Name: Caracterização de Junções Neuromusculares em Camundongos por Microscopia Confocal Combinada e Super-Resolução (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Aprenda a analisar junções neuromusculares em camundongos usando microscopia confocal e STED combinadas. Este método quantifica alterações morfológicas em modelos de atrofia muscular espinhal e síndromes miastênicas congênitas.

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Agradecemos ao "Imaging and Cytometry Core Facility" da Genethon, bem como ao serviço de histologia, que são apoiados em parte por fundos de equipamentos da Região Ile-de-France, do Conseil General de l'Essonne, do Genopole Recherche de Evry, da Universidade de Evry Val d'Essonne e do INSERM, França. Também somos gratos ao Dr. Rashmi Kothary por fornecer a linha de mouse Smn2B / 2B (Universidade de Ottawa, Canadá) e ao Dr. Eric Krejci pela linha de mouse ColQDex2 / + (inédita, Universidade de Paris, França). Agradecemos a Guillaume Corre por seu apoio na análise estatística. Os anticorpos monoclonais 2H3 (desenvolvidos por Jessel, T.M. e Dodd, J.) e SV2 (desenvolvidos por Buckley, K.M.) foram obtidos do Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), criado pelo NICHD do NIH e mantido na Universidade de Iowa, Departamento de Biologia, Iowa City, IA 52242. Este trabalho foi apoiado pela Association Française contre les Myopathies (AFM-Telethon), pelo INSERM e pela Universidade de Evry Val d'Essonne.

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Os autores declaram não haver conflitos de interesse relacionados a este trabalho.

O protocolo de vídeo descrito fornece um método detalhado para quantificar a estrutura 3D das junções neuromusculares, combinando microscopia confocal e STED que pode ser usada para caracterizar alterações patológicas nos níveis pré e pós-sináptico. A alta resolução da microscopia STED permite a visualização e análise morfométrica de nanoestruturas que não são identificáveis por imagens confocais convencionais. Esse procedimento permitiu mensurar alterações estruturais de NMJs em dois músculos apendiculares, tibial anterior e gastrocnêmio, de camundongos CMS relacionados à SMA e ColQ.
Para obter resultados confiáveis com esta técnica, é fundamental dissecar e provocar os músculos adequadamente, prestando especial atenção à fáscia ao redor do músculo e à força aplicada para separar os feixes musculares; caso contrário, o padrão de inervação pode ser interrompido impedindo a avaliação pré-sináptica adequada do NMJ. Embora informações detalhadas sejam fornecidas para analisar os NMJs de AT e GA, em princípio, esse protocolo poderia ser adaptado a outros músculos, incluindo músculos planos, como o diafragma ou o abdome transversal37, que não requerem a etapa de provocação. A fixação tecidual também é crucial para garantir uma coloração de boa qualidade; portanto, recomenda-se o uso de PFA de alta qualidade em um volume apropriado (15-20 vezes o do músculo). Além disso, o tempo de exposição ao fixador é um passo importante porque artefatos, como encolhimento e aglomeração, podem aparecer devido à fixação excessiva e influenciar as características do NMJ. Dado o tamanho das amostras e a taxa de penetração da solução de paraformaldeído nos tecidos38, recomenda-se um tempo de fixação de 18-24 h para este tipo de músculo. Caso a etapa de coloração esteja planejada mais de uma semana após a colheita do tecido, sugere-se manter os músculos fixos em PFA em PBS suplementados com azida de sódio a 4 °C para evitar a proliferação bacteriana.
Este protocolo apresenta uma abordagem utilizando α-BTX-F488 para imagens confocais e α-BTX-F633 para STED. Esses fluoróforos foram escolhidos para se adequarem ao delineamento experimental descrito, mas podem ser modificados de acordo com os equipamentos e materiais disponíveis. Por exemplo, a rotulagem α-BTX F488 pode ser selecionada ao usar um laser STED CW 592 nm para aquisição e quantificação de imagens. No entanto, verifica-se que a configuração que foi aplicada no presente estudo (excitação pulsada fechada STED, depleção de 775 nm) apresenta maior desempenho e melhor resolução do que outras abordagens, como a onda contínua STED39, tornando-a mais adequada para a aplicação atual. Também é importante selecionar cuidadosamente as configurações de potência do laser, especialmente para STED (excitação e esgotamento), uma vez que as características de um perfil de intensidade não podem ser medidas em caso de saturação e, portanto, qualquer sinal saturado em uma imagem NMJ pode comprometer toda a análise.
Este fluxo de trabalho detalhado, incluindo aquisições e análises de imagens usando software de microscópio e macros ImageJ, foi desenvolvido para facilitar a análise morfométrica autônoma de NMJ por microscopia confocal e STED de um único músculo. Fluxos de trabalho descritos anteriormente para análise confocal de NMJ, como NMJ-morph2 ou NMJ-Analyser14, abriram caminho para o projeto de métodos semiautomáticos que facilitam a análise morfológica de NMJs e estudos comparativos. NMJ-morph (e sua versão atualizada aNMJ-morph15) é uma plataforma livre baseada em ImageJ que usa a projeção de intensidade máxima para medir 21 características morfológicas, e NMJ-Analyser usa um script desenvolvido em Python que gera 29 parâmetros relevantes de toda a estrutura NMJ 3D. O limite manual é a única etapa durante o processamento de imagem nesses dois métodos que exigem análise do usuário. Este protocolo integrado detalha as etapas de preparação de tecidos, aquisições de imagens confocais 3D e processamento baseado em ImageJ de NMJs de músculos esqueléticos inteiros e fornece uma visão geral simplificada de cinco parâmetros importantes das placas finais pós-sinápticas (volume, área de projeção máxima e tortuosidade) e pré-sinápticas (ocupação terminal axônica e acúmulo de neurofilamentos). Um parâmetro adicional de relevância biológica, o padrão de organização AChR das pregas juncionais pós-sinápticas, foi incorporado para análise morfométrica em nível nanométrico por microscopia STED de super-resolução (resolução 20-30 nm)40. Curiosamente, o preparo tecidual para imagens STED é mais simples do que outros métodos utilizados para estudos ultraestruturais NMJ, como a microscopia eletrônica de transmissão convencional (MET)9, que é um procedimento bastante complexo e demorado que requer um manipulador qualificado para obter seções ultrafinas da região muscular apropriada. Além disso, dados quantitativos de múltiplas dobras juncionais podem ser obtidos automaticamente usando o software associado ao STED.
Este protocolo foi aplicado para ilustrar defeitos de NMJs previamente conhecidos em músculos deficientes em SMN e ColQ 20,36,41,42. Alterações comuns foram encontradas nos dois modelos de camundongos por microscopia confocal, como diminuição do volume da placa terminal pós-sináptica, área de PImáx e tortuosidade relativa e aumento do acúmulo de neurofilamentos, enquanto alguns achados mais específicos (diminuição da ocupação do NMJ), foram observados apenas em camundongos SMA, como indicador de comprometimento do tráfico de vesículas36. Finalmente, um aumento na distância e largura da faixa AChR foi detectado no ColQ-KO pela análise STED, que são sinais de defeitos ultraestruturais nas pregas juncionais pós-sinápticas, como observado anteriormente pelo MET20. É importante ressaltar que esse protocolo pode ajudar em uma caracterização morfológica mais aprofundada das junções neuromusculares durante o desenvolvimento, manutenção e sob várias condições patológicas.

