Name: Preparação da amostra usando um método de monocamadas lipídica para estudos cristalográficos eletrônicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 22 s
Description: Aprenda a preparar monocamadas lipídicas para cristalização bidimensional de proteínas periféricas e solúveis em biologia estrutural. Este método facilita estudos de imagem por microscopia eletrônica de crio.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

A preparação deste manuscrito foi parcialmente apoiada pelo Escritório de Pesquisa do Exército dos EUA (W911NF2010321) e fundos de inicialização da Universidade Estadual do Arizona para p.-L.C.

1. Preparação do bloco de Teflon
<ol><li>Prepare o bloco de Teflon a partir de resina PTFE resistente a produtos químicos (politetrafluoroetileno). Faça furos no bloco usando uma broca geral seguida pelas dimensões rotuladas na Figura 1.</li>
</ol>2. Preparação lipídica de monocamadas
NOTA: Tempo estimado de funcionamento: 30-45 minutos
<ol><li>Preparação de estoque lipídida<ol>
<li>Prepare uma mistura lipídica de 0,01 mg/mL em 9:1 (v/v) clorofórmio/metanol usando 8,91 mL de clorofórmio, 0,99 mL de metanol e 0,01 mL de lipídios de 10 mg/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação da placa de Teflon<ol>
<li>Sonicate uma placa de Teflon em um banho de metanol por 5 minutos.</li>
		<li>Lave com água quente por 15 minutos.</li>
		<li>Enxágüe com água destilada.</li>
		<li>Seque a placa de Teflon em um dessecador por 30 minutos e mantenha-a sob vácuo quando não estiver em uso(Figura 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Formação de monocamide lipídica no reservatório tampão
NOTA: Tempo estimado de funcionamento: 1,5 horas
<ol><li>Prepare recentemente uma mistura lipídica de 0,01 mg/mL em uma mistura de clorofórmio/metanol no dia do experimento.</li>
	<li>Coloque um papel filtro Tipo-1 em uma placa de Petri e organize o bloco Teflon em cima do papel filtro.</li>
	<li>Encha os poços da placa Teflon com 60 μL do buffer.</li>
	<li>Adicione cuidadosamente a mistura lipídica em cima da superfície tampão gota a gota (idealmente 1 μL por gota) usando uma seringa Hamilton.</li>
	<li>Molhe o papel filtro com água destilada para manter a umidade na placa de Petri.</li>
	<li>Incubar em temperatura ambiente por 60 minutos. O clorofórmio deve evaporar, e uma monocamada de lipídio na superfície do tampão deve ser formada.</li>
</ol>4. Aplicação de uma grade EM em uma monocamadas lipídica
NOTA: Tempo estimado de funcionamento: 1,5 horas
<ol><li>Coloque suavemente uma grade EM revestida de carbono furada sem descarregamento de brilho, lado carbono para baixo, no topo de cada reservatório tampão.</li>
	<li>Injete cuidadosamente proteínas na injeção lateral. Use concentrações proteicas finais no poço em torno de 1 μM de proteína como ponto de partida. Pré-otimizar a concentração de proteínas antes do experimento.</li>
	<li>Incubar por 60 minutos em temperatura ambiente.</li>
	<li>Injete suavemente aproximadamente 20-30 μL de tampão na porta de injeção lateral. Isso levantará a grade acima da superfície do bloco Teflon.</li>
	<li>Pegue imediatamente a grade com uma pinça e levante-a verticalmente da gota.</li>
	<li>Prepare amostras de monocamadas para coloração negativa ou imagen crio-TEM(Figura 2). Se as proteínas formarem uma matriz 2D, o espectro de energia de imagem ou o periodograma Fourier mostrarão intensidades de difração nas frequências espaciais com base na simetria cristalina. Se não forem mostrados pontos de difração no espectro de energia, é improvável que as proteínas formem um cristal 2D.</li>
	<li>Verifique a cobertura da monocameira lipídica na grade EM usando um microscópio eletrônico de transmissão (TEM). Uma imagem de elétrons mais amplieada é útil para identificar a morfologia da monocamada coberta. Normalmente, o contraste de imagem da área coberta por monocamadas será ligeiramente menor do que o das áreas descobertas. Além disso, o espectro de energia de imagem 2D computado ajudará a identificar a localização do cristalino 2D.</li>
</ol>

