Name: Cristalização no chip e difração serial em larga escala à temperatura ambiente (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Aprenda cristalização de proteínas em dispositivos chip-on-crystal para difração de raios X em temperatura ambiente. Este método automatizado coleta milhares de imagens sem contato físico, permitindo estudar dinâmica proteica e estados conformacionais.

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O uso da Advanced Photon Source, uma instalação de usuário do Office of Science operada para o Departamento de Energia dos EUA pelo Argonne National Laboratory, foi apoiada pelo contrato DE-AC02-06CH11357. O uso do BioCARS foi apoiado pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde sob o número de concessão R24GM111072. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde. O uso do LS-CAT Sector 21 foi apoiado pela Michigan Economic Development Corporation e pela Michigan Technology Tri-Corridor grant 085P1000817. Este trabalho é apoiado por doações da Universidade de Illinois em Chicago, Institutos Nacionais de Saúde (R01EY024363) e National Science Foundation (MCB 2017274) para XY.

1. Pré-montagem do dispositivo
<ol><li>Rotule o anel exterior (30 mm de diâmetro) para identificação da amostra. Se necessário, inclua o nome do projeto, o número do dispositivo, a condição de cristalização e a data (Figura 1A). Coloque o anel externo de cabeça para baixo em uma superfície limpa (Figura 1B) e coloque cuidadosamente uma bolacha de quartzo dentro do anel (Figura 1C). Esta primeira bolacha de quartzo serve como uma janela de entrada para os raios-X incidentes.</li>
	<li>Despeje uma pequena quantidade de óleo de imersão do microscópio (viscosidade de 150 cSt) em uma placa de Petri. Mergulhe um calço no óleo e certifique-se de que ambos os lados do calço estejam devidamente lubrificados (Figura 1D). Remova o excesso de óleo esfregando o calço em uma superfície limpa.</li>
	<li>Coloque o calço oleado em cima da primeira bolacha de quartzo (Figura 1E). NOTA: O óleo de imersão é um excelente selante que protege a câmara de cristalização da potencial perda de vapor. Os cavacos devidamente montados geralmente duram semanas sem secagem visível. Esta etapa de pré-montagem é realizada sob luz ambiente. Para amostras sensíveis à luz, todas as etapas subsequentes, incluindo o carregamento da amostra, o armazenamento do dispositivo e a observação, devem ser realizadas sob luz de segurança.</li>
</ol>2. Carregamento da amostra e montagem do dispositivo
<ol><li>Use uma pipeta para misturar completamente a solução de proteína e o tampão de cristalização na primeira bolacha de quartzo. A razão de volume entre a amostra de proteína e o tampão normalmente varia de 2:1 a 1:2 (Figura 1F). Certifique-se de que o volume total da solução de cristalização não exceda a capacidade máxima da câmara de cristalização determinada pelo tamanho e espessura do calço. Evite bolhas de ar durante a mistura. NOTA: A composição de um buffer de cristalização varia de um experimento para outro. Consulte a Tabela 1 para obter informações sobre as condições de cristalização.</li>
	<li>Coloque a segunda bolacha de quartzo sobre a solução mista à medida que a solução começa a se espalhar (Figura 1G). Esta segunda bolacha de quartzo serve como a janela de saída dos raios-X difratados.</li>
	<li>Bata levemente na segunda bolacha de quartzo na borda para ajudar a espalhar o óleo enquanto empurra o ar para fora. Prenda o dispositivo parafusando um anel de retenção no anel externo (Figura 1H). Use uma ferramenta de aperto, se necessário (Figura 1I). Esteja ciente de que o aperto excessivo pode fazer com que bolachas de quartzo delicadas se deformem ou até mesmo rachem.</li>
</ol>3. Otimização de armazenamento e cristalização de dispositivos
<ol><li>Armazenar os dispositivos montados (Figura 1J) em uma caixa à temperatura ambiente ou dentro de uma incubadora com controle de temperatura. NOTA: Os cristais de proteína podem aparecer em algumas horas a dias após a montagem de um dispositivo de cristalização. Os resultados típicos da cristalização em chip são mostrados para várias amostras de proteínas representativas (Figura 2).</li>
	<li>Monitore o crescimento do cristal observando o dispositivo de cristalização sob um microscópio. Se necessário, otimize as condições de cristalização por iterações das seções 1-3.</li>
</ol>4. Calibração
NOTA: Os programas e comandos mencionados nas seções abaixo são executados no software inSituX.
