Name: Detecção de vírus e proteínas salivares de um vetor cigarrinha no hospedeiro vegetal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Aprenda a detectar proteínas salivares de cigarrinhas e proteínas virais em hospedeiros vegetais usando Western blot. Este método reprodutível auxilia pesquisadores a estudar interações inseto-planta e transmissão viral.

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Este trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (31772124 e 31972239) e da Fujian Agriculture and Forestry University (Grant KSYLX014).

As cigarrinhas adultas não virulíferas foram propagadas no Centro de Pesquisa de Vírus Transmitidos por Vetores da Universidade de Agricultura e Florestas de Fujian, China.
1. Criação de insetos não virulíferos
<ol><li>Recuar os adultos em mudas de arroz em uma gaiola cúbica de 40 cm x 35 cm x 20 cm (comprimento x largura x altura). Mantenha um lado da gaiola coberto com uma rede à prova de insetos para ventilação.<ol><li>Mantenha as gaiolas com cigarrinhas em uma incubadora que contenha um controlador de umidade embutido a 26 °C com uma umidade relativa de 60-75% sob um fotoperíodo de 16 h claro e 8 h escuro.</li>
	</ol></li>
	<li>Use um aspirador para transferir suavemente todos os adultos de sua gaiola para uma nova gaiola que contenha mudas de arroz fresco a cada semana.<ol><li>Deixe mais de 200 adultos acasalar e colocar ovos no arroz.</li>
		<li>Retenha as mudas velhas de arroz para que as ninfas surjam. Leve essas novas ninfas não virulíferas para o estágio de 2 ínstares.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Aquisição de vírus e coleta de insetos virulíferos
<ol><li>Transfira cuidadosamente as ninfas não virulíferas de 2 ínstares para um tubo de cultura de vidro (2,5 cm de diâmetro por 15 cm de altura) por 1-2 h para inanição usando o aspirador.<ol><li>Solte as ninfas em uma gaiola que contém uma planta de arroz infectada por RDV cultivada em um vaso.</li>
		<li>Deixe as ninfas se alimentarem da planta de arroz infectada por 2 dias. NOTA: Regue cuidadosamente a planta de arroz e evite lavar as ninfas. As ninfas de 2 ínstares têm aproximadamente 1,6-2 mm de comprimento.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfira cuidadosamente essas ninfas para uma nova gaiola que contenha mudas frescas de arroz livres de vírus com umidade relativa de 60-75% sob fotoperíodo de 16 h claro e 8 h escuro. Permitir que as ninfas se alimentem da planta de arroz infectada por 12 dias para completar o período de transmissão circulativa do RDV.</li>
</ol>3. Coleta de proteínas salivares utilizando gaiola de alimentação
<ol><li>Prepare cinco pequenas gaiolas de alimentação semelhantes a tubos (2,5 cm de diâmetro por 4 cm de altura) nas quais uma extremidade é coberta com rede à prova de insetos.</li>
	<li>Confine 15-20 cigarrinhas em cada gaiola de alimentação e, em seguida, cubra a outra extremidade da gaiola com uma esteira de espuma fina.<ol><li>Fixe uma muda de arroz (5-6 cm de altura) entre a extremidade da gaiola e uma esteira de espuma com fitas. Certifique-se de que as cigarrinhas na gaiola de alimentação possam se alimentar das mudas de arroz expostas ao interior da gaiola.</li>
	</ol></li>
	<li>Mergulhe as raízes da muda em água para que a planta de arroz permaneça viva. Deixe as cigarrinhas se alimentarem delas por 2 dias.</li>
	<li>Retire as cigarrinhas de suas gaiolas de alimentação e colete as mudas de arroz nas quais elas se alimentaram. Corte as partes das mudas fora da gaiola e recupere as regiões alimentícias das mudas. NOTA: Esta amostra pode ser armazenada a -80 °C durante no máximo 3 meses, se não for utilizada instantaneamente para detecção.</li>
</ol>4. Preparação dos reagentes
<ol><li>Dissolva 15,1 g de Tris-base, 94 g de glicina e 5 g de SDS em 1 L de água estéril para preparar o tampão 5xTris-glicina. Diluir 200 ml de tampão 5xTris-glicina com 800 ml de água estéril para preparar tampão 1xTris-glicina (ver Tabela 1 para composição do tampão).</li>
	<li>Dissolver 80 g de NaCl, 30 g de Tris-base e 2 g de KCl em 1 L de água estéril para preparar tampão salino tamponada com 10xTris (TBS). Autoclave a solução a 121 °C durante 15 min.</li>
	<li>Dissolver 8 g de SDS, 4 mL de ß-mercaptoetanol, 0,02 g de azul de bromofenol e 40 mL de glicerol em 40 mL de Tris-HCl 0,1 M (pH 6,8) para preparar 4x tampão de amostra de proteína.</li>
	<li>Misturar 800 mL de tampão Tris-glicina com 200 mL de metanol para preparar o tampão de transferência.</li>
	<li>Adicionar 100 mL de solução de 10xTBS e 3 mL de Tween 20 a 900 mL de água estéril para preparar o tampão TBS com solução de Tween 20 (TBST).</li>
</ol>5. Western blotting para detectar a saliva e proteínas virais
<ol><li>Triture 0,1 g das amostras de arroz com nitrogênio líquido até que o tecido se torne um pó. Adicionar 200 μL de tampão de amostra de proteína 4x à amostra e fervê-la por 10 min. Centrifugar as amostras a 12.000 x g por 10 min à temperatura ambiente.<ol><li>Retire o sobrenadante e coloque-o num frasco novo. Carregar 10 μL da amostra em um gel SDS-PAGE e executá-lo em tampão Tris-glicina a 150 V por 45-60 min. OBS: O resíduo após centrifugação pode ser descartado.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque uma membrana de nitrocelulose de 0,45 μm e outros suprimentos de sanduíche no tampão de transferência por 30 min. NOTA: Esta etapa pode ser feita antes que o gel tenha concluído sua execução.</li>
	<li>Sanduíche o gel e transfira-o por 90-120 min a 100 V no buffer de transferência.</li>
	<li>Pegue a membrana e coloque-a em solução de bloqueio de leite seco a 7% sem gordura em solução de TBST por 20 min. Adicionar o anticorpo específico contra RDV P8 ou Vg a uma solução a 7% de leite em pó desnatado em TBST. Incubar com o anticorpo para colorir a membrana por 2 h ou durante a noite.</li>
	<li>Lave a membrana com solução de TBST três vezes, com 5 min de lavagem de cada vez.</li>
	<li>Adicionar a IgG anti-coelho de cabra como anticorpo secundário a 7% de leite em pó desnatado com TBST. Incubar com o anticorpo por 60-90 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave a membrana com solução de TBST três vezes por 5 min de cada vez.</li>
	<li>Use o kit ECL Western para o método quimioluminescente. Misture os reagentes de detecção 1 e 2 no kit na proporção de 1:1 em um tubo. Coloque o reagente misto na membrana e incube a mancha por 5 min.</li>
	<li>Escorra o excesso de reagente e tire uma foto colorimétrica da imagem quimioluminescente. Combine-os para ver a escada com bandas de proteínas.</li>
</ol>