<ol><li>Raunser, S., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+crystallography+as+a+technique+to+study+the+structure+on+membrane+proteins+in+a+lipidic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Electron crystallography as a technique to study the structure on membrane proteins in a lipidic environment.</a> Annual Review of Biophysics. 38 (1), 89-105 (2009).</li>
<li>Avila-Sakar, A. J., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+beta-sheets+and+side-chain+clusters+in+two-dimensional+periodic+arrays+of+streptavidin+on+phospholipid+monolayers+by+electron+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Visualization of beta-sheets and side-chain clusters in two-dimensional periodic arrays of streptavidin on phospholipid monolayers by electron crystallography.</a> Biophysical Journal. 70 (1), 57-68 (1996).</li>
<li>Braun, T., Engel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+electron+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Encyclopedia+of+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional electron crystallography.</a> Nature Encyclopedia of Life Sciences. , (2004).</li>
<li>Wang, H. -W., Wang, J. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+cryo-electron+microscopy+and+X-ray+crystallography+complement+each+other%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%3A+a+publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">How cryo-electron microscopy and X-ray crystallography complement each other.</a> Protein Science: a publication of the Protein Society. 26 (1), 32-39 (2017).</li>
<li>Williams, D. B., Carter, C. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilliams%2C+DB+%22Transmission+electron+microscopy%22">Transmission electron microscopy</a>. , Springer. New York, NY. (2016).</li>
<li>Abeyrathne, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1.15+Analysis+of+2-D+Crystals+of+Membrane+Proteins+by+Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Biophysics%22%5BJournal%5D)">1.15 Analysis of 2-D Crystals of Membrane Proteins by Electron Microscopy.</a> Comprehensive Biophysics. , 277-310 (2012).</li>
<li>Muller, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Lipid-Protein+Interactions+and+Lipid-Mediated+Modulation+of+Membrane+Protein+Function+through+Molecular+Simulation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Characterization of Lipid-Protein Interactions and Lipid-Mediated Modulation of Membrane Protein Function through Molecular Simulation.</a> Chemical Reviews. 119 (9), 6086-6161 (2019).</li>
<li>Martínez-Ballesta, M. D. C., Carvajal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutual+Interactions+between+Aquaporins+and+Membrane+Components%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Mutual Interactions between Aquaporins and Membrane Components.</a> Frontiers in Plant Science. 7, 1322(2016).</li>
<li>Hite, R. K., Chiu, P. -L., Schuller, J. M., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+lipid+head+groups+on+double-layered+two-dimensional+crystals+formed+by+aquaporin-0%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Effect of lipid head groups on double-layered two-dimensional crystals formed by aquaporin-0.</a> PloS One. 10 (1), 0117371(2015).</li>
<li>Murata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+determinants+of+water+permeation+through+aquaporin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural determinants of water permeation through aquaporin-1.</a> Nature. 407 (6804), 599-605 (2000).</li>
<li>Schenk, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+4.5+A+structure+of+human+AQP2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The 4.5 A structure of human AQP2.</a> Journal of Molecular Biology. 350 (2), 278-289 (2005).</li>
<li>Gonen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-protein+interactions+in+double-layered+two-dimensional+AQP0+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals.</a> Nature. 438 (7068), 633-638 (2005).</li>
<li>Hiroaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+the+aquaporin-4+structure+on+array+formation+and+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Implications of the aquaporin-4 structure on array formation and cell adhesion.</a> Journal of Molecular Biology. 355 (4), 628-639 (2006).</li>
<li>Gonen, T., Sliz, P., Kistler, J., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-0+membrane+junctions+reveal+the+structure+of+a+closed+water+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-0 membrane junctions reveal the structure of a closed water pore.</a> Nature. 429 (6988), 193-197 (2004).</li>
<li>Chiu, P. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+prokaryotic+cyclic+nucleotide-modulated+potassium+channel+MloK1+at+16+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">The structure of the prokaryotic cyclic nucleotide-modulated potassium channel MloK1 at 16 A resolution.</a> Structure. 15 (9), 1053-1064 (2007).</li>
<li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-induced+structural+changes+in+the+cyclic+nucleotide-modulated+potassium+channel+MloK1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Ligand-induced structural changes in the cyclic nucleotide-modulated potassium channel MloK1.</a> Nature Communications. 5, 3106(2014).</li>