<ol><li>Instale um cristal fino de granada de alumínio de ítrio dopado no suporte do chip (Figura 3). Instale a parada do feixe. Tire imagens de fluorescência de raios X do feixe direto executando o programa: burnmark.py <dispositivo>.param onde <device> é um nome selecionado pelo usuário para o dispositivo de cristalização. <device>.param é um nome de arquivo que contém parâmetros de controle específicos do dispositivo. Os valores padrão serão gradualmente substituídos por valores específicos ao longo do protocolo. Um arquivo <device>.param de exemplo é mostrado no arquivo suplementar 1.</li>
	<li>Encontre a posição precisa do feixe de raios X direto executando o programa de encaixe do perfil do feixe: beam.py <gravar imagem> -d <dispositivo> onde <gravar imagem> é o nome do arquivo da imagem de fluorescência de raios X (Figura 4). NOTA: Este programa calcula as posições precisas do feixe direto, bem como o tamanho do feixe. A posição do feixe marca o destino de translocação para todos os cristais do mesmo dispositivo. O tamanho do feixe também é usado para o planejamento do alvo.</li>
</ol>5. Varredura óptica
<ol><li>Coloque um dispositivo de cristalização no suporte do chip e prenda o dispositivo usando um parafuso manual (Figura 3A).</li>
	<li>Monte o suporte do chip no estágio de translação do difratômetro através de um mecanismo cinemático (Figura 3B).</li>
	<li>Instale uma fonte de luz adequada para tirar micrografias da janela óptica do dispositivo. A luz branca, a luz infravermelha ou outra luz de escolha podem ser usadas dependendo da sensibilidade à luz da amostra de proteína, bem como do objetivo do experimento.</li>
	<li>Execute o programa de varredura: scan.py <dispositivo>.param Este programa captura um conjunto de micrografias que são automaticamente transferidas para computadores de usuário especificados.</li>
	<li>Execute o programa de mosaico em um computador de usuário: tile.py <dispositivo> -x <x> -y <y> onde < x > e <y> são os valores iniciais para deslocamentos de coluna e linha de micrografias, respectivamente. Este programa costura todas as micrografias em uma montagem de 1-3 μm/pixel de resolução (Figura 5). NOTA: Os passos 5.4 e 5.5 geralmente demoram alguns minutos. O número total de micrografias varia de várias dezenas a centenas, dependendo da área de digitalização e ampliação.</li>
	<li>Execute o programa de localização de cristal: findX.py <montagem> -c <comprimento> <largura> -w <cunha> -x tamanho do feixe de <> onde <montagem> é a imagem lado a lado. Este programa realiza reconhecimento de cristais e planejamento de tiros. <comprimento> e largura <> indicam o tamanho do cristal a ser encontrado. Se o usuário deseja evitar cristais menores, <largura> pode ser usado como um ponto de corte, definindo um número maior do que os tamanhos de pequenos cristais indesejados. <cunha> é um valor angular que define a tolerância para cristais de forma irregular. <tamanho do feixe> refere-se ao tamanho do feixe direto obtido a partir do perfil montado acima (etapa 4.2; Figura 4). Além disso, um valor nominal pode ser definido pelos usuários para espaçar ainda mais os tiros direcionados. Esses parâmetros-chave permitem a seleção específica de cristais e o planejamento de destino (Figura 6).</li>
</ol>6. Difração de raios X
<ol><li>Remova a fonte de luz e instale a parada de feixe. Defina uma distância de detector apropriada. Siga o protocolo de segurança da linha de luz para procurar a cabana de raios-X. Abra o obturador de raios-X e o obturador a laser, se aplicável.</li>
	<li>Execute o programa de coleta de dados para difração serial: collect.py <device>.param -l <duração da luz> Este comando aciona a coleta de dados na qual todas as tomadas planejadas são visitadas uma após a outra de acordo com uma sequência pré-programada. Cada cristal alvo é translocado para a posição do feixe (passo 4.2). Em cada parada, a exposição a raios-X é tomada com ou sem uma iluminação a laser em um atraso de tempo programado. O Filme 1 mostra uma sequência automatizada de coleta de dados operada a uma frequência de 1 Hz. Rotineiramente, dezenas a centenas de imagens de difração são coletadas de um único dispositivo de cristalização (Filme 2). NOTA: A calibração da seção 4 e a varredura óptica da seção 5 são independentes na plataforma inSituX, portanto, completamente transferíveis para outra linha de luz. Seção 6 A difração de raios X deve envolver algum detalhe na operação da linha de luz.</li>
</ol>