<ol><li>Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li>
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<li>Madhusudhan, V. V., Miles, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobility+of+salivary+components+as+a+possible+reason+for+differences+in+the+responses+of+alfalfa+to+the+spotted+alfalfa+aphid+and+pea+aphid%5BTitle%5D)+AND+%22Entomologia+Experimentalis+et+Applicata%22%5BJournal%5D)">Mobility of salivary components as a possible reason for differences in the responses of alfalfa to the spotted alfalfa aphid and pea aphid.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (1), 25-39 (1998).</li>
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<li>Hogenhout, S. A., Bos, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector+proteins+that+modulate+plant-insect+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Effector proteins that modulate plant-insect interactions.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).</li>
<li>Tomkins, M., Kliot, A., Maree, A. F., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multi-layered+mechanistic+modelling+approach+to+understand+how+effector+genes+extend+beyond+phytoplasma+to+modulate+plant+hosts%2C+insect+vectors+and+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">A multi-layered mechanistic modelling approach to understand how effector genes extend beyond phytoplasma to modulate plant hosts, insect vectors and the environment.</a> Current Opinion in Plant Biology. 44, 39-48 (2018).</li>
<li>Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+transcriptomic%2Fproteomic+analysis+of+salivary+gland+and+secreted+saliva+in+three+planthopper+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species.</a> Journal of Proteomics. , (2018).</li>
<li>Hogenhout, S. A., Bos, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector+proteins+that+modulate+plant--insect+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Effector proteins that modulate plant--insect interactions.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).</li>
<li>Sun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mosquito+salivary+protein+promotes+flavivirus+transmission+by+activation+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A mosquito salivary protein promotes flavivirus transmission by activation of autophagy.</a> Nature Communications. 11 (1), 260(2020).</li>
<li>Sri-In, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+salivary+protein+of+Aedes+aegypti+promotes+dengue-2+virus+replication+and+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A salivary protein of Aedes aegypti promotes dengue-2 virus replication and transmission.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 111, 103181(2019).</li>
<li>Conway, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aedes+aegypti+D7+saliva+protein+inhibits+dengue+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Aedes aegypti D7 saliva protein inhibits dengue virus infection.</a> Plos Neglected Tropical Diseases. 10 (9), 0004941(2016).</li>
<li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whitefly+effector+Bsp9+targets+host+immunity+regulator+WRKY33+to+promote+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">A whitefly effector Bsp9 targets host immunity regulator WRKY33 to promote performance.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374 (1767), 20180313(2019).</li>
<li>Omura, T., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+outer+capsid+proteins+in+transmission+of+phytoreovirus+by+insect+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Role of outer capsid proteins in transmission of phytoreovirus by insect vectors.</a> Advances in Virus Research. 54, 15-43 (1999).</li>
<li>Chen, Q., Liu, Y., Long, Z., Yang, H., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+release+threshold+in+the+salivary+gland+of+leafhopper+vector+mediates+the+intermittent+transmission+of+rice+dwarf+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Viral release threshold in the salivary gland of leafhopper vector mediates the intermittent transmission of rice dwarf virus.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 639445(2021).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A saliva secretada diretamente pelas glândulas salivares dos insetos perfurocortantes desempenha um papel fundamental, pois predigere e desintoxica os tecidos do hospedeiro e os fatores biológicos cruzados dos vetores nos hospedeiros 1,3,4. Os fatores biológicos entre reinos, incluindo eliciadores, efetores e pequenos RNAs, são críticos para a comunicação inseto-hospedeiro14,15,16<sup class="xr...

