Name: Um ensaio celular baseado em repórter para monitorar a eficiência do splicing (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Aprenda a monitorar a eficiência do splicing em células HeLa usando um ensaio com repórter minigene adaptável. Este método permite estudar mutações associadas a doenças e desenvolver estratégias terapêuticas com U1 snRNA supressor.

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Este trabalho foi apoiado por fundos para s.S. dos Institutos Nacionais de Saúde (R21CA170786 e R01GM127464) e para a American Cancer Society (o Institutional Research Grant 74-001-34-IRG) e para S.S. e W.M. do Valley Research Partnership Program (P1-4009 e VRP77). O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

1. Reagentes e tampões
NOTA: Toda a esterilização utilizando filtros de vácuo deve ser realizada com membrana de 0,2 μm de polietroéfone (PES) em um armário de biossegurança.
<ol><li>Prepare a água sem RNase adicionando 1,0 mL de dietilpirto (DEPC) a 1,0 L de água desionizada, misture por pelo menos 1 hora à temperatura ambiente (RT), autoclave duas vezes e depois esfrie para RT antes de usar.</li>
	<li>Prepare o DMEM (Modified Eagle Medium, meio de águia modificada) de Dulbecco misturando um pacote de pó DMEM (13,4 g), 3,7 g de bicarbonato de sódio, 100 mL de soro bovino fetal (FBS), penicilina e estreptomicina a ~800 mL de água desionizada estéril. A concentração final de penicilina e estreptomicina no DMEM deve ser de 50 U/mL e 50 μg/mL, respectivamente. Ajuste o pH para 7,4 e, em seguida, compor o volume para 1,0 L com água deionizada estéril. Esterilize por filtragem e armazene a 4 °C.</li>
	<li>Prepare 10x salina tamponada de fosfato (10x PBS) adicionando 25,6 g de heptahydrate de hidrogênio dissódico (Na2HPO4· 7H2O), 2 g de fosfato de dihidrogênio de potássio (KH2PO4), 2 g de cloreto de potássio (CÍN) e 80 g de cloreto de sódio (NaCl) a 800 mL de água desionizada. Misture para dissolver e compor o volume até 1,0 L. Esterilize por filtragem e armazene a 4 °C.</li>
	<li>Prepare 0,5 M 0,5 M de diamina de etileno tetra-actic ácido (EDTA) dissolvendo 186,1 g de Na2•EDTA•2H2O em ~800 mL de água desionizada. Ajuste o pH para 8.0 e, em seguida, compor o volume para 1,0 L com água deionizada estéril. Esterilize por filtragem e armazene a 4 °C.</li>
	<li>Prepare a solução 1x trypsin-EDTA misturando 100 mL de trippsina de 10x (2,5%), 2 mL de 0,5 M EDTA e adicione 1x PBS até 1,0 L. Esterilize por filtragem e alíquota em tubos consíquicos de 50 mL. Armazene a 4 °C durante 1-2 semanas ou congele a -20 °C para uso a longo prazo.</li>
	<li>Prepare 2x corante de carregamento de DNA/RNA formamide misturando 14,4 mL de formamida e 0,6 mL de 0,5 M EDTA para um volume final de 15 mL. Adicione bromofenol azul e xileno cyanol em pó a uma concentração final de 0,02% e armazene a 4 °C. NOTA: A formamida é tóxica e corrosiva. Leia as folhas de dados de segurança do material para obter recomendações adicionais de segurança.</li>
	<li>Prepare 5x Tampão Tris/Borate/EDTA (5x TBE) misturando 54,0 g de base tris, 27,5 g de ácido bórico e 20 mL de 0,5 M EDTA em ~800 mL de água desionizada. Misture para dissolver e compor o volume até 1,0 L com água deionizada.</li>
	<li>Prepare a solução de eletroforese de gel de ureia-poliacrilamida (ureia-PAGE) misturando 200 mL de 5x TBE, 250 mL de 40% 19:1 bis/acrilamida e 450,5 g de ureia. Em seguida, adicione água deionizada até 1,0 L. Misture até que os ingredientes estejam completamente dissolvidos, depois esterilize por filtragem e armazene a 4 °C em uma garrafa de vidro âmbar. NOTA: Bis/acrilamida é tóxico. Leia as fichas de segurança do material para procedimentos adicionais de segurança.</li>
	<li>Prepare 10% persulfito de amônio (APS) dissolvendo 1 g de APS em 10 mL de água desionizada e armazene a 4 °C.</li>
</ol>2. Cotransfecção de células HeLa com o repórter e plasmídeos de snRNA U1
NOTA: A transfecção das células hela devem ser realizadas em condições estéreis em um gabinete de segurança biológica. A superfície externa de todos os materiais deve ser pulverizada com 70% de etanol antes de ser introduzida no gabinete de segurança biológica.
<ol><li>Mantenha as células Hela em DMEM em uma incubadora de 37 °C com 5% de CO2 , passando a cada 2-3 dias quando as células são cerca de 80-90% confluentes.</li>
	<li>Para a passagem de células HeLa, aspire o meio gasto e, em seguida, incubar células com 3 mL de 0,25% de trippsina contendo 1 mM EDTA a 37 °C por 3 min.</li>
	<li>Após a incubação, adicione 7 mL de DMEM fresco. Transfira a suspensão celular para um tubo de 10 mL, centrífuga a 1.000 x g por 5 min.</li>
	<li>Resuspend a pelota celular em 10 mL de DMEM fresco, e, em seguida, plaque as células em um novo prato de cultura tecidual em 20% de confluência.</li>
	<li>Para transfecções transitórias, conte as células hela com um escorregador hemótmetro limpo e prepare uma suspensão com uma densidade de 2,5 x 105 células/mL.</li>
	<li>Semente 1,0 mL de 2,5 x 105 células/mL suspensão de células Hela em cada poço de uma placa de 12 poços e incubar durante a noite a 37 °C.</li>
	<li>No dia seguinte, aspire o meio gasto e adicione 0,8 mL de DMEM fresco com soro.</li>
	<li>Prepare a solução I adicionando 0,2 μg de Plasmid repórter Dup51 ou Dup51p, 1,8 μg de pcDNA, pNS6U1 ou pNS6U1-5a plasmid, e 100 μL de meio de transfecção em um novo tubo de microcentrifuge de 1,5 mL.</li>
	<li>Prepare uma mistura mestre da Solução II para que todas as amostras sejam transfeccionadas adicionando 100 μL de meio de transfecção e 4,0 μL de reagente de transfecção por amostra.</li>
	<li>Prepare o mix de transfecção adicionando 100 μL de Solução II em cada tubo de microcentrifuuagem contendo a Solução I.</li>
	<li>Vórtice a transfecção se mistura para 15 s, centrífuga em uma microcentrifuagem de mesa a 3.000 x g por 10 s em RT, e depois incubar na RT por 5 minutos.</li>
	<li>Adicione todos os 200 μL da mistura de transfecção em um poço da placa de célula HeLa de 12 poços para obter um volume final de 1,0 mL por poço e incubar a placa a 37 °C por 48 horas.</li>
	<li>Após a incubação, extraia RNA das células HeLa transfectadas com solução comercialmente disponível de tiocianato e fenol. NOTA: Este reagente contém fenol e este passo deve ser realizado em um capô de fumaça. Recomenda-se o uso de água tratada DEPC para a ressuspensão do RNA extraído.<ol>
<li>Aspire o meio gasto e adicione 500 μL do reagente em cada poço. Incubar na RT por 5 min.</li>
		<li>Homogeneize-se se escoando para cima e para baixo. Em seguida, transfira a solução para um novo tubo de microcentrifusagem de 1,5 mL.</li>