<ol><li>Brändén, G., Neutze, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+challenges+in+time-resolved+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Advances and challenges in time-resolved macromolecular crystallography.</a> Science. 373, (2021).</li>
<li>Fischer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+room+temperature+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Macromolecular room temperature crystallography.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 54, (2021).</li>
<li>Schaffer, J. E., Kukshal, V., Miller, J. J., Kitainda, V., Jez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+X-rays%3A+an+overview+of+emerging+structural+biology+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Topics+in+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Beyond X-rays: an overview of emerging structural biology methods.</a> Emerging Topics in Life Sciences. 5 (2), 221-230 (2021).</li>
<li>Nogales, E., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM%3A+A+unique+tool+for+the+visualization+of+macromolecular+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM: A unique tool for the visualization of macromolecular complexity.</a> Molecular Cell. 58, 677-689 (2015).</li>
<li>Chapman, H. N., Caleman, C., Timneanu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffraction+before+destruction%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Diffraction before destruction.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 369, 20130313(2014).</li>
<li>Kisselman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-CHIP%3A+an+integrated+platform+for+high-throughput+protein+crystallization+and+on-the-chip+X-ray+diffraction+data+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">X-CHIP: an integrated platform for high-throughput protein crystallization and on-the-chip X-ray diffraction data collection.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (6), 533-539 (2011).</li>
<li>Liang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+combined+crystallization+plate+for+high-throughput+crystal+screening+and+in+situ+data+collection+at+a+crystallography+beamline%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F+Structural+Biology+Communications%22%5BJournal%5D)">Novel combined crystallization plate for high-throughput crystal screening and in situ data collection at a crystallography beamline.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 77, 319-327 (2021).</li>
<li>le Maire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-plate+protein+crystallization%2C+in+situ+ligand+soaking+and+X-ray+diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">In-plate protein crystallization, in situ ligand soaking and X-ray diffraction.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67, 747-755 (2011).</li>
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<li>Ren, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal-on-crystal+chips+for+in+situ+serial+diffraction+at+room+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Crystal-on-crystal chips for in situ serial diffraction at room temperature.</a> Lab on a Chip. 18, 2246-2256 (2018).</li>
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<li>Yang, X., Ren, Z., Kuk, J., Moffat, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-scan+cryocrystallography+reveals+reaction+intermediates+in+bacteriophytochrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Temperature-scan cryocrystallography reveals reaction intermediates in bacteriophytochrome.</a> Nature. 479, 428-432 (2011).</li>
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<li>Zeng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+crystallography+reveals+early+signaling+events+in+ultraviolet+photoreceptor+UVR8%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">Dynamic crystallography reveals early signaling events in ultraviolet photoreceptor UVR8.</a> Nature Plants. 1, 14006(2015).</li>
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<li>Zhao, F. -Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+sample+delivery+systems+for+serial+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22TheFEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">A guide to sample delivery systems for serial crystallography.</a> TheFEBS Journal. 286, 4402-4417 (2019).</li>
</ol>

ZR é o inventor dos chips cristal-em-cristal na patente dos EUA 9632042 concedida à Renz Research, Inc.