<li>Walz, T., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+Crystallography+of+Two-Dimensional+Crystals+of+Membrane+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron Crystallography of Two-Dimensional Crystals of Membrane Proteins.</a> Journal of Structural Biology. 121 (2), 142-161 (1998).</li>
<li>Yeager, M., Dryden, K. A., Ganser-Pornillos, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+monolayer+and+sparse+matrix+screening+for+growing+two-dimensional+crystals+for+electron+crystallography%3A+methods+and+examples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Lipid monolayer and sparse matrix screening for growing two-dimensional crystals for electron crystallography: methods and examples.</a> Methods in Molecular Biology. 955, 527-537 (2013).</li>
<li>Pal, S. Chapter 6 - Structure analysis and visualization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPal%2C+S+%22Fundamentals+of+Molecular+Structural+Biology%22">Fundamentals of Molecular Structural Biology</a>. , 119-147 (2020).</li>
<li>Frey, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+protein+crystallization+via+metal-ion+coordination+by+naturally+occurring+surface+histidines%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional protein crystallization via metal-ion coordination by naturally occurring surface histidines.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4937-4941 (1996).</li>
<li>Kubalek, E. W., Le Grice, S. F., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+crystallization+of+histidine-tagged%2C+HIV-1+reverse+transcriptase+promoted+by+a+novel+nickel-chelating+lipid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional crystallization of histidine-tagged, HIV-1 reverse transcriptase promoted by a novel nickel-chelating lipid.</a> Journal of Structural Biology. 113 (2), 117-123 (1994).</li>
<li>Vénien-Bryan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+study+of+the+response+regulator+HupR+from+Rhodobacter+capsulatus.+Electron+microscopy+of+two-dimensional+crystals+on+a+nickel-chelating+lipid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural study of the response regulator HupR from Rhodobacter capsulatus. Electron microscopy of two-dimensional crystals on a nickel-chelating lipid.</a> Journal of Molecular Biology. 274 (5), 687-692 (1997).</li>
<li>Merritt, E. A., Sarfaty, S., vanden Akker, F., L'Hoir, C., Martial, J. A., Hol, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+cholera+toxin+B-pentamer+bound+to+receptor+GM1+pentasaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%3A+a+publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of cholera toxin B-pentamer bound to receptor GM1 pentasaccharide.</a> Protein Science: a publication of the Protein Society. 3 (2), 166-175 (1994).</li>
<li>Mosser, G., Mallouh, V., Brisson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+9+A+two-dimensional+projected+structure+of+cholera+toxin+B-subunit-GM1+complexes+determined+by+electron+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A 9 A two-dimensional projected structure of cholera toxin B-subunit-GM1 complexes determined by electron crystallography.</a> Journal of Molecular Biology. 226 (1), 23-28 (1992).</li>
<li>Edwards, A. M., Darst, S. A., Hemming, S. A., Li, Y., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitaxial+growth+of+protein+crystals+on+lipid+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Epitaxial growth of protein crystals on lipid layers.</a> Nature Structural Biology. 1 (3), 195-197 (1994).</li>
<li>Olofsson, A., Mallouh, V., Brisson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+structure+of+membrane-bound+annexin+V+at+8+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional structure of membrane-bound annexin V at 8 A resolution.</a> Journal of Structural Biology. 113 (3), 199-205 (1994).</li>
<li>Ribi, H. O., Ludwig, D. S., Mercer, K. L., Schoolnik, G. K., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+cholera+toxin+penetrating+a+lipid+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of cholera toxin penetrating a lipid membrane.</a> Science. 239 (4845), 1272-1276 (1988).</li>
<li>Celia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+model+of+Escherichia+coli+gyrase+B+subunit+crystallized+in+two-dimensions+on+novobiocin-linked+phospholipid+films%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional model of Escherichia coli gyrase B subunit crystallized in two-dimensions on novobiocin-linked phospholipid films.</a> Journal of Molecular Biology. 236 (2), 618-628 (1994).</li>
<li>Darst, S. A., Kubalek, E. W., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase+holoenzyme+determined+by+electron+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of Escherichia coli RNA polymerase holoenzyme determined by electron crystallography.</a> Nature. 340 (6236), 730-732 (1989).</li>
<li>Schultz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+study+of+the+yeast+RNA+polymerase+A.+Electron+microscopy+of+lipid-bound+molecules+and+two-dimensional+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural study of the yeast RNA polymerase A. Electron microscopy of lipid-bound molecules and two-dimensional crystals.</a> Journal of Molecular Biology. 216 (2), 353-362 (1990).</li>