		<li>Adicione 100 μL de clorofórmio e vórtice para 15 s.</li>
		<li>Centrifugar a 12.000 x g por 15 min no RT.</li>
		<li>Transfira 200 μL do RNA contendo, camada superior aquosa para um novo tubo de microcentrifuge de 1,5 mL.</li>
		<li>Adicione 2 μg de glicogênio e 200 μL de isopropanol a cada amostra de RNA. Misture invertendo os tubos.</li>
		<li>Colete o RNA precipitado por centrifugação a 12.000 x g por 10 min a 4 °C.</li>
		<li>Remova e descarte o supernatante sem perturbar a pelota de RNA.</li>
		<li>Lave a pelota duas vezes adicionando 1,0 mL de 70% de etanol, invertendo os tubos e centrifugando conforme descrito no Passo 2.13,7.</li>
		<li>Aere a pelota por ~10-20 min na RT e resuspenque o RNA em 10-20 μL de água sem RNase.</li>
		<li>Determine a concentração de RNA medindo a absorvância a 260 nm, conforme descrito por Desjardins e Conklin9.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Proceda com extensão de primer ou armazene amostras de RNA em -20 °C. O RNA isolado pode ser armazenado a -20 °C durante 6-12 meses.</li>
</ol>3. Rotulagem 32P de oligonucleotídeos
NOTA: As etapas que envolvem o uso de oligonucleotídeos 32P-ATP e 32P devem ser realizadas atrás de um escudo acrílico por indivíduos treinados com aprovação de entidades institucionais autorizadas. O protocolo descrito abaixo pode ser usado para rotulagem de oligonucleotídeos, Dup3r e U17-26-R, e marcadores para ureia-PAGE. Recomenda-se o uso de água tratada DEPC para a ressuspensão de oligonucleotídeos e contas de exclusão de tamanho.
<ol><li>Para um tubo de microcentrifuge de 1,5 mL, adicione oligonucleotídeo, quinase de polinucleotídeo T4 (T4 PNK), tampão T4 PNK e 32P-ATP conforme descrito na Tabela 1. Adicionar 32P-ATP por último à mistura; isso é importante. NOTA: Para a adição de soluções radioativas, recomenda-se o uso de dicas de filtro.</li>
	<li>Incubar em um banho de água a 37 °C por 30 min.</li>
	<li>Enquanto as reações de rotulagem estão incubando, resuspenque as contas de exclusão de tamanho com um peso molecular de 25 kDa cortado por vórtice suavemente para ~10 s. NOTA: As contas de exclusão de tamanho devem ser preparadas de acordo com as instruções do fabricante e armazenadas como uma suspensão de 50% em 25% de etanol a 4 °C.</li>
	<li>Prepare as colunas transferindo 600 μL das contas resuspended para uma mini coluna descartável colocada em um tubo de coleta de 1,5 mL e devolvendo o estoque de contas para 4 °C.</li>
	<li>Centrifugar a 2.000 x g por 1 min em RT e descartar o fluxo através.</li>
	<li>Lave as contas adicionando 300 μL de água sem RNase à coluna.</li>
	<li>Repita os passos 3.5. e 3,6. duas vezes e transfira a mini-coluna para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mL.</li>
	<li>Adicione a mistura de reação quinase à coluna de contas de exclusão de tamanho e centrífuga a 5000 x g por 1 min no RT.</li>
	<li>Colete e salve o fluxo através, que tem o oligonucleotídeo 32P rotulado, e descarte todas as pontas e tubos em uma caixa de resíduos acrílicos.</li>
	<li>Adicione 20 μL de água sem RNase para diluir oligonucleotídeo rotulado em 32P a uma concentração final de 2,5 μM. NOTA: Diluir os marcadores rotulados conforme necessário para o carregamento em géis de ureia-PAGE.</li>
	<li>Armazene o oligonucleotídeo rotulado em uma caixa de microtubo acrílico a -20 °C ou prossiga com a análise de extensão do primer.</li>
</ol>4. Análise das transcrições de repórteres emendadas por extensão de primer
NOTA: Recomenda-se limpar superfícies e equipamentos com um reagente de inativação RNase antes de usar.
<ol><li>Adicione 2,0 μg de RNA extraído das células Hela em tubos separados de microcentrífugo de 200 μL e adicione água livre de RNase para compensar o volume a 6,55 μL.</li>
	<li>Prepare o Master Mix I com os 32P-Dup3r diluídos e dNTPs, conforme mostrado na Tabela 2 e adicione 0,9 μL da mistura a cada tubo PCR contendo amostras de RNA.</li>
	<li>Incubar os tubos, primeiro a 65 °C por 5 min e depois no gelo por 1 min.</li>
	<li>Prepare o Master Mix II com 5x First Strand Buffer, dithiothreitol (DTT), inibidor de RNase e transcriptase reversa, como mostrado na Tabela 2.</li>
	<li>Adicione 2,55 μL da mistura a cada tubo contendo RNA e Master Mix 1; o volume total da reação deve ser de 10 μL. Mantenha os tubos em RT por 10 minutos.</li>
	<li>Transfira os tubos para um banho seco ou um ciclofatóte e incubar, primeiro a 50 °C por 60 min e depois a 70 °C por 15 min.</li>
	<li>Após a incubação, adicione 10 μL de 2x de corante de carregamento de RNA formamida a cada amostra e armazene em uma caixa de acrílico a -20 °C ou proceda com a separação de fragmentos por ureia-PAGE usando um gel de 14 cm de comprimento e visualização de imagem de gel conforme descrito abaixo na Etapa 8.</li>
	<li>Realize a varredura densitométrica da imagem em gel com um software de análise de imagem e use as intensidades de banda de produtos incluídos e ignorados para calcular a porcentagem de inclusão do exon 2, conforme mostrado abaixo. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63014/63014eq01v2.jpg">
</li>
</ol>5. Análise das transcrições de repórteres emendadas por RT-PCR fluorescente
NOTA: A análise RT-PCR descrita abaixo utiliza hexamers aleatórios para síntese de CDNA e uma combinação de oligonucleotídeos Dup3r não rotulados e Cy5 para amplificação pcr dos produtos emendados.
<ol><li>Para a síntese de CDNA, adicione 2,0 μg de RNA extraído das células Hela transfectadas em tubos separados de microcentrifuuge de 200 μL e adicione água livre de RNase para compensar o volume a 11,0 μL.</li>
	<li>Prepare o Master Mix I, contendo hexamers aleatórios e dNTP como mostrado na Tabela 3 e adicione 2,0 μL da mistura a cada amostra. Incubar, primeiro a 65 °C por 5 min e depois no gelo por 1 min.</li>
	<li>Prepare o Master Mix II, contendo o Primeiro Buffer de Fio, inibidor de RNase, DTT e transcriptase reversa, conforme mostrado na Tabela 3 e adicione 7,0 μL da mistura a cada tubo contendo RNA e Master Mix I.</li>
	<li>Mantenha os tubos em RT por 10 minutos e, em seguida, incubar a 50 °C por 60 min e 70 °C por 15 min. NOTA: As reações completas do CDNA podem ser armazenadas a -20 °C.</li>
	<li>Para PCR, transfira 1,0 μL (100 ng/μL) de cada amostra de cDNA para novos tubos PCR.</li>
	<li>Prepare uma mistura mestre composta por Dup8f, Cy5-Dup3r, dNTPs, tampão Taq, polimerase Taq e água conforme descrito na Tabela 4 e adicione 11,5 μL da mistura a cada tubo contendo cDNA.</li>