A cristalografia de proteínas nos primeiros anos conduzida à temperatura ambiente experimentou uma tremenda dificuldade em combater os danos da radiação de raios-X. Assim, foi substituído pelo método de criocristalografia mais robusto, à medida que as fontes de raios-X síncrotron se tornaram prontamente disponíveis20. Com o advento dos lasers de elétrons livres de raios-X, a cristalografia de proteínas em temperatura ambiente foi revivida nos últimos anos, com muitos novos desenvolvimentos impulsi...

Devido aos efeitos ionizantes da radiação de raios-X, a cristalografia de proteínas, em grande medida, tem sido limitada a condições criogênicas nas últimas três décadas. Portanto, o conhecimento atual dos movimentos das proteínas durante sua função decorre em grande parte de comparações entre estruturas estáticas observadas em diferentes estados sob condições criogênicas. No entanto, as temperaturas criogênicas inevitavelmente dificultam a progressão de uma reação bioquímica ou interconversão entre diferentes estados conformacionais enquanto as moléculas de proteína estão em ação. Para observar diretamente a dinâmica estrutural de proteínas em resolução atômica por cristalografia, métodos robustos e rotineiros são necessários para a realização de experimentos de difração à temperatura ambiente, o que exige inovações técnicas na entrega de amostras, coleta de dados e análise posterior de dados. Para tanto, avanços recentes na cristalografia seriada têm oferecido novos caminhos para a captura de imagens moleculares de intermediários e espécies estruturais de curta duração à temperatura ambiente 1,2,3. Em contraste com a estratégia "um-cristal-um-conjunto de dados" amplamente utilizada na criocristalografia convencional, a cristalografia seriada adota uma estratégia de coleta de dados semelhante à da microscopia crio-eletrônica de partícula única. Especificamente, os dados experimentais em cristalografia seriada são coletados em pequenas frações de um grande número de amostras individuais, seguidos por um processamento intensivo de dados no qual as frações de dados são avaliadas e combinadas em um conjunto de dados completo para determinação da estrutura 3D4. Essa estratégia de "um cristal-um-tiro" efetivamente alivia os danos da radiação de raios-X aos cristais de proteína à temperatura ambiente por meio de uma difração antes da estratégia de destruição5.
Como a cristalografia em série requer um grande número de cristais de proteína para completar um conjunto de dados, ela representa grandes desafios técnicos para muitos sistemas biológicos onde as amostras de proteína são limitadas e / ou o manuseio delicado de cristais está envolvido. Outra consideração importante é a melhor forma de preservar a integridade do cristal em experimentos de difração serial. Os métodos de difração in situ abordam essas preocupações, permitindo que os cristais de proteína difratem diretamente de onde crescem sem quebrar o selo da câmara de cristalização 6,7,8,9. Esses métodos livres de manuseio são naturalmente compatíveis com difração serial em larga escala. Recentemente, relatamos o projeto e a implementação de um dispositivo de cristalização para difração in situ baseado em um conceito cristal-em-cristal - cristais de proteína cultivados diretamente em quartzo monocristalino11. Este dispositivo "cristal sobre cristal" oferece várias vantagens. Primeiro, possui uma janela transparente de raios-X e luz feita de um substrato de quartzo monocristalino, que produz pouca dispersão de fundo, resultando em excelentes relações sinal-ruído em imagens de difração de cristais de proteína. Em segundo lugar, o quartzo de cristal único é uma excelente barreira de vapor equivalente ao vidro, proporcionando assim um ambiente estável para a cristalização de proteínas. Em contraste, outros dispositivos de cristalização que utilizam substratos à base de polímeros são propensos à secagem devido à permeabilidade ao vapor, a menos que o material polimérico tenha uma espessura substancial, o que, consequentemente, contribui para o alto espalhamento de fundo10. Em terceiro lugar, esse dispositivo permite a entrega de um grande número de cristais de proteína ao feixe de raios-X sem qualquer forma de manipulação ou colheita de cristais, o que é fundamental para preservar a integridade do cristal11.