<li>Dryden, K. A., Crowley, C. S., Tanaka, S., Yeates, T. O., Yeager, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+crystals+of+carboxysome+shell+proteins+recapitulate+the+hexagonal+packing+of+three-dimensional+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%3A+a+publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional crystals of carboxysome shell proteins recapitulate the hexagonal packing of three-dimensional crystals.</a> Protein Science: a publication of the Protein Society. 18 (12), 2629-2635 (2009).</li>
<li>Barklis, E., McDermott, J., Wilkens, S., Fuller, S., Thompson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+HIV-1+capsid+proteins+on+a+lipid+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+BIOLOGICAL+CHemistry%22%5BJournal%5D)">Organization of HIV-1 capsid proteins on a lipid monolayer.</a> The Journal of BIOLOGICAL CHemistry. 273 (13), 7177-7180 (1998).</li>
<li>Barklis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+membrane-bound+retrovirus+capsid+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of membrane-bound retrovirus capsid proteins.</a> The EMBO Journal. 16 (6), 1199-1213 (1997).</li>
<li>Kelly, D. F., Dukovski, D., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+purification%3A+a+rapid+method+for+isolating+protein+complexes+for+single-particle+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Monolayer purification: a rapid method for isolating protein complexes for single-particle electron microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (12), 4703-4708 (2008).</li>
<li>Reis, A., Rudnitskaya, A., Blackburn, G. J., Mohd Fauzi, N., Pitt, A. R., Spickett, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+five+lipid+extraction+solvent+systems+for+lipidomic+studies+of+human+LDL%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">A comparison of five lipid extraction solvent systems for lipidomic studies of human LDL.</a> Journal of Lipid Research. 54 (7), 1812-1824 (2013).</li>
<li>Ueda, E. K. M., Gout, P. W., Morganti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+and+prospective+applications+of+metal+ion-protein+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+A%22%5BJournal%5D)">Current and prospective applications of metal ion-protein binding.</a> Journal of Chromatography. A. 988 (1), 1-23 (2003).</li>
<li>Dietrich, J., nien-Bryan, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDietrich%2C+J+%22Strategies+for+Two-dimensional+Crystallization+of+Proteins+Using+Lipid+Monolayers%22">Strategies for Two-dimensional Crystallization of Proteins Using Lipid Monolayers</a>. , Imperial College Press. (2005).</li>
<li>Kuang, Q., Purhonen, P., Hebert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-Dimensional+Crystallization+Procedure%2C+from+Protein+Expression+to+Sample+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Two-Dimensional Crystallization Procedure, from Protein Expression to Sample Preparation.</a> BioMed Research International. 2015, 693869(2015).</li>
<li>De Zorzi, R., Nicholson, W. V., Guigner, J. -M., Erne-Brand, F., Vénien-Bryan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+large+and+highly+ordered+2D+crystals+of+a+K%2B+channel%2C+structural+role+of+lipidic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Growth of large and highly ordered 2D crystals of a K+ channel, structural role of lipidic environment.</a> Biophysical Journal. 105 (2), 398-408 (2013).</li>
<li>Johnson, M. C., Schmidt-Krey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+crystallization+by+dialysis+for+structural+studies+of+membrane+proteins+by+the+cryo-EM+method+electron+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional crystallization by dialysis for structural studies of membrane proteins by the cryo-EM method electron crystallography.</a> Methods in Cell Biology. 113, 325-337 (2013).</li>
<li>Rémigy, H. -W., Caujolle-Bert, D., Suda, K., Schenk, A., Chami, M., Engel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+reconstitution+and+crystallization+by+controlled+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Membrane protein reconstitution and crystallization by controlled dilution.</a> FEBS Letters. 555 (1), 160-169 (2003).</li>
<li>Braun, T., Kaufmann, T. C., Rémigy, H., Engel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+Crystallization+of+Membrane+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Encyclopedic+Reference+of+Genomics+and+Proteomics+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional Crystallization of Membrane Proteins.</a> Encyclopedic Reference of Genomics and Proteomics in Molecular Medicine. , 1936-1942 (2006).</li>
<li>Lebeau, L., Vénien-Bryan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+two-dimensional+crystallization+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Monolayer two-dimensional crystallization of membrane proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 955, 59-71 (2013).</li>
<li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%2C+lipids+and+detergents%3A+not+just+a+soap+opera%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li>
<li>Lebeau, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+crystallization+of+a+membrane+protein+on+a+detergent-resistant+lipid+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional crystallization of a membrane protein on a detergent-resistant lipid monolayer.</a> Journal of Molecular Biology. 308 (4), 639-647 (2001).</li>
</ol>