O modo de transmissão vetor-hospedeiro das arboviroses, um problema fundamental, está na fronteira das ciências biológicas. Muitos vírus de plantas de importância agrícola são transmitidos horizontalmente por insetos vetores1. Mais da metade dos vírus de plantas são vetores por insetos hemípteros, incluindo pulgões, moscas-brancas, cigarrinhas, cigarrinhas e tripes. Esses insetos possuem características distintas que lhes permitem transmitir eficientemente vírus de plantas1. Possuem partes bucais sugadoras de piercing e se alimentam da seiva do floema e do xilema, e secretam sua saliva 1,2,3,4. Com o desenvolvimento e aprimoramento de técnicas, a identificação e análise funcional de componentes salivares vem se tornando um novo foco de intensas pesquisas. As proteínas salivares conhecidas na saliva incluem inúmeras enzimas, como pectinesterase, celulase, peroxidase, fosfatase alcalina, polifenoloxidase, sacarose,entre outras5,6,7,8,9,10,11,12,13 . As proteínas presentes na saliva também incluem eliciadores que desencadeiam a resposta de defesa do hospedeiro, alterando o desempenho dos insetos, e efetores que suprimem a defesa do hospedeiro, o que aumenta a aptidão dos insetos e componentes indutores de respostas patológicas do hospedeiro14,15,16,17. Portanto, as proteínas da saliva são materiais vitais para a comunicação entre insetos e hospedeiros. Durante a transmissão de vírus, a saliva secretada pelas glândulas salivares de insetos virulíferos sugadores de piercing também contém proteínas virais. Os componentes virais utilizam o fluxo de saliva para liberá-los do inseto para o hospedeiro da planta. Portanto, a saliva do inseto faz a ponte entre a interação tritrófica vírus-vetor-hospedeiro. Investigar a função biológica das proteínas da saliva secretadas por insetos virulíferos ajuda a entender a relação vírus-vetor-hospedeiro.
Para vírus animais, é relatado que a saliva de mosquitos medeia a transmissão e patogenicidade dos vírus do Nilo Ocidental (WNV) e Dengue vírus (DENV). A proteína da saliva AaSG34 promove a replicação e transmissão do vírus da dengue-2, enquanto a proteína da saliva AaVA-1 promove a transmissão do vírus DENV e Zika (ZIKV) por ativar a autofagia18,19. A proteína D7 da saliva de mosquitos pode inibir a infecção por DENV in vitro e in vivo via interação direta com os virions DENV e proteína recombinante do envelopeDENV 20. Em vírus de plantas, o begomovírus tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) induz a proteína salivar Bsp9 da mosca-branca, que suprime a imunidade mediada por WRKY33 do hospedeiro vegetal, para aumentar a preferência e o desempenho da mosca-branca, eventualmente aumentando a transmissão de vírus21. Como os estudos sobre o papel que as proteínas salivares de insetos desempenham em hospedeiros vegetais ficaram atrás daqueles de hospedeiros animais, um sistema estável e confiável para detectar as proteínas salivares em hospedeiros vegetais é urgentemente necessário.
O vírus da planta conhecido como vírus anão do arroz (RDV) é transmitido pela cigarrinha Nephotettix cincticeps (Hemiptera: Cicadellidae) com alta eficiência e de forma persistentemente propagativa22,23. O RDV foi relatado pela primeira vez como transmitido por um inseto vetor e causa uma doença grave do arroz na Ásia24,25. O virion é icosaédrico e esférico de camada dupla, e a camada externa contém a proteína P8 do capsídeoexterno 22. O período de transmissão circulativa do RDV em N. cincticeps é de 14 dias 26,27,28,29,30. Quando o RDV chega às glândulas salivares, os virions são liberados em cavidades armazenadas nas glândulas salivares por meio de um mecanismo semelhante à exocitose23. A vitelogenina (Vg) é o precursor da proteína da gema essencial para o desenvolvimento oocitário em fêmeas de insetos31,32,33. A maioria das espécies de insetos tem