Para agilizar os experimentos seriais de difração de raios X usando os dispositivos cristal sobre cristal, desenvolvemos um protótipo de difratômetro para facilitar a comutação entre os modos de varredura óptica e difração de raios X12. Este difratômetro tem uma pegada pequena e tem sido usado para coleta de dados em série em duas linhas de luz da Fonte Avançada de Fótons (APS) no Argonne National Laboratory. Especificamente, utilizamos BioCARS 14-ID-B para difração de Laue e LS-CAT 21-ID-D para oscilação monocromática. Este hardware de difratômetro não é necessário se uma linha de luz de laser de elétrons livres de síncrotron ou raios-X estiver equipada com duas capacidades principais: (1) posicionamento motorizado da amostra com uma faixa de curso de ±12 mm ao redor do feixe de raios-X em todas as direções; e (2) uma câmera digital no eixo para visualização de cristais sob iluminação luminosa que seja segura para cristais de proteína em estudo. O dispositivo de quartzo monocristalino, juntamente com um difratômetro portátil e o software de controle para varredura óptica, reconhecimento de cristais e coleta automatizada de dados in situ, constituem coletivamente a plataforma inSituX para cristalografia serial. Embora esse desenvolvimento seja motivado principalmente por suas aplicações de cristalografia dinâmica utilizando uma fonte policromática de raios-X, demonstramos o potencial dessa tecnologia para suportar métodos de oscilação monocromática10,12. Com a automação, essa plataforma oferece um método de coleta de dados seriais de alto rendimento à temperatura ambiente com consumo de proteína acessível.
Nesta contribuição, descrevemos em detalhes como configurar a cristalização no chip em um laboratório úmido e como realizar a coleta de dados de raios-X em série em uma linha de luz síncrotron usando a plataforma inSituX.
O método do lote é utilizado para configurar a cristalização em cavaco sob uma condição semelhante à do método de difusão de vapor obtido para a mesma amostra de proteína (Tabela 1). Como ponto de partida, recomendamos o uso de precipitante na concentração de 1,2-1,5x para o método de difusão de vapor. Se necessário, a condição de cristalização em lote pode ser otimizada por meio da triagem de grade fina. As bolachas de quartzo não são necessárias para ensaios de otimização; em vez disso, podem ser usadas coberturas de vidro (veja abaixo). Dispositivos de cristalização parcialmente carregados são recomendados para manter os testes de otimização em menor escala. Várias amostras de proteína foram cristalizadas com sucesso nesses dispositivos usando o método de lote10 (Tabela 1).
O dispositivo em si consiste nas seguintes partes: 1) um anel externo; 2) duas bolachas de quartzo; 3) um calço tipo arruela de plástico ou aço inoxidável; 4) um anel de retenção; 5) óleo de imersão do microscópio como selante (Figura 1). O volume total da solução de cristalização carregada em um chip depende do propósito do experimento. A capacidade da câmara de cristalização pode ser ajustada escolhendo um calço de diferentes espessuras e/ou diâmetro interno. Rotineiramente configuramos dispositivos de cristalização de 10-20 μL de capacidade usando calços de 50-100 μm de espessura. Um dispositivo típico pode produzir dezenas a milhares de cristais de proteína adequados para a coleta de dados seriados (Figura 2).
Quando bem-sucedida, a cristalização no chip produzirá dezenas a centenas ou mesmo milhares de cristais de proteína em cada dispositivo de quartzo pronto para difração de raios-X. Em uma linha de luz síncrotron, esse dispositivo é montado em um estágio de translação de três eixos do difratômetro usando um mecanismo cinemático. A janela de cristalização de um dispositivo montado é digitalizada opticamente e fotografada em dezenas a centenas de micrografias. Essas micrografias são então costuradas em uma montagem de alta resolução. Para cristais fotossensíveis, a varredura óptica pode ser realizada sob luz infravermelha (IR) para evitar fotoativação não intencional. Um software de visão computacional foi desenvolvido para identificar e localizar cristais de proteína distribuídos aleatoriamente no dispositivo. Esses cristais são então classificados de acordo com seu tamanho, forma e posição para informar ou orientar a estratégia de coleta de dados em cristalografia seriada. Por exemplo, tiros únicos ou múltiplos podem ser localizados em cada cristal alvo. Os usuários podiam planejar uma única passagem ou várias rotas através de cristais direcionados. Implementamos um software para calcular várias rotas de viagem. Por exemplo, a rota mais curta é calculada usando algoritmos que abordam o problema do caixeiro viajante13. Para aplicações cristalográficas dinâmicas bomba-sonda, o tempo e a duração dos disparos de laser (bomba) e raios-X (sonda) podem ser escolhidos. Uma coleta de dados serial automatizada é programada para translocar cada cristal alvo no feixe de raios-X, um após o outro.
Os principais componentes do difratômetro insituX incluem: 1) um suporte de dispositivo; 2) uma etapa de tradução de três eixos; 3) uma fonte de luz para varredura óptica; 4) uma parada de feixe de raios-X; 5) lasers de bomba se forem estudadas proteínas sensíveis à luz; 6) Microcomputador Raspberry Pi equipado com uma câmera sensível ao IR; 7) software de controle para sincronizar motores, câmera, fontes de luz, bomba de laser, e para interface com os controles da linha de luz.

