Preparação da amostra usando um método de monocamadas lipídica para estudos cristalográficos eletrônicos

Ao longo dos anos, as monocamadas lipídicas têm sido usadas como uma camada de suporte para promover a cristalização 2D de proteínas de membrana periférica, bem como proteínas solúveis. Este método também pode ser aplicado à cristalização 2D, como algumas proteínas de membrana integral. Mas requer uma investigação empírica mais extensa para determinar condições de detergente e diálise para promover partição para a monocameira lipídica.

Uma monocamada lipídica se forma na interface da água do ar, de modo que os grupos polares da cabeça do lipídio permaneçam hidratados na fase aquosa. E as caudas acimais não polares da partição lipídica à interface da água do ar, que quebra a tensão da superfície e achata a superfície da água. A natureza da carga as distintas moieties químicas dos grupos de cabeça lipídica fornecem a afinidade por proteínas em solução.

Promovendo a vinculação e, em princípio, a formação de matriz 2D. Quaisquer cristais 2D formados em uma monocamada lipídica podem ser prontamente transferidos para o microscópio eletrônico em uma grade EM revestida de carbono que é usada para levantar e apoiar a matriz cristalina na camada lipídica. Descrevemos neste manuscrito, uma metodologia de monocamadas lipídica para imagens de microscopia eletrônica criogênica.

Preparação de monocamadas lipídicas. Preparação de caldo lipídido, prepare uma mistura lipídica de 0,01 mg por ml em volume 9:1 para volume de clorofórmio, metanol. Utilizando 8,91 ml de clorofórmio e 0,99 ml de metanol e 0,1 mls de uma solução lipídica de 10 mg por ml.

Preparação da placa de Teflon. Sonicate uma placa de Teflon em um banho de metanol por cinco minutos. Lave com água quente por 15 minutos e enxágue com água destilada.

Seque a placa de Teflon em um dessecado por 30 minutos e mantenha-a sob vácuo até usar. Formação de monocamadas lipídicas no reservatório tampão. O tempo estimado de funcionamento será de uma hora e meia.

Coloque um papel filtro tipo um em uma placa de Petri e disponha o bloco Teflon em cima do papel do filtro. Encha os poços da placa Teflon com 60 microliters de tampão. Adicione cuidadosamente a mistura líquida em cima da superfície do buffer gota a gota.

Idealmente um microliter por gota usando uma seringa Hamilton. Molhe o papel filtro com água destilada e mantenha a umidade na placa de Petri. Incubar à temperatura ambiente por 60 minutos, o clorofórmio deve evaporar e uma monocamada de lipídio na superfície dos tampões deve ser formada.

Aplicação de uma grade EM em uma monocamadas lipídica. Tempo estimado de operação em uma hora e meia. Coloque suavemente uma rede EM revestida de carbono sem o lado de carbono de descarga de brilho para baixo na superfície de cada reservatório tampão.

Injete cuidadosamente proteínas no poço de injeção lateral, use concentrações de proteínas finais no poço em torno de um micromolar. Incubar 60 minutos em temperatura ambiente. Injete suavemente aproximadamente 20 a 30 microliters de tampão na porta de injeção do local para elevar a grade acima da superfície do bloco Teflon.

Isso permite que você pegue a grade com um par de pinças e levante-a verticalmente da gota. Resultados representativos. Uma monocamada lipídica depositada em uma grade EM pode ser visualizada sob o microscópio eletrônico de transmissão sem coloração de contraste.

A presença da monocamadas pode ser reconhecida, pela diferença de contraste da área sem qualquer espécime nesse caminho de feixe. As áreas que possuem cobertura de monocamadas lipídicas têm contraste menor do que as sem cobertura. Uma vez que o feixe de elétrons através dos buracos vazios não tem dispersão, ele mostra uma iluminação mais brilhante.

Em conclusão, o método de monocamadas lipídica oferece uma oportunidade para estudar estruturas proteicas devido à sua simplicidade. Pode fornecer uma abordagem alternativa para facilitar o processo de cristalização 2D.