Os autores não têm conflito de interesses para declarar.

Uma monocamada lipídica é uma ferramenta poderosa que facilita o crescimento de grandes cristais 2D para estudos estruturais de macromoléculas biológicas. Para preparar com sucesso uma monocamada lipídica intacta na interface ar-água, é fortemente recomendável que os lipídios sejam preparados recentemente no dia do experimento, pois a oxidação da cadeia lipídica do acil pode levar à interrupção da embalagem na monocamada e afetar negativamente a formação de cristais resultante. Lipídios comprados em forma de pó devem ser...

A difração eletrônica através de cristais 2D ou matrizes helicoidais de proteínas podem alcançar resoluções subnômetros em casos favoráveis1,2,3. De particular interesse são matrizes de proteína de membrana 2D reconstituídas ou cristais em seus ambientes quase nativos1. Como um cristal age como um amplificador de sinal aumentando a intensidade dos fatores estruturais em frequências espaciais específicas, a cristalografia eletrônica permite sondar um alvo com um tamanho menor em altas resoluções, como pequenas moléculas, do que aquelas para crio-EM de uma única partícula. O feixe de elétrons pode ser difracionado por uma matriz 2D ordenada de proteínas, gerando um padrão de difração ou uma imagem de rede, dependendo de onde o plano de imagem é gravado no detector4. As intensidades ditracadas podem então ser extraídas e processadas para reconstruir uma estrutura de projeção 2D do cristal. Os elétrons têm uma seção transversal de dispersão maior do que os raios-X e sua dispersão segue principalmente o modelo rutherford baseado na interação coulomb entre os elétrons e os átomos carregados na molécula5. As espessuras dos cristais de membrana 2D são geralmente inferiores a 100 nm, adequadas para transmissão eletrônica sem dispersão dinâmica ocorrendo dentro da amostra6. Estudos cristalográficos eletrônicos têm se mostrado uma poderosa ferramenta para sondar informações estruturais de alta resolução de proteínas de membrana e interações lipídica-proteínas7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17.
Uma monocamada lipídica é uma única camada lipídica composta de fosfolipídios densamente embalados em uma interface ar-água6, que pode auxiliar a formação de matriz 2D para proteínas solúveis ou proteínas de membrana periférica18. Dependendo da densidade dos lipídios e de sua pressão lateral, as moléculas lipídicas podem formar uma matriz 2D ordenada na interface ar-água com suas correntes de aciis estendidas ao ar e grupos de cabeça hidrofílicos expostos na solução aquosa1,6,19. O headgroup lipídico pode interagir com proteínas através da interação eletrostática ou pode ser modificado para fornecer uma etiqueta de afinidade para ligar um domínio proteico específico. Por exemplo, os DOGS-NTA-Ni (1,2-dioleoyl-sn -glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)imino ácido diacético)succinyl]2- Ni2+) é frequentemente usado na formação de uma monocamada lipídica para ligar as proteínas com uma tag poli-histidina20,21,22. Além disso, a toxina da cólera B pode ligar um pentasacarídeo particular do ganglioside GM1 em uma monocamada lipídica para estudos estruturais23,24. Ancorando as proteínas nos grupos de cabeça lipídicos, a monocamada lipídica pode auxiliar na formação das matrizes 2D que são finas para estudos cristalográficos de alta resolução. A técnica de monocamadas lipídica tem sido usada na cristalografia eletrônica para estudos estruturais de proteínas, tais como streptavidin2,25, anexo V26, cólera toxina27, E. coli gyrase B subunit28, E. coli RNA polymerase25,29,30, carboxysome shell proteins31 e as proteínas capsid do vírus HIV-1 32 e Mol muroneyine leucemia 33. Devido à estabilidade e propriedade química da monocamide lipídica, diferentes aplicações para preparação da amostra foram exploradas para a imagem crio-EM34. No entanto, a otimização será necessária para a formação de matrizes proteicas.
Aqui, fornecemos extensos detalhes da preparação geral de monocamadas lipídicas para imagens crio-EM e algumas considerações que podem afetar a qualidade das monocamadas formadas.