	<li>Execute o PCR utilizando um cicloviário térmico com uma etapa inicial de desnaturação a 94 °C por 3 min; seguido por 20 ciclos de desnaturação (94 °C para 30 s), ressarnamento (65 °C para 30 s) e extensão (72 °C para 15 s), e uma etapa de término a 72 °C por 5 min.</li>
	<li>Adicione 12,5 μL de 2x de corante de carregamento de DNA formamida a cada tubo e aqueça a 95 °C por 5 min.</li>
	<li>Armazene a reação do PCR a -20 °C ou proceda com ureia-PAGE conforme descrito abaixo na Etapa 8.1-8.4.</li>
	<li>Após a eletroforese, remova as placas de vidro do aparelho de eletroforese e escaneie usando um imager de fluorescência para visualizar o gel.</li>
	<li>Realize a varredura densitométrica da imagem do gel e use a intensidade da banda dos produtos incluídos e os produtos ignorados para calcular a porcentagem de inclusão do exon 2, conforme descrito na Etapa 4.8.</li>
</ol>6. Análise da variante U1 expressão snRNA por extensão de primer
<ol><li>Adicione 2,0 μg de RNA extraído das células Hela em tubos separados de microcentrífugo de 200 μL e adicione água livre de RNase para compensar o volume a 4.325 μL e, em seguida, adicione dATP, como mostrado na Tabela 5.</li>
	<li>Adicione 10.000 CPM do oligonucleotídeo 32P-U17-26-R a cada tubo. NOTA: Para preparar uma solução de 10.000 cpm/μL de 32P-U17-26-R (a partir do passo 3), diluir o oligonucleotídeo rotulado (diluição 1:20), determinar cpm em 1,0 μL usando um contador de cintilação, e diluir ainda mais com água deionizada para preparar uma solução de 10.000 cpm/μL em um novo tubo de microcentrifuge de 1,5 mL.</li>
	<li>Incubar a 65 °C por 5 min, e depois no gelo por 1 min.</li>
	<li>Prepare uma mistura mestre com 5x First Strand Buffer, inibidor de RNase, DTT e transcriptase reversa, como mostrado na Tabela 5 e adicione 1,8 μL da mistura a cada amostra.</li>
	<li>Incubar, primeiro na RT por 10 min e depois a 42 °C por 10 min.</li>
	<li>Após a incubação, adicione 10 μL de 2x de corante de carregamento de RNA formamida em cada amostra e armazene em uma caixa de acrílico a -20 °C ou proceda com a separação de fragmentos por ureia-PAGE usando um gel de 38 cm de comprimento (ver Passo 8).</li>
</ol>7. Análise da variante U1 expressão snRNA por RT-qPCR
<ol><li>Diluir o estoque de cDNA preparado como descrito acima nas Etapas 5.1 - 5.4 para uma concentração de 0,2 ng/μL.</li>
	<li>Pipeta 5,0 μL de cDNA diluída em poços individuais de uma placa qPCR de 96 poços em triplicado. Adicione água deionizada em vez de cDNA para controle sem modelo (NTC).</li>
	<li>Prepare duas misturas de primer separadas que consistem nos primers dianteiros e invertidos para snRNAs U1 e U2, e água como mostrado na Tabela 6. NOTA: As sequências para primers específicos de SnRNA U1 e U2 são fornecidas na Tabela 7.</li>
	<li>Adicione 5,0 μL da mistura de primer U1 e U2 snRNA à amostra e aos poços NTC.</li>
	<li>Adicione 10,0 μL de mix pcr em tempo real a cada poço.</li>
	<li>Sele as placas com uma película óptica, depois centrífuga a 1.000 x g por 2 min no RT para coletar as reações ao fundo dos poços.</li>
	<li>Realize qPCR com uma etapa inicial de desnaturação a 95 °C por 10 min, seguido por 40 ciclos de um protocolo de 2 etapas consistindo em denaturação (95 °C para 15 s) e ressarem/extensão (62 °C para 60 s) enquanto coletam os valores do ciclo de quantificação limiar (Cq) de amplicons-alvo.</li>
	<li>Termine a reação qPCR verificando um único pico na curva de dissociação para reações de snRNA U1 e U2.</li>
	<li>A partir dos valores Cq, calcule delta Cq (ΔCq) para U1 e U2 snRNAs em comparação com o controle pcDNA.</li>
	<li>Determine a variante U1 expressão de snRNA como quantidade relativa (RQ) de U1 em comparação com u2 usando o valor ΔΔCq como mostrado abaixo para todas as amostras. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63014/63014eq02.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63014/63014eq03.jpg"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/63014/63014eq04.jpg">
</li>
</ol>8. Configuração e execução de géis Urea-PAGE
NOTA: A montagem das placas de vidro e o aparelho de funcionamento do gel devem ser executados de acordo com as instruções do fabricante. O fundição do gel de 10% de ureia-PAGE pode ser realizado de acordo com um protocolo descrito anteriormente por Summer et al.10. As etapas que envolvem a preparação de marcadores e amostras, e de corrida e visualização de géis são descritas abaixo. Opcionalmente, para evitar que o gel grude em placas de vidro, a superfície interna pode ser revestida com solução de silicone adicionando 1 mL da solução sobre a superfície e se espalhando uniformemente por toda a superfície com tecido. Uma vez secas, as placas devem ser lavadas com água deionizada e secas novamente.
ATENÇÃO: A crilamida não despolumerizada é neurotóxica e deve ser tratada com proteções recomendadas na ficha técnica de segurança do material.
<ol><li>Prepare as amostras de extensão e marcadores do primer aquecendo a 95 °C por 5 min e, em seguida, centrifugando em uma microcentrifuagem de mesa a 3.000 x g para 5 s em RT.</li>
	<li>Antes de carregar os marcadores e amostras, limpe os poços com 1x tampão TBE para remover a ureia assentada.</li>
	<li>Carregue 10 μL/amostra/bem e execute o gel a 300-500V por 2-3 horas ou até que o cianol de xileno chegue ao fundo. NOTA: Cerca de 1.000 cpm do marcador 32P pode ser carregado.</li>
	<li>Após a eletroforese, remova as placas de vidro do aparelho de eletroforese.</li>
	<li>Separe cuidadosamente as duas placas para que o gel fique liso em qualquer superfície de vidro e transfira o gel para um papel filtro e cubra-o com plástico.</li>
	<li>A vácuo seque o gel no papel do filtro a 80 °C por 30 minutos usando uma secadora de gel.</li>
	<li>Coloque o gel seco em um de imagem fosfor e mantenha no RT durante a noite. NOTA: A tela do fósforo deve ser apagada usando uma caixa de luz antes de ser usada.</li>
	<li>Para visualizar a imagem em gel, remova a tela e digitalize usando um imager de fósforo.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O ensaio pode ser adaptado para análise de emendas em linhas celulares diferentes de HeLa, no entanto, fatores que afetam a eficiência da transfecção, como a confluência celular e a quantidade de DNA podem precisar ser otimizados. A proporção de construção repórter para U1 é outro parâmetro crítico que pode precisar ser determinado dependendo dos níveis de expressão observados em outros tipos de células. A qualidade do RNA extraído é fundamental para a análise de emendas; portanto, o uso de água sem RNase e descontaminaç...

