Name: A adesão molecular de imagem em rolamento celular por ensaio de pegada de adesão (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Aprenda a realizar o ensaio de pegada de adesão para investigar eventos de adesão molecular durante o rolamento celular rápido. Este método permite mapear espacialmente e quantificar forças de adesão em nível molecular usando microscopia TIRF.

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Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Inovação do Canadá (CFI 35492), Conselho de Ciências Naturais e Engenharia do Canadá Discovery Grant (RGPIN-2017-04407), New Frontiers in Research Fund (NFRFE-2018-00969), Michael Smith Foundation for Health Research (SCH-2020-0559) e a University of British Columbia Emin Fund.

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Os autores não declaram conflito de interesses.

O ensaio de pegada de adesão permite a visualização dos eventos de adesão molecular entre PSGL-1 e P-selectin durante a adesão ao rolamento celular. Este processo é iniciado por captura mediada por P-selectin seguido de rolagem sob estresse fluido de tesoura. Problemas potenciais durante o experimento geralmente envolvem más rolamentos celulares ou rastros fluorescentes ausentes mesmo quando as células rolam bem. Esses problemas muitas vezes são resultantes de controles de qualidade nas etapas críticas do protocolo, conf...

A cascata de aderência rolando descreve como as células circulantes se amarram e rolam ao longo da parede do vaso sanguíneo1. O rolamento passivo é mediado principalmente por selectins, uma grande classe de moléculas de adesão celular (CAMs)1. Sob o fluxo de cisalhamento de sangue, leucócitos expressando ligante de glicoproteína P-selectin -1 (PSGL-1) formam ligações altamente transitórias com p-selectina, que podem ser expressas na superfície de células endoteliais inflamadas. Esse processo é fundamental para que os leucócitos migrem para um local de inflamação2. Além disso, o PSGL-1 também é um receptor mecanosensível capaz de desencadear o estágio subsequente de adesão firme da cascata de adesão rolando após seu engajamento com P-selectin3.
Mutações genéticas que afetam a função CAM podem afetar severamente o sistema imunológico, como na rara doença da deficiência de adesão leucócito (LAD), onde o mau funcionamento das moléculas de adesão que mediam o rolamento leva a indivíduos severamente imunocomprometidos4,5,6. Além disso, as células tumorais circulantes têm sido mostradas para migrar após um processo de rolagem semelhante, levando à metástase7,8. No entanto, como o rolamento celular é rápido e dinâmico, os métodos de mecanobiologia experimental convencionais são inadequados para estudar interações moleculares durante o rolamento celular. Embora métodos de manipulação de células únicas e moléculas únicas, como microscopia de força atômica e pinça óptica, foram capazes de estudar interações moleculares, como a interação dependente da força de P-selectin com o PSGL-1 no nível de molécula única9, eles são inadequados para investigar eventos de adesão ao vivo durante o rolamento celular. Além disso, a interação caracterizada in vitro não pode responder diretamente à pergunta sobre a adesão molecular in vivo. Por exemplo, que faixa de tensão molecular é biologicamente relevante quando as células estão funcionando em seu ambiente nativo? Métodos computacionais, como simulação de dinâmica adesiva10 ou modelo simples de estado estável11, capturaram certos detalhes moleculares e como influenciam o comportamento de rolamento, mas são altamente dependentes da precisão dos parâmetros e suposições de modelagem. Outras técnicas como microscopia de força de tração podem detectar forças durante a migração celular, mas não fornecem resolução espacial suficiente ou informações quantitativas sobre tensão molecular. Nenhuma dessas técnicas pode fornecer observações experimentais diretas da dinâmica temporal, distribuição espacial e heterogeneidade de magnitude das forças moleculares, que se relacionam diretamente com a função celular e o comportamento em seu ambiente nativo.
Portanto, implementar um sensor de força molecular capaz de medir com precisão interações seletivas mediadas é crucial para melhorar nossa compreensão da adesão de rolamento. Aqui, descrevemos o protocolo para o ensaio de pegada de adesão12 onde as contas revestidas psgl-1 são enroladas em uma superfície apresentando amarras de medidor de tensão funcionalizadas p-selectin (TGTs)13. Estes TGTs são sensores de força irreversíveis baseados em DNA que resultam em um histórico permanente de eventos de ruptura na forma de leitura de fluorescência. Isso é conseguido através da ruptura do TGT (dsDNA) e, em seguida, posterior rotulagem do TGT rompido (ssDNA) com uma cadeia complementar fluorescentemente rotulada. Uma grande vantagem deste sistema é sua compatibilidade com imagens limitadas à difração e super-resolução. O fio complementar fluorescente ou rotulado pode ser permanentemente vinculado (>12 bp) para imagens limitadas à difração ou vinculado transitoriamente (7-9 bp) para imagens de super-resolução através de TINTA DE DNA. Este é um sistema ideal para estudar a adesão de rolamento, pois os TGTs são rompidos durante o rolamento ativo, mas a leitura da fluorescência é analisada após a rolagem. Os dois métodos de imagem também proporcionam ao usuário mais liberdade para investigar a adesão em rolamento. Normalmente, a imagem limitada à difração é útil para extrair força de ruptura molecular através da intensidade da fluorescência13, enquanto a imagem de super-resolução permite a análise quantitativa da densidade do receptor. Com a capacidade de investigar essas propriedades de adesão de rolamento, essa abordagem fornece uma plataforma promissora para entender o mecanismo de regulação da força sobre a adesão molecular das células rolantes sob fluxo de cisalhamento.