<table><tbody><tr><td>14:0 PC (DMPC)</td><td>Avanti Lipids</td><td>850345</td><td>1,2-dimiristoíl-sn-glicero-3-fosfocolina, 1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2.5 mL</td></tr><tr><td>Bulbo para pipetas pequenas</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-21</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>Dessecador a vácuo</td><td>Southern Labware</td><td>55207</td><td></td></tr><tr><td>EM grids</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>CF413-50</td><td>CF-1.2/1.3-4C 1.2 &micro; M de furo, 1,3 e micro; m espaço</td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>1001-090</td><td>Diâmetro 90 mm</td></tr><tr><td>Vidro Pipetas Pasteur</td><td>Seringa Hamilton Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>(25 &micro; L)</td><td>Hamilton Company</td><td>80465</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Hamilton (250 &micro; L)</td><td>Seringa Hamilton Company</td><td>81165</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton (5 &micro; L)</td><td>Seringa Hamilton Company</td><td>87930</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton (500 &micro; L)</td><td>Hamilton Company</td><td>203080</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1775-1GA</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td>100 mm &times; 15 mm</td></tr><tr><td>Bloco de Teflon</td><td>Grainger</td><td>55UK05</td><td>60 &micro; L poços com portos laterais da injeção, ciências manuais feitas</td></tr> da <tr><td>microscopia eletrônica</td><td>78325</td> da<td>pinça</td> Vários <td>estilos</td></tr><tr><td>Líquido de limpeza ultrassônico</td><td>Ultra-puro VWR</td><td>97043-996</td><td></td></tr> da <tr><td>água</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparação da amostra usando um método de monocamadas lipídica para estudos cristalográficos eletrônicos

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

A cristalografia eletrônica é uma ferramenta poderosa para a determinação da estrutura de alta resolução. Macromoléculas como proteínas solúveis ou membranas podem ser cultivadas em cristais bidimensionais altamente ordenados (2D) em condições favoráveis. A qualidade dos cristais 2D cultivados é crucial para a resolução da reconstrução final via processamento de imagem 2D. Ao longo dos anos, monocamadas lipídicas têm sido usadas como uma camada de suporte para promover a cristalização 2D de proteínas de membrana periférica, bem como proteínas solúveis. Este método também pode ser aplicado à cristalização 2D de proteínas de membrana integral, mas requer uma investigação empírica mais extensa para determinar condições de detergente e diálise para promover o particionamento da monocamadas. Uma monocamada lipídica se forma na interface ar-água de tal forma que os grupos de cabeça lipídica polar permanecem hidratados na fase aquosa e nas cadeias aciíticas não polares, divisória de caudas no ar, quebrando a tensão superficial e achatando a superfície da água. A natureza carregada ou as características químicas distintas dos grupos chefes fornecem afinidade por proteínas em solução, promovendo a vinculação para a formação de matriz 2D. Uma monocamada recém-formada com a matriz 2D pode ser prontamente transferida para um microscópio eletrônico (EM) em uma grade de cobre revestida de carbono usada para levantar e suportar a matriz cristalina. Neste trabalho, descrevemos uma metodologia de monocamadas lipídica para imagens microscópicas de elétrons criogênicos (crio-EM).

Uma monocamada lipídica depositada na grade EM pode ser visualizada sob um microscópio eletrônico de transmissão (TEM) sem coloração. A presença da monocamadas pode ser reconhecida pela diferença de contraste da área sem qualquer espécime no caminho do feixe. As áreas que possuem cobertura de monocamadas lipídicas têm menor contraste local do que as sem cobertura, uma vez que o feixe de elétrons através dos orifícios vazios não tem dispersão e mostra uma iluminação mais brilhante(Figura 3).<...

Monocamadas lipídicas têm sido usadas como base para a formação de cristais proteicos bidimensionais (2D) para estudos estruturais por décadas. Eles são estáveis na interface ar-água e podem servir como um material de suporte fino para imagens eletrônicas. Aqui apresentamos os passos comprovados na preparação de monocamadas lipídicas para estudos biológicos.