O emenda pré-mRNA é uma etapa essencial de processamento que remove introns não codificantes e ligantes precisamente exons de codificação para formar mRNA maduro. Reconhecimento de sequências de consenso em junções exon-intron, referidas como local de 5'-emendas e 3'-splices, por componentes do maquinário de emenda inicia o processo de emenda. A pequena ribonucleoproteína nuclear U1 (snRNP) reconhece o local de 5'-splice por emparelhamento base do SnRNA U1 com o pré-mRNA1. Mutações geneticamente herdadas que alteram sequências de 5'emendas estão associadas a muitas doenças2,3. Prevê-se que a perda da base de snRNA U1 com os sites mutantes de 5'-emendas causa emenda aberrante, o que pode comprometer a tradução da transcrição afetada. Uma abordagem terapêutica potencial para corrigir os defeitos de emenda envolve a supressão de mutações por snRNA U1 modificado carregando alterações de nucleotídeos compensatórios em sua região de 5′que baseiam-se com o local de 5'-splice. Tais SnRNAs modificadas, também referidas como exon específicas U1 snRNAs, têm sido consideradas eficazes na reversão de defeitos de emenda, resultando em aumento da expressão proteica do mRNA4, 5,6,7,8 resgatados.
Aqui, descrevemos o ensaio de complementação do U1 snRNP, um ensaio de emenda celular baseado em repórter que permite a avaliação do efeito das mutações de 5's na emenda de um exon e também pode ser usado para o desenvolvimento de SnRNAs U1 modificadas para permitir o resgate da inclusão exon. Também fornecemos protocolos para monitoramento das transcrições de repórteres emendadas por extensão primer e RT-PCR, e para determinar a expressão de SNRNAs U1 modificadas por extensão primer e RT-qPCR.