<table><tbody><tr><td>Guia de perfuração de 4 canais</td><td>Impresso em</td> 3D personalizado <td></td><td>com filamento ABS</td></tr><tr><td>Corrediça de 4 furos</td><td>Feito</td><td></td> à medida <td>Broca limpa a lâmina do microscópio utilizando uma Dremel com brocas revestidas de diamante numa guia de perfuração de 4 canais que tem um layout que corresponde aos centros dos 8-32 furos roscados na braçadeira de alumínio.</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>VWR</td><td>BDH1101-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Espaçador acrílico</td><td>Feito</td><td></td> à medida <td>Corte dois blocos de folhas de acrílico com a dimensão de 40 mm x 30 mm x 2,5 mm. Em cada bloco, faça dois furos de 3 mm alinhados com precisão com os 4-40 furos no suporte de alumínio.</td></tr><tr><td>Porta-cavacos de alumínio</td><td>Feito sob medida</td><td></td><td>Bloco de alumínio anodizado à máquina em um suporte em forma de C com a dimensão externa de 640 mm x 500 mm x 65 mm e a dimensão de abertura de 400 mm x 380 mm x 65 mm. As entradas e saídas são rosqueadas com rosca 8-32.</td></tr><tr><td>Aminosilano</td><td>AlfaAesar</td><td>L14043</td><td>CAS 1760-24-3</td></tr><tr><td>Solução antibiótica/antimicótica</td><td>Cytiva HyClone</td><td>SV3007901</td><td>Caneta/Strep/Fungiezone</td></tr><tr><td>Beads, Poliestireno revestido com ProtG</td><td>Spherotech</td><td>PGP-60-5</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>VWR</td><td>332</td><td></td></tr><tr><td>Tamponamento, DNA PAINT</td><td></td><td></td><td>0,05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, tampão EDTA de 1 mM</td></tr><tr><td>, T50M5</td><td></td><td></td><td>10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2</td></tr><tr><td>Buffer, Rolling</td><td></td><td></td><td>HBSS com 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0,1% de</td></tr><tr><td>tampão BSA, lavagem</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 e 2 mM CaCl2, 0,05% Tween 20</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>VWR</td><td>BDH9224</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de cultura celular</td><td>VWR</td><td>10062-868</td><td></td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico concentrado</td><td>VWR</td><td>BDH3072-2,5LG</td><td>95-98%</td></tr><tr><td>Pinça de fixação de lamínula</td><td>Techni-Tool</td><td>758TW150</td><td></td></tr><tr><td>Broca revestida de diamante bits</td><td>Tecnologia abrasiva</td><td>C5250510</td> DNA de <td>broca de diamante de 0,75 mm</td></tr><tr><td>, amina-ssDNA (fio superior)</td> <td>IDT</td><td>DNA Oligo personalizado</td><td>CCGGGCGACGCAGGAGGG / 3AmMO /</td></tr> <tr><td>DNA, biotina-ssDNA (fio inferior)</td> <td>IDT</td><td>DNA Personalizado oligo</td> <td>/ 5BiotinTEG / TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG</td></tr><tr><td>DNA, filamento de imagem para DNA-PAINT</td><td>IDT DNA</td><td>Oligo personalizado</td><td>GAGGGAAA TT / 3Cy3Sp/</td></tr><tr><td>DNA, fio de imagem para rotulagem permanente</td><td>IDT DNA</td><td>Oligo personalizado</td><td>CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/</td></tr><tr><td>Fita dupla face</td><td>Scotch</td><td>237</td><td>3/4 de polegada de largura, fita dupla face permanente</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermofisher</td><td>15575020</td><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td></tr><tr><td>Epóxi</td><td>Gorilla</td><td>42001</td><td>Tempo de cura de 5 minutos</td></tr><tr><td>Soro Bovino Fetal (FBS)</td><td>Avantor</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>GelGreen</td><td>Biotium</td><td>41005</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>VWR</td><td>BDH3094-2.5LG</td><td></td></tr><tr><td>Vidro, lamínulas</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5P</td><td></td></tr><tr><td>Vidro, Lâmina de microscópio</td><td>VWR</td><td>48300-026</td><td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td></tr><tr><td>Vidro, Frasco de coloração</td><td>VWR</td><td>74830-150</td><td>Frasco de coloração Wheaton (900620)</td></tr><tr><td>Solução salina balanceada de Hanks (HBSS)</td><td>Lonza</td><td>04-315Q</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>HL-60 células</td><td>ATCC</td><td>CCL-240</td><td></td></tr><tr><td>Suporte deslizante da câmara de umidade</td><td>Feito sob medida</td><td></td><td>impresso em 3D com filamento ABS</td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio</td><td>VWR</td><td>BDH7690-1</td><td>30%</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>Entradas/Saídas</td><td>Feitas sob medida</td><td></td><td>Perfure oito parafusos de fixação 8-32 usando brocas de cobalto. Inserção 1,5 cm&nbsp; tubo de polietileno (Tygon, I.D. 1/32" O.D. 3/32") em cada parafuso de fixação oco</td></tr><tr><td>Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)</td><td>Lonza</td><td>12-722F</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>VWR</td><td>BDH9244</td><td></td></tr><tr><td>Contas magnéticas Ni-NTA</td><td>Tubos de correio Invitrogen</td><td>10103D</td><td></td></tr><tr><td></td><td>EMS</td><td>EMS71406-10</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns</td><td>Biorad</td><td>7326200</td><td>In SSC Buffer</td></tr><tr><td>PEG</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>PEG-biotina</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotina-PEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de potássio</td><td>VWR</td><td>470302-132</td><td></td></tr><tr><td>Proteína, Proteína G</td><td>Abcam</td><td>ab155724</td><td>N-terminal His-Tag e C-terminal Proteína cisteína</td></tr><tr><td>, P-selectina-Fc</td><td>R& D System</td><td>137-PS</td><td>Proteína Quimera P-selectin/CD62P Fc Humana Recombinante, Proteína CF</td></tr>, <tr><td>Seringa de Bomba</td><td></td><td></td> de Estreptavidina Cedarlane CL1005-01-5MG Aparelho Harvard 704801 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Bicarbonato de Sódio Ward'<td></td></tr><tr><td></td><td> s Science</td><td>470302-444</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>VWR</td><td>97061-274</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SMCC</td><td>Thermofisher</td><td>22322</td><td></td></tr><tr><td>Seringa</td><td>Hamilton</td><td>81520</td><td>Seringas com trava luer de PTFE, agulhas</td></tr><tr>de<td>seringa</td><td>de</td> 5 mL BD <td>305115</td><td>Precision Glide 26 G, comprimento de 5/8 polegadas</td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706-2G</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Tris</td><td>VWR</td><td>BDH4502-500GP</td><td></td></tr><tr><td>, Adaptador</td><td>Tygon</td><td>ABW00001</td><td>Formulação 3350, I.D. 1/32"; O.D. 3/32"</td></tr><tr><td>Tubulação, Polietileno</td><td>BD Intramedic</td><td>427406</td><td>Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93773</td><td></td></tr></tbody></table>