Preparação da amostra usando um método de monocamadas lipídica para estudos cristalográficos eletrônicos

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

Ao longo dos anos, as monocamadas lipídicas têm sido usadas como uma camada de suporte para promover a cristalização 2D de proteínas de membrana periférica, bem como proteínas solúveis. Este método também pode ser aplicado à cristalização 2D, como algumas proteínas de membrana integral. Mas requer uma investigação empírica mais extensa para determinar condições de detergente e diálise para promover partição para a monocameira lipídica.Uma monocamada lipídica se forma na interface da água do ar, de modo que os grupos polares da cabeça do lipídio permaneçam hidratados na fase aquosa. E as caudas acimais não polares da partição lipídica à interface da água do ar, que quebra a tensão da superfície e achata a superfície da água. A natureza da carga as distintas moieties químicas dos grupos de cabeça lipídica fornecem a afinidade por proteínas em solução.Promovendo a vinculação e, em princípio, a formação de matriz 2D. Quaisquer cristais 2D formados em uma monocamada lipídica podem ser prontamente transferidos para o microscópio eletrônico em uma grade EM revestida de carbono que é usada para levantar e apoiar a matriz cristalina na camada lipídica. Descrevemos neste manuscrito, uma metodologia de monocamadas lipídica para imagens de microscopia eletrônica criogênica.Preparação de monocamadas lipídicas. Preparação de caldo lipídido, prepare uma mistura lipídica de 0,01 mg por ml em volume 9:1 para volume de clorofórmio, metanol. Utilizando 8,91 ml de clorofórmio e 0,99 ml de metanol e 0,1 mls de uma solução lipídica de 10 mg por ml.Preparação da placa de Teflon. Sonicate uma placa de Teflon em um banho de metanol por cinco minutos. Lave com água quente por 15 minutos e enxágue com água destilada.Seque a placa de Teflon em um dessecado por 30 minutos e mantenha-a sob vácuo até usar. Formação de monocamadas lipídicas no reservatório tampão. O tempo estimado de funcionamento será de uma hora e meia.Coloque um papel filtro tipo um em uma placa de Petri e disponha o bloco Teflon em cima do papel do filtro. Encha os poços da placa Teflon com 60 microliters de tampão. Adicione cuidadosamente a mistura líquida em cima da superfície do buffer gota a gota.Idealmente um microliter por gota usando uma seringa Hamilton. Molhe o papel filtro com água destilada e mantenha a umidade na placa de Petri. Incubar à temperatura ambiente por 60 minutos, o clorofórmio deve evaporar e uma monocamada de lipídio na superfície dos tampões deve ser formada.Aplicação de uma grade EM em uma monocamadas lipídica. Tempo estimado de operação em uma hora e meia. Coloque suavemente uma rede EM revestida de carbono sem o lado de carbono de descarga de brilho para baixo na superfície de cada reservatório tampão.Injete cuidadosamente proteínas no poço de injeção lateral, use concentrações de proteínas finais no poço em torno de um micromolar. Incubar 60 minutos em temperatura ambiente. Injete suavemente aproximadamente 20 a 30 microliters de tampão na porta de injeção do local para elevar a grade acima da superfície do bloco Teflon.Isso permite que você pegue a grade com um par de pinças e levante-a verticalmente da gota. Resultados representativos. Uma monocamada lipídica depositada em uma grade EM pode ser visualizada sob o microscópio eletrônico de transmissão sem coloração de contraste.A presença da monocamadas pode ser reconhecida, pela diferença de contraste da área sem qualquer espécime nesse caminho de feixe. As áreas que possuem cobertura de monocamadas lipídicas têm contraste menor do que as sem cobertura. Uma vez que o feixe de elétrons através dos buracos vazios não tem dispersão, ele mostra uma iluminação mais brilhante.Em conclusão, o método de monocamadas lipídica oferece uma oportunidade para estudar estruturas proteicas devido à sua simplicidade. Pode fornecer uma abordagem alternativa para facilitar o processo de cristalização 2D.

sample-preparation-using-lipid-monolayer-method-for-electron

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Aqui é descrito o procedimento implementado no Grupo Biologia Caffrey Membrana Estrutural e Funcional para configurar manualmente ensaios de cristalização de proteínas da membrana lipídica em mesofases.