<table><tbody><tr><td>Água Deionizada de Grau Reagente</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23-751628</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) pacote de pó</td><td>Gibco</td><td>12100-046</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de Sódio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS), Fonte Australiana, Inativado por Calor</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-22</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (P / S)</td> <td>Hidróxido de Sódio Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100ML</td><td></td></tr><tr><td>, Solução Padrão 1.0N</td> Ácido clorídrico <td>Sigma-Aldrich</td><td>S2567-16A</td><td></td></tr><tr><td>, certificado ACS Plus, 36.5 a 38.0%</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>Filtros superiores de garrafas PES descartáveis</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FB12566510</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Sal Dissódico Di-hidratado</td><td>Amresco</td><td>0105-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>2.5% Tripsina (10x), sem fenol vermelho</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio</td><td>Fisher Bioreagente</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Potássio</td><td>Fisher Bioreagente</td><td>BP366-1</td><td></td></tr><tr><td>Dissódico Fosfato de hidrogênio Heptahidratado</td><td>Fisher Bioreagente</td><td>BP332-1</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de di-hidrogênio de potássio</td><td>Bioreagente</td><td>Fisher BP362-1</td><td></td></tr><tr><td>Meio de transfecção - Opti-MEM&trade; I Meio de Soro Reduzido, sem fenol vermelho</td> Reagente de Transfecção <td>11058021</td><td></td>da <td>ThermoFisher Scientific</td></tr><tr><td>- Lipofectamine&trade; 2000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol&trade; Reagente</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio (Aprox. 0,75% de Etanol como Conservante/Biologia Molecular)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, Absoluto (200 Provas), Grau de Biologia Molecular, Fisher BioReagents</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol, Grau de Biologia Molecular, Fisher BioReagents</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP2618-212</td><td></td></tr><tr><td>Glicogênio (5 mg/ml)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>Kit Miniprep de RNA Direto-zol</td><td>Zymo Research</td><td>R2052</td><td></td></tr><tr><td>ATP, [&gamma;-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml Chumbo, 1 mCi</td><td>PerkinElmer</td><td>NEG035C001MC</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polinucleotídeo Quinase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>Exclusão de tamanho beands - Sephadex&reg; G-25</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2580-10G</td><td></td></tr><tr><td>Exclusão de tamanho mini colunas</td><td>USA Scientific</td><td>1415-0600</td><td></td></tr><tr><td>pBR322 DNA-MspI Digest</td><td>New England Biolabs</td><td>N3032S</td><td></td></tr><tr><td>Marcador de Baixo Peso Molecular, 10-100 nt</td><td>Affymetrix</td><td>76410 100 UL</td><td></td></tr><tr><td>Reagentes inativadores de Rnase - RNaseZAP&trade;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2020-250ML</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mix (10 mM cada)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18427013</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT&trade; Inibidor de Ribonuclease Recombinante</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>Transcriptase Reversa - M-MLV Transcriptase Reversa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28025013</td><td>usado para extensão de primer</td></tr><tr><td>Taq DNA Polimerase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10342020</td><td></td></tr><tr><td>Random Hexamers (50 &micro; M)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>N8080127</td><td></td></tr><tr><td>Mistura de PCR em tempo real - SYBR&trade; Selecione Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4472903</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript&trade; III Transcriptase Reversa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080093</td><td>usado para preparação de cDNA</td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080093</td><td></td></tr><tr><td>5X First-Strand Buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080093</td><td></td></tr><tr><td>Formamida (&ge; 99,5%)</td><td>Revisão ThermoFisher Scientific</td><td>BP228-100</td><td>Fichas de Dados de Segurança do Material Sal</td></tr><tr><td>de sódio azul de bromofenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114405-5G</td><td></td></tr><tr><td>Xileno Cianol FF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2650-17-1</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris (Cristais Brancos ou Pó Cristalino/Biologia Molecular)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Bórico (Cristalino/ Eletroforese)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP168-500</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida: Bis-Acrilamida 19:1 (40% Solução/Eletroforese)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP1406-1</td><td>Revisão Fichas de Dados de Segurança do Material</td></tr><tr><td>Ureia (Cristais Incolores a Brancos ou Pó Cristalino/Mol. Biol.)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP169-212</td><td></td></tr><tr><td>Peroxodissulfato de amônio (APS) &ge; 98%, Pró-Puro, Grau Proteômico</td><td>VWR</td><td>M133-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-100ML</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tetrametiletilenodiamina (TEMED) &ge; 99%, Ultrapure</td><td>VWR</td><td>0761-25ML</td><td>Revisão de Fichas de Dados de Segurança de Material</td></tr><tr><td>Sistemas de Gel de Placa Ajustável, Expedeon</td><td>VWR</td><td>ASG-400</td><td></td></tr><tr><td>Vertical Gel Wrap&trade; Conjuntos de Placas de Vidro, 16.5 x 14.5cm</td><td>VWR</td><td>NGP-125NR</td><td></td></tr><tr><td>Vertical Gel Wrap&trade; Conjuntos de Placas de Vidro, 16.5 x 22.0cm</td><td>VWR</td><td>NGP-200NR</td><td></td></tr><tr><td>Vertical Gel Wrap&trade; Conjuntos de Placas de Vidro, 16.5 x 38.7cm</td><td>VWR</td><td>NGP-400NR</td><td></td></tr><tr><td>GE Telas de Armazenamento de Fósforo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE28-9564</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon&trade; FLA 7000 Imager Biomolecular</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9610-73 AB</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter LS6500 Contador de Cintilação Líquida</td><td>GMI</td><td>8043-30-1194</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Termociclador</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 Flex Sistemas de PCR em Tempo Real</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