a adesão molecular de imagem em rolamento celular por ensaio de pegada de adesão

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

A adesão de rolamento, facilitada por interações seletivas mediadas, é uma motilidade altamente dinâmica e passiva no recrutamento de leucócitos para o local da inflamação. Este fenômeno ocorre em venules pós-capilares, onde o fluxo sanguíneo empurra leucócitos em um movimento de rolamento sobre as células endoteliais. O rolamento estável requer um delicado equilíbrio entre a formação de vínculos de adesão e sua dissociação mecanicamente conduzida, permitindo que a célula permaneça presa à superfície enquanto rola na direção do fluxo. Ao contrário de outros processos de adesão que ocorrem em ambientes relativamente estáticos, a adesão é altamente dinâmica à medida que as células rolante viajam sobre milhares de mícrons a dezenas de mícrons por segundo. Consequentemente, métodos convencionais de mecanobiologia, como microscopia de força de tração, são inadequados para medir os eventos de adesão individual e as forças moleculares associadas devido à curta escala de tempo e alta sensibilidade necessária. Aqui, descrevemos nossa mais recente implementação do ensaio de pegada de adesão para imagem das interações P-selectin: PSGL-1 na adesão de rolamento no nível molecular. Este método utiliza amarras irreversíveis de medidor de tensão baseada em DNA para produzir uma história permanente de eventos de adesão molecular na forma de trilhas de fluorescência. Essas faixas podem ser imagens de duas maneiras: (1) costurando milhares de imagens limitadas à difração para produzir um grande campo de visão, permitindo a extração de pegada de adesão de cada célula rolante sobre milhares de mícrons de comprimento, (2) realizando DNA-PAINT para reconstruir imagens de super-resolução das faixas de fluorescência dentro de um pequeno campo de visão. Neste estudo, o ensaio de pegada de adesão foi utilizado para estudar células HL-60 rolando em diferentes estresses de tesoura. Ao fazê-lo, fomos capazes de imaginar a distribuição espacial da interação P-selectin: PSGL-1 e obter insights sobre suas forças moleculares através da intensidade da fluorescência. Assim, este método fornece as bases para a investigação quantitativa das diversas interações célula-superfície envolvidas na adesão de rolamento a nível molecular.

O protocolo acima descreve o procedimento experimental do ensaio de pegada de adesão. O fluxo de trabalho do experimento geral é ilustrado na Figura 1, desde a montagem da câmara de fluxo (Figura 1A) até a funcionalização da superfície (Figura 1B) e etapas de experimento e imagem (Figura 1C).
A Figura 2 é um resultado representativo para a caract...

Este protocolo apresenta os procedimentos experimentais para realizar o ensaio da pegada de adesão para a imagem dos eventos de adesão durante a adesão rápida ao rolamento celular.

A adesão molecular de imagem em rolamento celular por ensaio de pegada de adesão

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of ...