<table><tbody><tr><td>Software de análise</td><td>Granada</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de ítrio e alumínio dopado com cério</td> desenvolvida internamente <td>MSE Suprimentos</td><td></td><td>Ce:Y3Al5O12, YAG substratos de cristal único</td></tr><tr><td>Suporte de cavacos</td><td>Desenvolvido</td><td></td><td></td>internamente</tr><tr><td>Software de controle</td><td>Óleo</td> de imersão desenvolvido <td></td><td></td>internamente</tr><tr><td></td><td>Cargille Laboratories</td><td>16482</td><td>Tipo A baixo viscosidade 150 cSt</td></tr><tr><td>Plataforma inSituX</td> Fonte <td>de luz infravermelha desenvolvida</td><td></td><td></td>internamente</tr><tr><td></td><td>Thorlabs Incorporated</td><td></td><td>LED1085L LED com lente de vidro, 1085 nm, 5 mW, microscópio TO-18</td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td></td><td>SteREO Discovery V8</td></tr><tr><td>Anel externo</td><td>Placa de</td> Petri desenvolvida <td></td><td></td>internamente</tr><tr><td></td><td>Fisher Scietific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Pipetman</td><td>F167380</td><td>P10</td></tr><tr><td>Bomba lasers</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>LD785-SE400</td><td>785 nm, 400 mW, &Oslash; 9 mm, Código Pin E, Diodo Laser</td></tr><tr><td>Raspberry Pi</td><td>Raspberry Pi Fundation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anel de retenção</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>SM1RR</td><td>SM1 para &Oslash; Tubos e suportes de lente de 1"</td></tr><tr><td>Cristal de quartzo sem sementes</td><td>University Wafers, Inc.</td><td>U01-W2-L-190514</td><td>25,4 mm de diâmetro Corte em Z 0,05 mm de espessura polimento dupla face 8 mm em -X</td></tr><tr><td>Calço</td><td>Parada</td> de feixe de raios X desenvolvida <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>internamente Desenvolvido</td><td></td><td></td> internamente</tr></tbody></table>