pelo menos um transcrito Vg de 6-7 kb, que codifica uma proteína precursora de aproximadamente 220 kDa. Os precursores proteicos da Vg geralmente podem ser clivados em fragmentos grandes (140 a 190 kDa) e pequenos (<50 kDa) antes de entrarem no ovário18,19. Análises proteômicas prévias revelaram a presença dos peptídeos derivados da Vg na saliva secretada da cigarrinha Recilia dorsalis, embora sua função seja desconhecida (dados não publicados). Recentemente é relatado que o Vg, que é secretado por via oral a partir de cigarrinhas, funciona como um efetor para danificar as defesas das plantas34. Não se sabe se o Vg de N. cincticeps também poderia ser liberado para o hospedeiro da planta com fluxo salivar, e então poderia desempenhar um papel na planta para interferir com as defesas da planta. Para determinar se N. cincticeps explora proteínas salivares, como Vg, para inibir ou ativar as defesas da planta, o primeiro passo é identificar as proteínas liberadas para a planta durante a alimentação. O entendimento do método de identificação das proteínas salivares presentes na planta é potencialmente essencial para explicar a função das proteínas da saliva e as interações entre Hemiptera e plantas.
No protocolo aqui apresentado, N. cincticeps é usado como exemplo para fornecer um método para examinar a presença de proteínas salivares no hospedeiro vegetal introduzidas através da alimentação de insetos. O protocolo detalha principalmente a coleta e detecção de proteínas salivares e é útil para investigações adicionais na maioria dos hemípteros.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Roche</td><td>D609K69032</td><td>Para 5&times; Tampão de tris-glicina e 10 vezes; Preparação de tampão TBS</td></tr><tr><td>glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WXBD0677V</td><td>Para 5&vezes; Preparação de tampão de tris-glicina</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLCB4394</td><td>Para 5&vezes; Reagente</td></tr><tr>químico Co. de<td>NaCl</td><td>Sinopharm da</td> preparação do tampão do Tris-glicina, Ltd <td>10019318</td><td>para 10&times; </td></tr><tr>Reagente químico Co. de<td>KCl</td><td>Sinopharm da</td> preparação do amortecedor de TBS, Ltd <td>10016318</td><td>para 10&times; TBS preparação de tampão</td></tr><tr><td>&szlig;-mercaptoetanol</td><td>Xiya Reagente</td><td>B14492</td><td>Para 4&vezes; preparação de tampão de amostra de</td></tr><tr><td>proteína azul de bromofenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SHBL3668</td><td>Para 4&vezes; preparação de tampão de amostra de proteína</td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10010618</td><td>Para 4&vezes; preparação de tampão de amostra de proteína</td></tr><tr><td>metanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10014118</td><td>para preparação do tampão de transferência</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Coolaber CIÊNCIA & TeCHNoLoGY</td><td>CT30111220</td><td>Para preparação de TBST</td></tr> leite <tr><td>em pó desnatado</td><td>Becton.Dickinso e companhia</td><td>252038</td><td>Para bloqueio de membrana, diluição de anticorpos</td></tr><tr><td>cabra anti-coelho IgG</td><td>Sangon Biotech</td><td>D110058-0001</td><td>Reconhecimento do kit ocidental ECL primário</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>32209</td><td>Substrato quimioluminescente</td></tr><tr><td>nitrocelulose membrana</td><td>Pall Corporation</td><td>25312915</td><td>Para transferência de proteínas</td></tr><tr><td>Buffers and Solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffer</td><td>Composição</td><td></td><td>Comentários/Descrição</td></tr><tr><td>&nbsp; 5&vezes; Tampão tris-glicina</td><td>15,1 g Tris base 94 g glicina &nbsp; 5 g de SDS em 1 L de água</td><td></td> estéril<td>&nbsp; Solução de estoque</td></tr><tr><td>1 e vezes; Tampão