Este protocolo ajuda a estabelecer a conexão entre a força molecular e o comportamento de rolagem celular, além de permitir mapear espacialmente e quantificar a adesão ao rolamento no nível molecular. Esta técnica permite estudar eventos de adesão individual durante o rolamento celular real, permitindo medir diretamente a força de adesão molecular relevante fisiológica. A preparação da superfície usando o tempo de concentração e incubação adequado em cada etapa é crucial para alcançar a funcionalidade de superfície de alta qualidade.A qualidade das bioconjugações e as condições adequadas também são cruciais. A demonstração visual é fundamental para ajudar os pesquisadores a replicar esse protocolo. Em particular, as etapas como a montagem da câmara de fluxo e imagens pós-processamento se beneficiarão muito de uma demonstração visual.Comece espalhando uma pequena quantidade de epóxi em ambos os lados da fita de dois lados com uma lâmina de barbear. Usando um laser, corte a fita revestida de epóxi para criar quatro canais. Crie o chip de fluxo sanduitando a fita epóxi entre um slide de quatro buracos e uma mancha de cobertura PEG.Usando uma ponta de pipeta, aplique pressão suave ao longo do comprimento dos canais para criar uma boa vedação e, em seguida, cure o epóxi por um mínimo de uma hora. Alinhe o chip para que a abertura de cada canal esteja posicionada nos centros do adaptador. Em seguida, coloque dois espaçadores acrílicos transparentes em cima do chip.Aplique pressão firme no meio do bloco e parafuso nas extremidades de cada espaçador. Enrosque as entradas nos orifícios roscados do outro lado do suporte e monitore a condição de vedação através do bloco acrílico transparente. Flua 200 microliters de tampão de lavagem na câmara para verificar se há vazamento.Se as bolhas se formarem no canal, empurre agressivamente mais 200 microliters de tampão de lavagem para remover as bolhas. Adicione 40 microliters de BSA à câmara de fluxo para evitar a ligação inespecífica e incubar por 10 minutos na câmara de umidade. Após a incubação, adicione 40 microliters na Tween 20 à câmara de fluxo e incuba novamente por 10 minutos para reduzir ainda mais a ligação inespecífica.Em seguida, lave o canal com 200 microliters de tampão de lavagem para remover todos os agentes de passivação. Para a funcionalização da superfície da câmara, adicione 40 microliters de Streptavidin à câmara de fluxo e incuba por 20 minutos, depois lave a câmara com 200 microliters de tampão de lavagem. Agora, adicione 40 microliters de proteína hibridizada G-TGT à câmara de fluxo e incubar por 20 minutos.Depois de lavar com tampão de lavagem, adicione 40 microliters de proteína G-TGT top strand e incuba por 20 minutos para completar qualquer fio inferior TGT não higiido na superfície e depois lave com tampão de lavagem. Por fim, adicione 40 microliters de P-selectin-Fc à câmara de fluxo e incubar por 60 minutos antes de lavar com tampão de lavagem. Encha uma seringa de vidro de cinco mililitros com o tampão de rolamento e toque nas laterais da seringa para desalojar e empurrar as bolhas para fora enquanto flutuam em direção à ponta.Depois de inserir uma agulha estéril em um pedaço de tubo de polietileno de 200 milímetros, conecte a agulha à seringa de vidro. Fixar a seringa na bomba de seringa e inclinar a bomba de seringa de tal forma que o lado do êmbolo seja elevado para evitar que bolhas de ar entrem no canal. Insira a extremidade do tubo na entrada da câmara de fluxo.Insira uma extremidade de outra peça de 200 milímetros da tubulação de polietileno na tomada e submerse a outra extremidade em um béquer de resíduos. Pegue de um a dois mililitros da amostra de suspensão celular e centrífuga para pelotar as células. Remova o meio e levemente resuspenque as células em 500 microliters do buffer