um ensaio celular baseado em repórter para monitorar a eficiência do splicing

A Reporter Based Cellular Assay for Monitoring Splicing Efficiency

Durante a expressão genética, o passo vital da emenda pré-mRNA envolve o reconhecimento preciso de locais de emenda e a montagem eficiente de complexos emendas omais para unir exons e remover introns antes da exportação citoplasmática do mRNA maduro. A eficiência do splicing pode ser alterada pela presença de mutações em locais de emenda, pela influência de fatores de emenda trans-ação ou pela atividade terapêutica. Aqui, descrevemos o protocolo para um ensaio celular que pode ser aplicado para monitorar a eficiência de emenda de qualquer exon dado. O ensaio usa um plasmídeo adaptável codificado 3-exon/2-intron minigene reporter, que pode ser expresso em células de mamíferos por transfecção transitória. Após a transfecção, o RNA celular total é isolado, e a eficiência do splicing de exon no mRNA repórter é determinada por extensão de primer ou reação em cadeia de transcriptase-polimerase reversa semi-quantitativa (RT-PCR). Descrevemos como o impacto das mutações associadas à doença de 5′ podem ser determinados introduzindo-as no repórter; e como a supressão dessas mutações pode ser alcançada por co-transfecção com u1 pequeno RNA nuclear (snRNA) construir carregando mutações compensatórias em sua região de 5′ que baseiam-se com os 5'-splices em junções exon-intron em pré-mRNAs. Assim, o repórter pode ser usado para o desenho de partículas U1 terapêuticas para melhorar o reconhecimento de locais de emenda mutantes de 5′. A inserção de sites regulatórios de ação cis, como emendar melhorador ou sequências silenciadores, no repórter também pode ser usada para examinar o papel do U1 snRNP na regulação mediada por um fator alternativo específico de emenda. Finalmente, as células expressas por repórteres podem ser incubadas com pequenas moléculas para determinar o efeito de potenciais terapêuticas na emenda pré-mRNA constitutiva ou em exons que carregam locais de emenda mutantes de 5′. No geral, o ensaio do repórter pode ser aplicado para monitorar a eficiência do splicing em uma variedade de condições para estudar mecanismos fundamentais de emenda e doenças associadas à emenda.

O repórter dup51, um minigene de três exon-dois intron, foi derivado do gene humano β-globina e foi descrito anteriormente (Figura 1A)11,12 . Criamos um repórter mutante, Dup51p, introduzindo mutações associadas à síndrome de Usher de 5'-splices que ocorrem no exon 3 do gene protocadherin 15 (PCDH15). A sequência do local de 5'-splice na junção exon 2-intron 2 foi alterada de CAG/GUUGGUAUC para AUG/GU...

Este protocolo descreve um ensaio de repórter minigene para monitorar o impacto de mutações de 5'-splices no splicing e desenvolve snRNA supressor U1 para o resgate da inibição de emenda induzida por mutação. As construções de snRNA do repórter e supressor U1 são expressas em células HeLa, e o splicing é analisado por extensão de primer ou RT-PCR.

Um ensaio celular baseado em repórter para monitorar a eficiência do splicing

During gene expression, the vital step of pre-mRNA splicing involves accurate recognition of splice sites and efficient assembly of spliceosomal complexes ...

