 mutantes heterozigosos indicou a posição nucleotídea onde ocorreu o indel. O indel é representado por uma mudança de picos únicos para duplos, pois as posições polimórficas mostram ambos os nucleotídeos concomitantemente. Ao final da execução, o número de pares de base excluídos ou inseridos foi calculado contando os picos únicos.
Mosquitos contendo mutações nos genes Aedes aegypti ZIP11 e mio-fem foram genótipados e sequenciados verificados através da análise de derretimento de alta resolução do HRMA. Os sinais fluorescentes das amostras foram normalizados a valores relativos de um a zero. Além disso, cada curva foi subtraída da referência do tipo selvagem e denotou a ampliação correspondente.
Uma atribuição de cluster automático falhada é mostrada nos resultados representativos, onde uma distinção adequada entre os grupos não foi feita. Além disso, cada amostra foi analisada individualmente e atribuída aos grupos corretos com base na semelhança com amostras de heterozygotes, homozygotes e transheterozygotes. Após a realização das HRMAs, o sequenciamento do DNA dos indivíduos mutantes é necessário para analisar os indels e identificar as outras mutações na sequência alvo.
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Visão Geral
Este artigo detalha um protocolo para a identificação rápida de inserções e deleções induzidas por CRISPR/Cas9 e seleção de linhagens mutantes no mosquito Aedes aegypti utilizando análise de dissociação de alta resolução. O método é eficiente e aplicável a diversos organismos, permitindo a detecção rápida de mutantes.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Genética
- Biologia Molecular
- Entomologia
Antecedentes
- A tecnologia CRISPR/Cas9 é amplamente utilizada para edição gênica.
- Identificar mutações de forma eficiente é crucial para estudos genéticos.
- A análise de derretimento de alta resolução (HRMA) oferece um método rápido de detecção.
- Desafios no design de iniciadores podem afetar a eficiência da HRMA.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo para identificar mutações induzidas pelo CRISPR.
- Demonstrar a aplicabilidade da HMRA em diversos organismos.
- Agilizar o processo de seleção de linhagens mutantes.
Métodos Utilizados
- Preparação de uma mistura mestra para PCR.
- Uso de controles sem molde (NTC) em uma placa de 96 poços.
- PCR em gradiente para otimizar condições.
- Análise de derretimento de alta resolução para detectar inserções e deleções (indels).
Resultados Principais
- O protocolo permite a identificação rápida de mutantes.
- A HRMA pode ser concluída em algumas horas.
- Várias rodadas de design de iniciadores podem ser necessárias para obter eficiência.
- O método é versátil entre diferentes espécies.
Conclusões
- Este protocolo aumenta a eficiência na detecção de mutantes.
- Ele fornece uma ferramenta valiosa para a pesquisa genética em mosquitos.
- Estudos futuros podem se basear neste método para aplicações mais amplas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A detecção rápida de inserções e deleções induzidas por CRISPR/Cas9 permite a validação eficiente de alvos em pesquisas de controle de vetores, reduzindo os prazos para estudos funcionais de genes. A análise de dissociação de alta resolução possibilita o genotipagem em larga escala sem a necessidade de sacrificar o organismo, facilitando ensaios fenotípicos subsequentes e cruzamentos genéticos. Essa abordagem aumenta a confiança preditiva no estágio inicial de descoberta, fornecendo detecção quantitativa de mutações a partir de amostras mínimas de tecido.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biofármacos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da detecção rápida de inserções e deleções após a mutagênese com CRISPR.
- Valor Operacional: Apoia a redução de riscos biológicos ao identificar alelos mutantes sem sacrificar organismos, preservando amostras para ensaios complementares.
- Impacto no Portfólio: Acelera os fluxos de trabalho de validação de alvos, permitindo a priorização mais rápida de alvos gênicos em sistemas relevantes para doenças.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Produz curvas de derretimento fluorescentes normalizadas que permitem comparação quantitativa entre genótipos selvagens e mutantes.
- Valor Operacional: Compatível com formatos de placa de 96 poços, permitindo triagem de média escala de indivíduos editados.
- Prontidão do Ensaio: Gera perfis de derretimento distintos para heterozigotos, homozigotos e transheterozigotos, possibilitando atribuição confiável de agrupamentos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Permite o genotipagem seguido de fenotipagem ou alimentação com sangue, conectando a modificação genética a desfechos funcionais em modelos de doenças.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Facilita a caracterização de inserções e deleções por meio de sequenciamento posterior, confirmando efeitos no alvo e identificando possíveis modificações fora do alvo.
- Suporte a Modelos Pré-clínicos: Permite o estabelecimento de linhagens mutantes em Aedes aegypti, um vetor-chave para estudos de transmissão de arbovírus.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se na sequência de descobertas que vai da mutagênese com CRISPR até a identificação de compostos líderes, fornecendo um ponto de verificação de genotipagem antes da validação funcional.
- Biologia de Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao identificar rapidamente inserções e deleções (indels) que interrompem a função gênica em vias-alvo.
- Triagem: Permite a padronização de ensaios por meio da análise normalizada de curvas de dissociação e agrupamento baseado em referência.
- Análises: Gera deslocamentos quantitativos nos perfis de dissociação que se correlacionam ao tamanho do indel, permitindo análise comparativa entre amostras.
- Pesquisa Translacional: Conecta a modificação genética à avaliação fenotípica ao permitir o uso de organismos vivos após o genotipagem.
- Reutilização Empresarial: Reutilizável entre organismos e genes, com adaptabilidade no design de iniciadores que apoia ampla aplicabilidade a alvos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao fornecer evidência direta dos resultados da edição gênica.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade por meio de protocolos padronizados de PCR e análise de curva de dissociação com controles embutidos.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao reduzir o tempo e os recursos necessários para o rastreamento de mutantes.
- Impacto no Portfólio: Permite o avanço ajustado ao risco ao confirmar a presença da mutação antes de investir em ensaios fenotípicos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência no design e otimização de primers, pois certos genes podem necessitar de múltiplas iterações de design para uma HRMA eficiente.
- Depende de instrumentação com controle preciso da rampa de temperatura e detecção de fluorescência para análise de dissociação de alta resolução.
- Necessita de preparação padronizada de amostras utilizando tecido de perna e reagentes de liberação de DNA para garantir qualidade constante da entrada.
- Requer amostras de referência selvagem para atribuição precisa dos agrupamentos e normalização do perfil de dissociação.
- Limitado pela necessidade de sequenciamento pós-HRMA para caracterizar completamente as inserções e deleções e detectar mutações adicionais na sequência-alvo.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:33
A Gradient PCR Using Genomic DNA (gDNA) from a Single Individual
1:09
Preparation of Genomic DNA from Mosquito Legs
2:31
Perform PCR
3:35
Results: Detection of CRISPR/Cas9-Induced Indels and the Establishment of Mutant Lines in the Mosquito Aedes aegypti
5:02
Conclusion