cristalização no chip e difração serial em larga escala à temperatura ambiente

On-Chip Crystallization and Large-Scale Serial Diffraction at Room Temperature

Reações bioquímicas e processos biológicos podem ser melhor compreendidos demonstrando como as proteínas transitam entre seus estados funcionais. Como as temperaturas criogênicas não são fisiológicas e podem prevenir, dissuadir ou mesmo alterar a dinâmica estrutural das proteínas, um método robusto para experimentos rotineiros de difração de raios X à temperatura ambiente é altamente desejável. O dispositivo cristal sobre cristal e seu hardware e software que o acompanham usados neste protocolo são projetados para permitir a difração de raios-X in situ à temperatura ambiente para cristais de proteína de diferentes tamanhos sem qualquer manipulação de amostra. Aqui apresentamos os protocolos para as principais etapas desde a montagem do dispositivo, cristalização no chip, digitalização óptica, reconhecimento de cristais até o planejamento de disparos de raios-X e coleta automatizada de dados. Uma vez que esta plataforma não requer colheita de cristais nem qualquer outra manipulação de amostras, centenas a milhares de cristais de proteína cultivados em chip podem ser introduzidos em um feixe de raios-X de maneira programável e de alto rendimento.

Vários conjuntos de dados representativos foram publicados nos últimos anos 10,12, juntamente com os resultados cristalográficos e descobertas científicas de uma gama diversificada de amostras de proteínas, incluindo proteínas e enzimas fotorreceptoras, por exemplo, um fotorreceptor UV-B UVR8 vegetal, uma fotoliase de reparo de DNA orientada à luz PhrB10, uma nova proteína de detecção de luz vermelha distante de uma histidina quinase sensorial de múltiplos domíni...

Esta contribuição descreve como configurar a cristalização de proteínas em dispositivos cristal sobre cristal e como executar a coleta automatizada de dados seriais à temperatura ambiente usando a plataforma de cristalização no chip.

Cristalização no chip e difração serial em larga escala à temperatura ambiente

Biochemical reactions and biological processes can be best understood by demonstrating how proteins transition among their functional states. Since ...

Este protocolo demonstra a cristalização de proteínas em um dispositivo semelhante a um chip na coleta de dados de difração de raios X. Este dispositivo é chamado de cristal sobre cristal porque os cristais de proteína crescem em um único cristal de quartzo. Após o crescimento bem-sucedido de cristais de proteína em tais dispositivos, milhares de imagens de difração são coletadas de cada dispositivo à temperatura ambiente sem sequer tocar nos cristais de proteína.A difração de raios X à temperatura ambiente é muito essencial para o estudo da função proteica envolvendo muitos estados conformacionais. Essas alterações proteicas informativas ou ações proteicas podem ser congeladas, portanto, não detectáveis na criocristalografia. Esses dispositivos podem ser usados para estudar processos de sinalização induzidos pela luz e mudanças redox.Apenas um punhado de dispositivos fornece conjuntos de dados completos e redundantes. Para iniciar a pré-montagem do dispositivo, rotule o anel externo para a identificação da amostra. Inclua o nome do projeto, o número do dispositivo, a condição de cristalização e a data conforme desejado.Em seguida, coloque o anel rotulado de cabeça para baixo em um

on-chip-crystallization-large-scale-serial-diffraction-at-room

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este protocolo descreve em detalhes como fabricar e operar dispositivos microfluídicos para coleta de dados de difração de raios x em temperatura ambiente. Além disso, descreve como monitorar a cristalização de proteínas por difusão dinâmica da luz e como processar e analisar obtidos dados de difração.