Este protocolo descreve um ensaio celular para monitorar a eficiência do splicing, usando um repórter gerenciador adaptável. Este repórter Assay pode ser usado para estudar os efeitos da doença Mutações associadas nos locais da Exxon ou emendas, e para projetar terapia, em particular uma das partículas, para melhorar o reconhecimento de locais de emenda mutante a cinco pontos. A passagem nas células Hela aspira o meio gasto e incuba as células com três mililitros de 0,2 5% de viagens contendo um EDTA milimola, a 37 graus Celsius por três minutos.Após a incubação em sete mililitros de DMEM frescos e transfira a suspensão celular para um tubo de 10 mililitros. Centrifugar as células. Em seguida, resuspenque a pelota celular em 10 mililitros de DMEM fresco, e plaque as células em um novo prato de cultura tecidual em 20% de confluência, para transsfecção transitória.Conte as células hela com um slide de citómetro hemo limpo e prepare uma suspensão com uma densidade de 2,5 vezes 10 para as quintas células por mililitro, semente um mililitro da suspensão celular em cada poço de uma placa de 12 poços e incubar durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte aspirar o meio gasto e adicionar 800 microliters de DMEM fresco com soro à placa. Prepare as misturas de transfecção e o vórtice por 15 segundos.Em seguida, centrifufique as misturas e incuba-as à temperatura ambiente por cinco minutos. Após a incubação adicione todos os 200 microliters da transfecção misture em um poço da placa de 12 bem helacelular para alcançar um volume final de um mililitro por poço, e incubar a placa a 37 graus Celsius por 48 horas. As reações de rotulagem preparadas estão incubando.Resuspend os 25 quilos Dalton molecular peso corte de peso de exclusão de tamanho por vórtice suave por 10 segundos. Em seguida, transfira 600 microliters das contas resuspended para uma mini coluna descartável, colocado em um tubo de coleta de 1,5 mililitro, e devolva o estoque de contas para quatro graus Celsius. Centrifugar a coluna e descartar o fluxo através delas.Em seguida, lave as contas duas vezes adicionando 300 microliters de RNA água livre à coluna. Após a segunda lavagem, transfira a mini coluna para um novo tubo de centrífugas de 1,5 mililitro e adicione a mistura de reação de quinase à coluna. Centrifugar a coluna e coletar o fluxo contendo os oligonucleotídeos rotulados P32.Adicione dois microgramas de RNA extraídos das células heli em tubos de microclamagem microlitra e adicione água livre de RNA para compor o volume a 6,55 microliters. Em seguida, adicione 0,9 microliters uma mistura mestre a cada tubo PCR contendo as amostras de RNA, e incubar os tubos primeiro a 65 graus Celsius por cinco minutos, e depois no gelo por um minuto. Em seguida, às 2,55 microliters, uma mistura mestre dois, em cada tubo contendo o RNA e master mix um, e incubar os tubos em temperatura ambiente por 10 minutos.Após a incubação, transfira os tubos para um cicloviário térmico e incuba primeiro a 50 graus Celsius por 60 minutos, e depois a 70 graus Celsius, por 15 minutos. Após a incubação, adicione 10 microliters de 2X rna de carregamento de RNA a cada amostra e prossiga para separar os fragmentos por página UIA. Síntese de DNA do Percy.Adicione dois microgramas de RNA extraídos das células de hela transectadas, em tubos de microncentrifuge de 200 microniliteres e adicione água livre de RNAs para compor o volume a 11 microlitrais baixos. Em seguida, adicione dois microliters, uma mistura mestre uma para cada amostra e incubar primeiro a 65 graus Celsius por cinco minutos, depois no gelo por um minuto. Em seguida, adicione sete microliters, uma mistura mestre dois em cada tubo e incubar os tubos à temperatura ambiente por 10 minutos, seguido de incubação a 50 graus Celsius por 60 minutos e 70 graus Celsius por 15 minutos.Em seguida, para PCR diluir a reação de DNA C para produzir uma concentração de 100 nanogramas por microliter, e transferir um microliter de cada amostra de CDNA para novos tubos PCR. Adicione 10,5 microliters da mistura mestre a cada tubo contendo CDNA e realize o PCR. Usando um termociclador depois que o PCR estiver completo.Adicione 12,5 microliters de 2X de DNA formamida carregando corante em cada tubo. Aqueça as amostras a 95 graus Celsius por cinco minutos e prossiga para realizar uma página UIA. Pipeta cinco microliters de CDNA diluída em poços individuais de uma placa qpcr de 96 poços triplicado.Em seguida, adicione 10 microliters de mistura PCR em tempo real a cada poço, sele as placas com uma película óptica e centrífuga para coletar as reações à parte inferior dos Poços, em seguida, execute o qpcr enquanto coleta os valores do ciclo de quantificação limiar de amplicon alvo. Antes de carregar os marcadores e amostras, limpe os Poços com tampão TBE para remover a ureia assentada. Em seguida, carregue 10 microlitres de cada amostra por poço e execute o gel a 300 a 500 volts por duas a três horas, ou até que o xileno chegue ao fundo.Depois de a eletroforese remover as placas de vidro do aparelho de eletroforese e separar cuidadosamente as duas placas para que o gel fique plano em qualquer superfície de vidro, em seguida, transfira o gel para um papel filtro e cubra-o com um plástico, usando um vácuo secador de gel secar o gel a 80 graus Celsius por 30 minutos, em seguida, coloque o gel seco em um de imagem fosfor para incubação durante a noite em temperatura ambiente. Quando expresso em células hela, o repórter de corte dup 51 minnijean expressa a transcrição completa madura em que a Exxon dois é emendada eficientemente. As cinco mutações principais do site de emendas e dup 51 P reduzem a inclusão da Exxon de 95 a 30% levando à formação de uma transcrição mais curta.Co-expressão do DUP 51 P com U15A SNRNA resgata a Exxon por dois emendas, e restaura a formação da transcrição completa. Em contraste, a co-expressão com variante u1 ou U15G selvagem não tem o efeito semelhante na emenda dup 51P. A detecção de transcrições variantes U15A, por extensão primária, usa o nucleotídeo de Oligo U1 de 7 a 26, que tem 20 nucleotídeos de comprimento e pares de base perto da adenina na quinta posição do U1 SNRNA.Somente na presença de DATP, u17 a 26 permite incorporar dois a três nucleotídeos para o tipo selvagem endógeno U1 SNRNA produzindo um produto de 22 ou 23 nucleotídeos longos. Para as variantes U15A e U15G termina após a adição de uma única adenosina produzindo um produto nucleotídeo de 21. Após a normalização da expressão U2 SNRNA, as variantes U1 5g e U15A foram expressas em três a cinco dobras sobre o SNRNA endógeno.A qualidade do RNA extraído é fundamental para a análise de emendas. Portanto, o uso de água livre de RNA e descontaminação de serviços com agentes inativados rnas é altamente recomendado. O sistema de relatórios descrito aqui pode ser aplicado para estudar o papel do U1 SN RNAs na regulamentação de emenda para reverter o efeito de mutações de emenda de preço flash para silenciamento genético usando rnas U1SN modificados.