Tris-glicina</td><td>200 mL de 5&times; Tampão de tris-glicina 800 mL de água</td><td></td> estéril <td>Solução de trabalho, para SDS-PAGE</td></tr><tr><td>10&vezes; Tampão salino tamponada com Tris (TBS)</td><td>80 g NaCl 30 g Tris base 2 g KCl em 1 L de água</td><td></td> estéril <td>Solução de estoque</td></tr><tr><td>TBS com solução Tween 20 (TBST)</td><td>100 mL 10&vezes; Solução TBS 3 mL Tween 20 900 mL de água</td><td></td> estéril <td>Solução de trabalho</td></tr><tr><td>4&times; tampão de amostra de proteína</td><td>8 g SDS 4 mL de &szlig;-mercaptoetanol 0,02 g azul de bromofenol 40 mL de glicerol em 40 mL 0,1 M Tris-HCl (pH 6,8)</td><td></td><td>Para extração de proteínas</td></tr><tr><td>Tampão de transferência</td><td>800 mL Tampão trisglicina 200 mL de metanol</td><td></td><td>Para transferência de</td></tr> <tr><td>proteínasInstruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SHBL3668</td><td>Para preparação de tampão de amostra de proteína 4x</td></tr><tr><td>Incubadora de temperatura constante</td><td>Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd.</td><td>PRX-1200B</td><td>Para criação de cigarrinhas</td></tr><tr><td>Eletroforese</td><td>Tanon Science & Tecnologia Co., Ltd.</td><td>Tanon EP300</td><td>Para SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Módulo de núcleo de transferência eletroforética</td><td>BIO-RAD</td><td>1703935</td><td>Para SDS-PAGE</td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10010618</td><td>Para 4x preparação de tampão de amostra de proteína</td></tr><tr><td>glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WXBD0677V</td><td>Para 5x preparação de tampão de tris-glicina</td></tr><tr><td>cabra anti-coelho IgG</td><td>Sangon Biotech</td><td>D110058-0001</td><td>Reconhecimento do instrumento de</td></tr><tr><td>moagem de tecido passa-alta</td> primário <td>de corpo de alta qualidade Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.</td><td>JXFSIPRP-24</td><td>Para moagem de tecidos vegetais</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10016318</td><td>Para 10x TBS preparação de</td></tr><tr><td>tampão metanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10014118</td><td>Para preparação de tampão de transferência</td></tr><tr><td>Mini calha de transferência de calor úmido</td><td>BIO-RAD</td><td>1703930</td><td>Para SDS-PAGE</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10019318</td><td>Para 10x TBS tampão preparação</td></tr><tr><td>membrana de nitrocelulose</td><td>Pall Corporation</td><td>25312915</td><td>Para transferência de proteínas</td></tr> leite <tr><td>em pó desnatado</td><td>Becton.Dickinso e companhia</td><td>252038</td><td>Para bloqueio de membrana, diluição de anticorpos</td></tr><tr><td>Pierce ECL Western kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>32209</td><td>Substrato quimioluminescente</td></tr><tr><td>Instrumento de cor de proteína</td><td>GE Biociências da saúde AB</td><td>Amersham lmager 600</td><td>Para detectar proteínas</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLCB4394</td><td>Para 5x preparação de tampão de tris-glicina</td></tr><tr><td>Base de tris</td><td></td><td>Roche D609K69032</td><td>Para 5x tampão de tris-glicina e 10&vezes; Preparação do tampão TBS</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Coolaber SCIENCE& CT30111220 de TeCHNoLoGY</td><td></td><td>para preparação de TBST</td></tr><tr><td>Tanque de eletroforese de placa vertical</td><td>BIO-RAD</td><td>1658001</td><td>para SDS-PAGE Banho-maria</td></tr><tr><td></td><td>Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd.</td><td>XMTD-8222</td><td>Para ferver as amostras de proteínas</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Reagente Xiya</td><td>B14492</td><td>Para preparação de tampão de amostra de proteína 4x</td></tr></tbody></table>