A junção neuromuscular (NMJ) é uma estrutura complexa composta por um terminal axônico motor, uma célula de Schwann perissináptica e uma porção de miofibra esquelética envolvida na transmissão de informações químicas e no acoplamento da atividade do neurônio motor inferior à contração muscular. Em mamíferos, a morfologia da junção neuromuscular muda durante o desenvolvimento, adotando uma forma típica de pretzel após a maturação, com diferenças de forma e complexidade entre as espécies, e mostra algum grau de plasticidade em resposta a processos fisiológicos como exercício ou envelhecimento 1,2,3,4 . A placa terminal motora pós-sináptica forma invaginações de membrana denominadas pregas juncionais, onde a parte superior contendo receptores de acetilcolina (AChR) está em contato próximo com o ramo axônico terminal pré-sináptico5.
Alterações morfológicas e funcionais nas junções neuromusculares contribuem para a fisiopatologia de diversos distúrbios neurodegenerativos, como atrofia muscular espinhal (AME) e esclerose lateral amiotrófica (ELA), miopatias como distrofia muscular de Duchenne (DMD), síndromes miastênicas congênitas (CMS), miastenia gravis (MG) e miopatias centronucleares (CNM) e sarcopenia associada ao envelhecimento 3,6,7,8,9, 10,11,12. Nessas doenças, observam-se alterações estruturais do NMJ, como fragmentação da placa terminal, redução do tamanho da prega juncional pós-sináptica e/ou desnervação. A patologia dos NMJs pode ser um evento primário ou precoce durante a progressão da doença ou aparecer mais recentemente como um evento secundário que contribui para as manifestações clínicas. De qualquer forma, o monitoramento da morfologia dos NMJs em modelos animais dessas doenças representa um parâmetro valioso para estudar alterações patológicas e avaliar a eficácia de possíveis tratamentos.
A morfologia das junções neuromusculares geralmente é analisada por técnicas que utilizam microscopia confocal2,13,14,15 ou microscopia eletrônica 5,16, com suas limitações inerentes como resolução ou dificuldades técnicas, respectivamente. Mais recentemente, a microscopia de super-resolução também foi utilizada para visualizar regiões específicas do NMJ, como zonas ativas pré-sinápticas ou distribuição de AChR na membrana pós-sináptica16,17,18, como uma abordagem alternativa ou complementar à análise ultraestrutural por microscopia eletrônica.
Este protocolo tem como objetivo fornecer um método detalhado e reprodutível para avaliar os parâmetros morfológicos do NMJ combinando microscopia de fluorescência confocal e depleção de emissão estimulada (STED). Características importantes das placas finais pré-sinápticas e pós-sinápticas, como volume, área, tortuosidade relativa, largura da faixa AChR e distribuição terminal axonal em fibras musculares provocadas inervadas de gastrocnêmio e tibial anterior de camundongos foram quantificadas no contexto de condições normais e doentes. Em particular, os defeitos do NMJ foram exemplificado no modelo de atrofia muscular espinhal em camundongo Smn2B/-camundongo, uma doença neuromuscular com degeneração do neurônio motor causada por mutações no gene SMN1 11,19, e em uma subunidade de cauda semelhante ao colágeno de camundongos knockout assimétrico da acetilcolinesterase (ColQDex2/Dex2 ou ColQ-KO), como um modelo da síndrome miastênica congênita20, 21,22.

