Geração de Transgênicos e Nocautes em Espécies Strongyloides por Microinjeção

O uso de microinjeção para entregar construções de DNA em Strongyloides nos permite gerar nocautes e transgênicos, que podem ser usados para estudar como esses vermes se desenvolvem, navegam em seu ambiente e parasitam os hospedeiros. Até agora, esta é a única técnica bem sucedida para gerar nocautes e transgênicos nesses parasitas. Um dia antes da microinjeção, adicione 180 microliters da solução agarose em um deslizamento de cobertura usando uma pipeta Pasteur de vidro, em seguida, imediatamente deixe cair um segundo deslizamento de tampa em cima para achatar a ágarose em uma almofada fina.

Após 5 a 10 segundos, remova o deslizamento da tampa superior deslizando os dois e determinando em qual slide a almofada de ágar está, e coloque-a de frente para cima. Em seguida, selecione um pequeno pedaço de fragmento de vidro de um deslizamento de cobertura quebrado, e usando fórceps, pressione-o suavemente no ágar perto da borda superior da almofada. No dia da microinjeção, forrar o suporte Baermann, que é uma peneira feita de dois anéis plásticos com duas camadas de rede de tuil de nylon presas entre eles com três pedaços sobrepostos de tecido de laboratório.

Em seguida, adicione a mistura fecal-carvão ao suporte Baermann. Em seguida, coloque o suporte Baermann com a mistura fecal-carvão no funil, dobre os pedaços de tecidos ao redor da mistura fecal-carvão, e adicione água suficiente para submergir a maior parte do carvão fecal. Em seguida, cubra o funil com uma tampa de placa de Petri de plástico de 15 centímetros para conter o odor e rotular o funil conforme necessário.

Após uma a duas horas, segure um tubo de centrífuga de 50 mililitros sob a tubulação de borracha na parte inferior do funil e abra cuidadosamente os grampos na parte inferior para distribuir de 30 a 40 mililitros de água contendo vermes no tubo de 50 mililitros. Então. transfira 15 mililitros da água Baermann contendo os vermes para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Gire o tubo, remova até 13 mililitros do supernatante e descarte-o em um recipiente de resíduos líquidos com iodo para matar qualquer verme.

Depois de coletar todos os vermes, inspecione a pelota de vermes na parte inferior do tubo. Se nenhum verme for visível, espere de uma a duas horas e colete mais vermes do aparelho Baermann. Transfira os vermes em tão pouca água quanto possível para uma placa média de crescimento de 2% nematode de seis centímetros com um gramado de E.coli HB101 e use esta placa como a placa de origem para a microinjeção.

Sob o microscópio dissecando, cubra o fragmento de vidro no deslizamento de cobertura da almofada de microinjeção com óleo de halocarboneto usando uma picareta de verme de platina padrão. Em seguida, coloque a tampa da almofada de microinjeção no escopo da microinjeção e localize o fragmento de vidro coberto de óleo. Alinhe o fragmento de vidro de tal forma que uma borda seja perpendicular à direção da agulha para servir como a superfície usada para quebrar a agulha.

Em seguida, usando um microscópio dissecando, certifique-se de que a agulha não tem bolhas ou detritos no eixo afilado e, em seguida, fixar a agulha de 1 a 1,5 centímetros no suporte pressurizado. Posicione a ponta da agulha no centro do campo de visão do microscópio por olho e sob baixa ampliação, posicione a ponta da agulha no campo de visão perpendicular ao lado do fragmento de vidro. Em seguida, mude para uma ampliação mais alta e alinhe a ponta da agulha com a borda do vidro, perto, mas não tocá-la.

Em seguida, para quebrar a ponta da agulha e permitir o fluxo líquido, bata suavemente a agulha na lateral do pedaço de vidro enquanto aplica pressão contínua do gás. Uma vez que o líquido comece a fluir, verifique a forma da ponta e certifique-se de que ela está afiada com líquido fluindo facilmente. Quando o líquido estiver fluindo bem da agulha, mova o slide de microinjeção para o escopo de dissecação e adicione um a dois microliters de óleo de halocarboneto na almofada de ágar para colocação dos vermes.