detecção de vírus e proteínas salivares de um vetor cigarrinha no hospedeiro vegetal

Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host

Insetos vetores transmitem horizontalmente muitos vírus de plantas de importância agrícola. Mais da metade dos vírus de plantas são transmitidos por insetos hemípteros que têm partes bucais sugadoras de perfuração. Durante a transmissão viral, a saliva do inseto faz a ponte vírus-vetor-hospedeiro porque os vírus vetores da saliva e as proteínas do inseto desencadeiam ou suprimem a resposta imune das plantas dos insetos para os hospedeiros das plantas. A identificação e análise funcional de proteínas salivares estão se tornando uma nova área de foco no campo de pesquisa das interações arbovírus-hospedeiro. Este protocolo fornece um sistema para detectar proteínas na saliva de cigarrinhas usando o hospedeiro da planta. O vetor cigarrinha Nephotettix cincticeps infectado com o vírus anão do arroz (RDV) serve como exemplo. A vitelogenina e a proteína P8 do capsídeo externo principal do RDV vetorado pela saliva de N. cincticeps podem ser detectadas simultaneamente na planta de arroz da qual N. cincticeps se alimenta . Este método é aplicável para testar as proteínas salivares que são temporariamente retidas no hospedeiro da planta após a alimentação do inseto. Acredita-se que este sistema de detecção beneficiará o estudo das interações hemiptera-vírus-planta ou hemiptero-planta.

A Figura 1 ilustra todas as etapas desse protocolo: criação de insetos, aquisição de vírus, coleta de proteínas salivares via alimentação do arroz e western blot. Os resultados de western blots mostraram que bandas específicas e esperadas de aproximadamente 220 kDa foram observadas nas amostras de arroz alimentado e glândulas salivares de insetos na membrana incubada com anticorpos contra Vg. Em contraste, nenhuma banda foi observada na amostra de arroz não alimentado. O resultado d...

Este protocolo demonstra como utilizar o hospedeiro vegetal para detectar proteínas salivares de cigarrinhas e proteínas virais de plantas liberadas por vetores cigarrinhas.

Detecção de vírus e proteínas salivares de um vetor cigarrinha no hospedeiro vegetal

Insect vectors horizontally transmit many plant viruses of agricultural importance. More than one-half of plant viruses are transmitted by hemipteran ...