de rolamento.Desconecte cuidadosamente o tubo das entradas e a saída e pipeta 40 microliters da suspensão celular na câmara de fluxo. Reconecte a tubulação como descrito anteriormente, garantindo que as bolhas não sejam introduzidas no canal de fluxo. Inicie o experimento de rolagem celular iniciando a bomba de seringa nas taxas de fluxo desejadas.Observe o rolamento de células usando um microscópio de campo escuro com um objetivo de 10X. Uma vez que o experimento seja concluído, remova as células do canal infundindo o tampão de rolamento a 100 mililitros por hora até que a superfície esteja livre de células. Para a imagem das faixas locais por DNA-PAINT, adicione 40 microliters de fio imager DNA-PAINT preparado em buffer DNA-PAINT ao canal.Realize microscopia de fluorescência de reflexão interna total utilizando as condições mencionadas no manuscrito do texto. Localize e torne as imagens de super resolução. Para fotografar as faixas longas por rotulagem permanente, adicione o fio imager permanente e incubar por 120 segundos no buffer T50M5.Em seguida, lave o canal infundindo 200 microliters de tampão de lavagem. Grave uma imagem com o laser de excitação desligado para obter ruído de câmera de fundo. Imagem uma grande área em um padrão de grade pela microscopia TIRF.Programe o microscópio para digitalizar a área de 400 por 50 imagens e divida os dados brutos em arquivos TIP individuais cada um contendo um máximo de 10.000 imagens usando o programa ImageJ. Achate todas as imagens usando o perfil de iluminação e use o plugin MIST para costurar as imagens. O resultado para a caracterização da bioconjugação da proteína G ssDNA mostrou que quase uma é uma razão de proteína G para ssDNA onde a proteína G Maleimide ssDNA e espectro tampão de eluição imidazol da base ortogonal para a montagem do espectro do produto de bioconjugação.Native PAGE foi usado para confirmar a bioconjugação mostrando as bandas verdes brilhantes coincidindo com a banda de proteína monomérica G indicando conjugação bem sucedida e bom rendimento. O perfil de iluminação TIRF introduzido a partir de uma fibra de modo único é geralmente mais brilhante no meio do campo de visão e dimmer ao redor das bordas. Para compensar a iluminação desigual e achatar as imagens para análise quantitativa, o perfil de iluminação foi determinado pela média de milhares de quadros individuais.As imagens achatadas foram produzidas subtraindo o ruído da câmera tanto de perfis brutos quanto de iluminação e, em seguida, normalizando pelo perfil de iluminação. A costura bruta mostrou padrões periódicos claros correspondentes às imagens não corrigidas, enquanto o mesmo campo de visão costurado a partir de imagens achatadas produziu um fundo plano. Um perfil de fluxo de rampa foi usado para determinar a amplitude de estresse da cisalhamento que resultou em rolagem celular e fluxo de fluorescência sob as quais uma pegada típica de adesão unicelular poderia ser vista.Resultados subótimos e ótimos de trilhas fluorescentes com contraste insuficiente, densidade excessiva da faixa, densidade e contraste da pista ideais e difusão limitada e imagem DNA-PAINT são mostrados. O tempo de incubação superior a 60 minutos garante a funcionalização da superfície e a construção adequada da câmara impede a passagem de bolhas que danificam a superfície funcionalizada. Este procedimento é aplicável para análise quantitativa da força molecular envolvida na adesão ao rolamento e permite que os pesquisadores entendam o comportamento de rolagem dos diferentes tipos celulares.Essa técnica permite que os pesquisadores explorem novas questões sobre eventos de adesão rápida que levem a um avanço da pesquisa de molécula única e mecanobiologia.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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