Transfira 20 para 30 strongyloides adultos jovens para uma placa média de crescimento de 2% nematode sem bactérias por pelo menos cinco minutos para remover bactérias superficiais em excesso e selecionar vermes únicos para microinjeção. Adicione mais vermes à placa conforme necessário durante a injeção. Usando uma pequena quantidade de óleo de halocarbono em uma picareta de verme, selecione uma fêmea adulta jovem Strongyloides com um a quatro ovos em sua gôndala da placa sem bactérias e transfira o verme para uma pequena gota de óleo no ágar pad.

Usando a picareta de verme, posicione suavemente o worm para que ele não seja enrolado e a gônada seja visível e de fácil acesso. Em seguida, posicione o verme no campo de visão do microscópio de microinjeção, garantindo que a gônada esteja do mesmo lado da agulha e posicionada para que a agulha entre em contato com a gônada em um pequeno ângulo. Em seguida, traga a ponta da agulha para o lado do verme no mesmo plano focal.

Em seguida, apontando para o braço de gônada perto do meio do verme, insira suavemente a agulha na gônada usando um microinjetor. Aplique imediatamente pressão na agulha para encher suavemente todo o braço da gônada com a solução de DNA. Depois que o fluido suficiente tiver sido injetado, remova a agulha e observe que a ferida se fecha.

Repita o procedimento com o outro braço da gônada, se estiver visível. Uma vez concluída a injeção, verifique rapidamente se a agulha não está entupida aplicando pressão com a ponta da agulha na almofada de ágar e, em seguida, transfira o slide com o verme injetado para o microscópio dissecando. Para recuperar o verme injetado, primeiro lugar algumas gotas de soro fisiológico tamponado de verme no verme para flutuar-lo para fora do ágar pad.

Em seguida, colete uma pequena quantidade de bactérias em um worm pick e toque no verme com as bactérias aderentes para removê-lo do líquido. Transfira suavemente o verme para a placa de recuperação. Para experimentos comportamentais, transfira de 20 a 30 larvas para uma placa média de crescimento de nematoides de 2% com um gramado de bactérias HB101 espesso, e sob um microscópio de dissecação de fluorescência, identifique as larvas expressando o transgene de interesse.

Em seguida, usando uma picareta de vermes, selecione as larvas transgênicas e coloque-as em um pequeno vidro de relógio com soro fisiológico tamponado por vermes. Para microscopia, usando uma lâmina de barbear, marque uma grade no fundo plástico de uma placa de 10 centímetros de quimioterapia para rastrear facilmente a localização dos vermes na placa. Em seguida, adicione três microliters de larvas em soro fisiológico tamponado por vermes em um quadrado na grade, preenchendo quantos quadrados necessários.

Em seguida, adicione gotas de 15 a 20 microliter de 1% de nicotina na água às gotas de verme. Depois de quatro minutos, quando os vermes estiverem paralisados, trive-os usando um microscópio dissecando fluorescência. Larvas transgênicas Strongyloides stercolaris com um padrão de expressão de ato incompleto e completo de 2 mRFPmars são exibidas aqui.

A expressão irregular no músculo da parede corporal é mais comum quando o transgene não é integrado ao genoma. Em contraste, a expressão consistente em todo o músculo da parede corporal muitas vezes indica que o transgene se integrou ao genoma. O passo chave é posicionar a agulha no mesmo plano de foco que a gônada para garantir que o DNA seja injetado na gônada e será incorporado aos ovos em desenvolvimento.

O desenvolvimento dessa técnica possibilitou o estudo da função genética em nematoides parasitas, que está fornecendo novas percepções sobre mecanismos de parasitismo e interações hospedeiro-parasita.