Este protocolo fornece uma técnica para detectar as proteínas salivares de cigarrinhas e hospedeiros de plantas para investigar a função dessas proteínas nos hospedeiros vegetais. Esta técnica é fácil de executar e o sistema é estável e replicável. Este método também pode ser útil na detecção de proteínas salivares de outros hemipteros e hospedeiros vegetais.Para começar, crie as cigarrinhas adultas em mudas de arroz em uma gaiola cubal de 40 por 35 por 20 centímetros. Mantenha um lado da gaiola coberto com uma rede à prova de insetos para ventilação. Coloque as gaiolas com as cigarrinhas em uma incubadora contendo um controlador de umidade embutido a 26 graus Celsius com uma umidade relativa de 60 a 75% sob um período fotográfico de 16 horas claro e oito horas escuro.Uma vez por semana, use um aspirador para transferir suavemente todos os adultos de sua gaiola para uma nova gaiola contendo mudas frescas de arroz. Permita que mais de 200 adultos acasalem e coloquem ovos no arroz. Retenha as mudas velhas de arroz para que as ninfas surjam e crie essas novas ninfas não virulíferas para o estágio de segundo ínstar.Usando o aspirador, transfira cuidadosamente as ninfas não virulíferas do segundo ínstar para um tubo de cultura de vidro por uma a duas horas para inanição. Em seguida, solte as ninfas em uma gaiola contendo uma planta de arroz infectada pelo vírus anão do arroz cultivada em um vaso e permita que as ninfas se alimentem da planta de arroz infectada por dois dias. Após dois dias, transfira cuidadosamente essas ninfas para uma nova gaiola que contenha mudas frescas de arroz livres de vírus e permita que as ninfas se alimentem das mudas de arroz livres de vírus por 12 dias para completar o período de transmissão circulante do vírus anão do arroz.Para coletar as proteínas salivares, prepare cinco pequenas gaiolas de alimentação semelhantes a tubos cobertas com redes à prova de insetos em uma extremidade. Depois de confinar 15 a 20 cigarrinhas em cada gaiola de alimentação, cubra a outra extremidade da gaiola com uma esteira de espuma fina. Fixar uma muda de arroz entre a extremidade da gaiola e uma esteira de espuma com fitas adesivas, garantindo que as cigarrinhas na gaiola de alimentação possam se alimentar das mudas de arroz expostas ao interior da gaiola.Mergulhe as raízes da muda em água para que a planta de arroz permaneça viva e permita que as cigarrinhas se alimentem delas por dois dias. Após dois dias, retire as cigarrinhas de suas gaiolas de alimentação e colete as mudas de arroz nas quais as cigarrinhas se alimentaram. Corte as mudas fora da gaiola e recupere as regiões de alimentação das mudas.Preparar 1x tampão Tris-Glycine diluindo 200 mililitros do tampão preparado 5x com 800 mililitros de água estéril. Em seguida, prepare o tampão TBS 10x e autoclave a solução a 121 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, prepare o tampão de amostra de proteína 4x.Em seguida, prepare o tampão de transferência misturando 800 mililitros do tampão Tris-Glycine com 200 mililitros de metanol. Finalmente, prepare a solução TBST adicionando 100 mililitros de 10x TBS e três mililitros de Tween 20 a 900 mililitros de água estéril. Para detectar as proteínas salivares e virais, triture 0,1 gramas das amostras de arroz com nitrogênio líquido até que o tecido se torne um pó.Em seguida, adicione 200 microlitros do tampão de amostra de proteína 4x à amostra e ferva por 10 minutos. Centrifugar as amostras e transferir o sobrenadante para um novo frasco para injetáveis. Coloque 10 microlitros da amostra em um gel SDS-PAGE e execute-a em tampão Tris-Glycine a 150 volts por 45 a 60 minutos.Enquanto o gel estiver funcionando, coloque uma membrana de nitrocelulose de 0,45 mícron e outros suprimentos de sanduíche no tampão de transferência por 30 minutos. Após a corrida, sanduíche o gel e transfira-o por 90 a 120 minutos a 100 volts no buffer de transferência. Após a limpeza completa, coloque a membrana em uma solução de bloqueio de leite seco a 7% sem gordura em TBST e incube por 20 minutos.Depois disso, adicione um anticorpo contra o vírus anão do arroz P8 ou vitelogenina e incube a membrana por duas horas ou durante a noite. Após a incubação, lavar a membrana com TBST três vezes com uma incubação de cinco minutos entre cada lavagem. Em seguida, adicione IgG de cabra anti-coelho como anticorpo secundário e incube a membrana por 60 a 90 minutos.Use o kit ECL Western para detecção quimioluminescente em reagentes de detecção mistos um e dois no kit na proporção de um para um. Coloque a membrana sobre o reagente misto e incube a mancha por cinco minutos. Escorra o excesso de reagente e tire uma imagem quimioluminescente e colorimétrica da membrana.Combine as imagens para ver o último com bandas de proteína. A análise de Western blot para detecção de vitelogenina mostrou bandas específicas e esperadas de aproximadamente 220 quilodaltons na alimentação de plantas de arroz e glândulas salivares dos insetos. Em contraste, nenhuma banda foi observada nas plantas não-alimentadoras, indicando que a vitelogenina foi liberada no hospedeiro vegetal como proteína salivar.A análise de Western blot para detecção da proteína P8 do vírus anão do arroz mostrou uma banda específica e esperada de aproximadamente 46 quilodaltons em plantas alimentadoras e corpos de insetos virulíferos. Em contraste, nenhuma banda foi observada em plantas não alimentadoras e corpos de cigarrinhas não virulíferos, provando que as proteínas virais também podem ser detectadas nas plantas alimentadoras. A carga viral nas cigarrinhas, o tempo de detecção e as réplicas devem ser levados em consideração durante a realização deste protocolo.Este método também pode ser aplicado para estudar mosquitos que transmitem arbovírus.