Chips microfluídicos por difração de raio x de cristal In Situ e In Situ Difusão dinâmica da luz de cristalografia de Serial

Este artigo detalha o protocolo de fabricação de chips microfluidos desenvolvidos para cristalização de proteínas on-chip com o método de diálise e experimentos de difração de raios-X in situ. O processo de microfabização permite integrar uma membrana de diálise regenerada de celulose regenese semipermável com qualquer corte de peso molecular, entre duas camadas do chip.

Cristalização de proteínas no chip por microdiálise para estudos de difração de raios-X in situ

Um dispositivo microfluido versátil é descrito que permite a cristalização de uma enzima usando o método de contra-difusão, a introdução de um substrato nos cristais por imersão, e a determinação da estrutura 3D da enzima:complexo substrato por uma análise serial de cristais dentro do chip à temperatura ambiente.

Cristalização e Determinação Estrutural de uma Enzima:Complexo de Substrato por Cristalografia Serial em um Chip Microfluido Versátil

Apresentamos um guia abrangente para preparação fixa de amostras de alvo, coleta de dados e processamento de dados para cristalografia síncrotron serial na linha de feixe Diamond I24.

Coleta de dados seriais de alvo fixo na fonte Diamond Light

Apresentamos um protocolo para a cristalização de proteínas usando a instalação de cristalização no Complexo de Pesquisa em Harwell e subsequente coleta de dados cristalográficos de raios X in situ de cristais dentro das placas na linha de luz Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) de Diamond. Descrevemos os requisitos da amostra, protocolos de cristalização e diretrizes de coleta de dados.

Cristalização e Coleta de Dados de Temperatura Ambiente In Situ Usando a Instalação de Cristalização em Harwell e Linha de Luz VMXi, Fonte de Luz Diamante

Descrevemos procedimentos para a preparação e entrega de microcristais de proteínas de membrana em fase cúbica lipídica para cristalografia seriada em lasers de elétrons livres de raios-X e fontes síncrotron. Esses protocolos também podem ser aplicados para incorporação e entrega de microcristais de proteínas solúveis, levando a uma redução substancial do consumo de amostras em comparação com a injeção de líquidos.

Preparação e entrega de microcristais de proteína na fase cúbica lipídico para Serial Femtosecond Cristalografia

Sistemas automatizados e protocolos para a preparação de rotina de um grande número de telas e gotículas de cristalização nanolitros para experimentos de difusão de vapor são descritos e discutidos.

Automated protocolos para cristalização Macromolecular no laboratório de Biologia Molecular MRC

Um protocolo é apresentado para cristalografia de raios X usando microcristais de proteína. São comparados dois exemplos de análise de microcristos criados em vivo após purificação ou em celulósio .

Microcristalografia de Cristais de Proteína e<em&gt; Em Cellulo</em&gt; Difração

Este protocolo descreve um método para o cultivo em grande escala de Caenorhabditis elegans em meios sólidos. Como alternativa à cultura líquida, este protocolo permite a obtenção de parâmetros de diferentes escalas sob cultivo baseado na placa. Isto aumenta a comparabilidade dos resultados, omitindo as diferenças morfológicas e metabólicas entre cultura de meios líquidos e sólidos.

Baseados na placa de cultivo em grande escala de Caenorhabditis elegans: preparação da amostra para o estudo de alterações metabólicas em Diabetes

Espectroscopia de ressonância paramagnética (EPR) de elétrons é um método inequívoco para medir radicais livre. A utilização de sondas de rotação seletiva permite detecção de radicais livres em diferentes compartimentos celulares. Apresentamos um método prático e eficiente para coletar amostras biológicas que facilitam a tratar, armazenar e transferir amostras para medições de EPR.

Uso de ressonância paramagnética electrónica em amostras biológicas em temperatura ambiente e 77 K

Aprenda cristalização de proteínas em dispositivos chip-on-crystal para difração de raios X em temperatura ambiente. Este método automatizado coleta milhares de imagens sem contato físico, permitindo estudar dinâmica proteica e estados conformacionais.

Cristalização no chip e difração serial em larga escala à temperatura ambiente

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