a-reporter-based-cellular-assay-for-monitoring-splicing-efficiency

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Um protocolo para a preparação de robusta, extratos de pequena escala HeLa nucleares é descrito. Este protocolo é valiosa para os ensaios que requerem o uso de pequenas populações de células, tais como as células tratadas com fármacos ou RNAi. O método deve ser aplicável a uma ampla variedade de ensaios de expressão génica e outros tipos celulares, incluindo células do paciente.

Os pequenos extratos nucleares para ensaios funcionais da expressão gênica Machineries

A regulação alternativa do splicing demonstrou contribuir para a transição epitelial-mesenquimal (EMT), um programa celular essencial em vários processos fisiológicos e patológicos. Aqui descrevemos um método utilizando um modelo EMT induzível para a detecção de splicing alternativo durante EMT.

Detecção de splicing alternativo Durante epitelial-mesenquimal Transição

Os eventos de splicing em tandem ocorrem em locais separados por menos de 12 nucleotídeos. A quantificação das proporções de tais variantes de splice é viável usando uma abordagem de PCR quantitativa absoluta. Este manuscrito descreve como as variantes de splice do gene STAT3, nas quais dois eventos de splicing resultam na inclusão/exclusão de Serine-701 e α/β C-termin, podem ser quantificadas.

Mesclando Absoluto e dados relativos PCR quantitativo para quantificar STAT3 Splice Variant Transcrições

Aqui nós descrevemos um protocolo teve como objetivo investigar o impacto do splicing aberrante na resistência aos medicamentos em tumores sólidos e doenças malignas hematológicas. Para este objetivo, foram analisados os perfis transcriptomic de modelos parentais e resistentes in vitro através de RNA-seq e estabeleceu um método baseado qRT-PCR para validar genes candidatos.

Usando RNA-sequenciação para detectar Novel Splice variantes relacionadas à resistência aos medicamentos em<em&gt; In Vitro</em&gt; modelos de cancro

É descrito um em situ protocolo de hibridação (ISH) que usa oligonucleotides antisentidos curtos para detectar padrões de splicing alternativo pre-mRNA nas seções de cérebro de rato.

Análise quantitativa de alternativo Pre-mRNA emendar nas seções de cérebro de rato usando o RNA In Situ da hibridação do ensaio

SINEUPs são sintéticas antisentido não-codificantes RNAs, que contêm um domínio de ligação (BD) e um domínio efetor (ED) e up-regulam a tradução do mRNA de destino. Aqui, descrevemos os métodos de deteção para SINEUPs em linhas de células cultivadas, análise de sua atividade de tradução-promoção por Western-blot e um alto throughput semi-automático, sistema de imagem.

Célula com base em ensaios de SINEUP não-codificante RNAs que especificamente podem melhorar a tradução de mRNA

Este protocolo apresenta uma ferramenta rápida e útil para avaliar o papel de uma proteína com função não caracterizada na regulação alternativa de emenda após o tratamento quimioterápico.

Usando a ferramenta E1A Minigene para estudar alterações de emenda mRNA

O ensaio ACT1-CUP1, um ensaio de crescimento de cobre, fornece uma leitura rápida do splicing de RNA mensageiro precursor (pré-mRNA) e do impacto que os fatores de splicing mutantes têm na função spliceossomal. Este estudo fornece um protocolo e destaca a personalização possível para abordar a questão do splicing de interesse.

Ensaios de ACT1-CUP1 determinam as sensibilidades específicas do substrato de mutantes spliceossomais em leveduras em brotamento

Desenvolvemos um ensaio de repórter de biogênese intrônica para ser usado em células in vitro com quatro plasmídeos: um com miRNA intrônico, um com o alvo, um para superexpressar uma proteína regulatória, e outro para a luciferase renilla. O miRNA foi processado e pôde controlar a expressão da luciferase ligando-se à sequência de alvos.

Um ensaio repórter para analisar a maturação intronic microRNA em células mamíferas

Apresentamos protocolos para a avaliação da proficiência da via de reparo de quebra de fita dupla em células usando um conjunto de substratos repórteres extracromossômicos baseados em luminescência.

Avaliação da atividade de reparo de quebra de fita dupla de DNA usando ensaios repórter de alto rendimento e quantitativos baseados em luminescência

Aprenda a monitorar a eficiência do splicing em células HeLa usando um ensaio com repórter minigene adaptável. Este método permite estudar mutações associadas a doenças e desenvolver estratégias terapêuticas com U1 snRNA supressor.

Um ensaio celular baseado em repórter para monitorar a eficiência do splicing

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