detecting-virus-salivary-proteins-leafhopper-vector-plant

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pulgões são transmissores eficazes de vírus de plantas. Microinjeção pulgão do vírus, o procedimento que irá mostrar-lhe hoje, é uma técnica permitindo que os pesquisadores injetam vírus diretamente no hemocele do pulgão, contornando o intestino, uma das duas principais barreiras para a transmissão do vírus de uma maneira circulativo. A mesma técnica também é usada para injetar dsRNA para RNAi.

Testando a barreiras fisiológicas para a transmissão viral em Aphids Usando microinjeção

Source: Zhang, L., et al. Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts. J. Vis. Exp. (2021)The video demonstrates the preparation of gut tissue from a plant virus–infected insect vector for fluorescence imaging. Fixed guts were washed, permeabilized, and incubated with two fluorescent antibodies in a blocking solution—one targeting a viral antigen in vesicles, the other a vesicle-associated membrane protein. The tissue was counterstained for actin...

Immunostaining to Visualize Viral Antigen and Host Protein Colocalization in the Insect Gut

Descrevemos aqui um simples fluorescência de hibridação in situ (FISH), o método para a localização de vírus e bactérias, em tecidos de plantas e de insectos. Este protocolo pode ser estendido para a visualização de mRNA em toda montagem e cortes microscópicos.

Fluorescência<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizações (FISH) para a localização de vírus e bactérias Endosymbiotic em Plant e Insect Tecidos

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Aqui nós apresentamos uma nova abordagem para identificar a planta vírus com genoma de DNA dobro-costa. Utilizamos métodos padrão para extrair o DNA e RNA de folhas contaminadas e realizar o sequenciamento de próxima geração. Ferramentas de Bioinformatic montam sequências em contigs, identificam contigs representando genomas do vírus e atribuir genomas de grupos taxonômicos.

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Aqui, apresentamos os protocolos para identificar imunomoduladores 1) vírus-codificado que promovem a replicação de arbovírus e fatores do hospedeiro 2) eucariota que restringem a replicação de arbovírus. Esses métodos baseados em fluorescência e luminescência permitem aos investigadores para rapidamente obter leituras quantitativas de replicação de arbovírus em simplistas ensaios com baixa relação sinal-ruído.

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Este protocolo para marcação imunofluorescente de proteínas de vírus de plantas e proteínas de insetos vetores em intestinos de insetos excisados pode ser usado para estudar interações entre vírus e insetos vetores, funções de proteínas de insetos e mecanismos moleculares subjacentes à transmissão de vírus.

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O presente protocolo descreve um método para coletar saliva suficiente de insetos que sugam piercings usando um meio artificial. Este é um método conveniente para coletar saliva de insetos e estudar a função salivar no comportamento de alimentação de insetos e transmissão de vírus transmitidos por vetores.

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