Cristalizando Proteínas de Membrana para determinação da estrutura usando mesofases lipídico

Avaliação bidimensional ensaios (2D) de cristalização para a formação de matrizes de proteína de membrana ordenado é uma tarefa altamente crítico e difícil em cristalografia de elétrons. Aqui, descrevemos a nossa abordagem na triagem para identificação de cristais e 2D de proteínas da membrana predominantemente de pequena faixa de 15 - 90 kDa.

Avaliar Trials bidimensional cristalização de proteínas da membrana Pequenas de Estudos Biologia Estrutural por Cristalografia Electron

Os protocolos descrevem os passos essenciais para a obtenção de cristais de difração de qualidade de uma proteína de membrana a partir de reconstituição da proteína em uma fase lipídica cúbicos (LCP), encontrando condições iniciais com os ensaios pré-cristalização LCP-FRAP, a criação de ensaios de cristalização LCP e cristais colheita .

Cristalização de proteínas da membrana lipídica em mesofases

β proteínas da membrana externa (OMPs) servem a muitas funções dentro das membranas externas de bactérias Gram-negativas, mitocôndrias e cloroplastos. Aqui, esperamos aliviar um gargalo conhecido em estudos estruturais, apresentando protocolos para a produção de OMPs de β barril em quantidades suficientes para determinação de estrutura por cristalografia de raios-X ou espectroscopia de RMN.

A partir de construções de Cristais - Rumo a determinação da estrutura de β-barril exterior Proteínas de Membrana

Descrevemos procedimentos para a preparação e entrega de microcristais de proteínas de membrana em fase cúbica lipídica para cristalografia seriada em lasers de elétrons livres de raios-X e fontes síncrotron. Esses protocolos também podem ser aplicados para incorporação e entrega de microcristais de proteínas solúveis, levando a uma redução substancial do consumo de amostras em comparação com a injeção de líquidos.

Preparação e entrega de microcristais de proteína na fase cúbica lipídico para Serial Femtosecond Cristalografia

A relação sinal-ruído dos dados é uma das considerações mais importantes na realização de medições de difração de raios-X a partir de microcristais. A linha de feixe VMXm fornece um ambiente de baixo ruído e micróbios para tais experimentos. Aqui, descrevemos métodos de preparação de amostras para montagem e resfriamento de microcristais para VMXm e outras linhas de cristalografia macromolecular microfocus.

Um pipeline de preparação de amostras para microcristais na linha de feixe VMXm

Este artigo descreve os protocolos de preparação de amostras, redução de dados e análise de dados em estudos de eco de giro de nêutrons (NSE) de membranas lipídicas. A rotulagem criteriosa de deutério de lipídios permite o acesso a diferentes dinâmicas de membrana em comprimento mesoscópico e escalas de tempo, sobre as quais ocorrem processos biológicos vitais.

Espectroscopia de Eco de Rotação de Nêutrons como uma sonda única para dinâmicas de membrana lipídica e interações membrana-proteína

Este protocolo descreve a formação de células imitando vesículas uni-lipídicas e multi-lipídicas, bicamadas lipídicas suportadas e bicamadas lipídicas suspensas. Estes modelos in vitro podem ser adaptados para incorporar uma variedade de tipos lipídes e podem ser usados para investigar várias interações de moléculas e macromoléculas.

Montagem de Modelos de Bicamadas lipídicas apoiadas e suspensas para o estudo de interações moleculares

A técnica peel-blot é um método de preparação de grade crio-EM que permite a separação de amostras biológicas multicamadas e concentradas em camadas únicas para reduzir a espessura, aumentar a concentração da amostra e facilitar o processamento da imagem.

A Técnica Peel-Blot: Um Método de Preparação de Amostras Crio-EM para Separar Camadas Individuais de Amostras Biológicas Multicamadas ou Concentradas

Um protocolo passo-a-passo para a fabricação de grades de afinidade à estreptavidina é fornecido para uso em estudos estruturais de amostras macromoleculares desafiadoras por microscopia crio-eletrônica.

Fabricação de grade de afinidade por estreptavidina para preparação de amostras de microscopia crio-eletrônica

Aprenda a preparar monocamadas lipídicas para cristalização bidimensional de proteínas periféricas e solúveis em biologia estrutural. Este método facilita estudos de imagem por microscopia eletrônica de crio.

Preparação da amostra usando um método de monocamadas lipídica para estudos cristalográficos eletrônicos

Explorar mais vídeos