<table><tbody><tr><td>Buffers e Reagentes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 cabra anti-rato IgG (F488)</td><td>Life Technologies, Thermofisher</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 &alpha;-bungarotoxina (F488-a-BTX)</td><td>Life Technologies, Thermofisher</td><td>B13422</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 cabra anti-rato IgG (F594)</td><td>Life Technologies, Thermofisher</td><td>A-11032</td><td></td></tr><tr><td>ATTO-633 &alfa;-bungarotoxina (F633-a-BTX)</td><td>Alomone Labs</td><td>B-100-FR</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>00-4959-52</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco, Invitrogen</td><td>14190-169</td><td></td></tr><tr><td>Etanol Absoluto</td><td>VWR</td><td>20821.296</td><td></td></tr><tr><td>Óleo de imersão, n = 1.518</td><td>THORLABS</td><td>MOIL-10LF&nbsp;</td><td>Baixa autofluorescência</td></tr><tr><td>Anticorpo de neurofilamento (NF-M)&nbsp;</td><td>DSHB</td><td>AB_531793</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td> <td>MERCK</td><td>1.04005</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo de glicoproteína de vesícula sináptica 2 (SV2)</td><td>DSHB</td><td>AB_2315387</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr> <tr><td>< forte > Materiais < / forte ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Alnico Botão ímãs cilíndricos</td><td>Farnell França</td><td>E822</td><td>diâmetro de 19,1 mm com tração máxima de 1,9 Kg</td></tr><tr><td>63x 1,4 NA magnitude imersão em óleo&nbsp; Objetiva HCX Plan Apo CS</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100x 1.4 NA HC PL APPO CS2 Objetiva</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinça curva fina - Pinça Moria iris</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>11370-31</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura extra fina - Vannas-T&uuml; bingen Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15-003-08</td><td></td></tr><tr><td>Pinça serrilhada fina</td><td>Euronexia</td><td>P-95-AA</td><td></td></tr><tr><td>Ponta de carregamento de gel redonda 1-200 &micro; L</td><td>COSTAR</td><td>4853</td><td></td></tr><tr><td>Leica microscópio confocal de varredura a laser TCS SP8</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Microscópio confocal de varredura a laser TCS SP8 Gated STED 775 nm</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lens Cleaning Tissue&nbsp;</td><td>Whatman (GE Healthcare)</td><td>2105-841</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps serrilhado médio</td><td>Euronexia</td><td>P-95-AB</td><td></td></tr><tr><td>Óculos de cobertura para microscópio 24x50 nm No 1.5H 170&plusmn; 5 &micro; m</td><td>Marienfield</td><td>107222</td><td></td></tr><tr><td>Superfície delta Nunclon de alta precisão (placas de 12 poços)</td> <td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>150628</tr><tr><td>Superfície delta Nunclon (placas de 24 poços)</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>142475</tr><tr><td>Safeshield bisturi</td><td>Feather</td><td>02.001.40.023</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura afiada-romba - tesoura fina - Aço inoxidável martensítico</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost mais lâminas</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad&nbsp;</td><td>Prism, San Diego (EUA)</td><td>Release N&deg; 6.07</td><td>Software estatístico</td></tr><tr><td>Software ImageJ</td> National <td>Institutes of Health</td><td>Release N&deg; 1.53f</td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite X Software</td><td>Leica Microsystems</td><td>Release N&deg; 3.7.2.2283</td><td>Software gratuito para microscópio disponível em https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/&nbsp;</td></tr></tbody></table>

caracterização de junções neuromusculares em camundongos por microscopia confocal combinada e super-resolução

Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy

As junções neuromusculares (NMJs) são sinapses altamente especializadas entre neurônios motores inferiores e fibras musculares esqueléticas que desempenham um papel essencial na transmissão de moléculas do sistema nervoso para os músculos voluntários, levando à contração. Eles são afetados em muitas doenças humanas, incluindo distúrbios neuromusculares hereditários, como distrofia muscular de Duchenne (DMD), síndromes miastênicas congênitas (CMS), atrofia muscular espinhal (AME) e esclerose lateral amiotrófica (ELA). Portanto, o monitoramento da morfologia das junções neuromusculares e suas alterações em modelos de camundongos com doença representa uma ferramenta valiosa para estudos patológicos e avaliação pré-clínica de abordagens terapêuticas. Aqui, métodos para marcar e analisar a morfologia tridimensional (3D) das partes pré e pós-sinápticas de placas terminais motoras de fibras musculares murinas provocadas são descritos. Os procedimentos para preparar amostras e medir o volume, a área, a tortuosidade e a morfologia/ocupação terminal axônica por imagem confocal, e a distância entre as pregas juncionais pós-sinápticas e a largura da faixa do receptor de acetilcolina (AChR) por microscopia de depleção de emissão estimulada por super-resolução (STED) são detalhados. Alterações nesses parâmetros NMJ são ilustradas em camundongos mutantes afetados por SMA e CMS.

A fim de facilitar a análise morfológica das junções neuromusculares em nível pré e pós-sináptico de forma reprodutível, foi desenvolvido um fluxo de trabalho desde a coleta muscular até a obtenção de imagens e quantificação utilizando o software microscópio e macros personalizadas ImageJ (Figura 1). Para exemplificar a utilidade deste protocolo, a morfologia dos NMJs em dois modelos de camundongos de distúrbios genéticos, camundongos Smn2B/- e ColQ Dex2/Dex2 afetados por atrofia muscular espinhal (AME) e uma forma de síndrome miastênica congênita (CMS), respectivamente, foram avaliados e os dados foram comparados com companheiros de ninhada de controle pareados por idade.
A estrutura do NMJ foi avaliada a partir dos músculos tibial anterior e gastrocnêmio de camundongos Smn2B/- (fundo C57Bl/6) e ColQDex2/Dex2 (fundo B6D2F1/J) de 3 e 6 semanas de idade, respectivamente, quando os sinais da doença já estão presentes nesses animais. Com 3 semanas de idade, camundongos Smn2B/- apresentam sinais de atraso no desenvolvimento muscular esquelético e desnervação, como atrofia e perda de NMJ35,36. Os camundongos CMS têm uma patologia primária em NMJs e manifestam uma redução no peso corporal a partir da primeira semana de vida e fraqueza muscular acentuada20 (dados não mostrados). Como mostrado na Figura 2A, a placa terminal motora pós-sináptica marcada com α-bungarotoxina fluorescente mostrou-se menor e/ou fragmentada em mutantes das duas linhas de camundongo por microscopia confocal. A quantificação de pilhas Z NMJ usando essas macros ImageJ personalizadas revelou reduções acentuadas no volume da placa final, projeção de intensidade máxima (MIP) e tortuosidade relativa em camundongos SMA e CMS em comparação com controles, como sinais de defeitos de maturação NMJ32 (Figura 2B-D). O volume da placa terminal pós-sináptica e a PImáx foram diminuídos em animais doentes (troca de dobras de 2,7 e 2,0 para o volume e 2,5 e 2,0 para PImáx, em camundongos Smn2B/- e ColQDex2/Dex2, respectivamente). A tortuosidade relativa também foi menor nos músculos deficientes em SMN e ColQ do que no WT (16,97% ± 1,33% no SMA versus 48,84% ± camundongos WT 5,90% e 13,29% ± 2,79% no CMS versus 30,20% ± 4,44% nos camundongos controle). Além disso, a quantificação da distribuição dos ramos terminais axônicos pré-sinápticos utilizando a macro personalizada ImageJ revelou um padrão alterado na distribuição do neurofilamento M nos dois modelos animais, com aumento da imunomarcação (84,65% ± 0,32% versus 16,57% ± 2,03% e 23,64% ± 2,78% versus 18,77% ± 1,73% nos camundongos Smn2B/- e ColQ Dex2/Dex2 em relação aos controles, respectivamente) (Figura 3A-D ). Pela coloração SV2, uma redução de 43% na razão de ocupação, ou seja, porcentagem de regiões contendo AChR com zonas ativas terminais nervosas adjacentes, também foi observada em camundongos Smn2B/- (49,36% ± 3,76% em SMA versus 85,69% ± 2,34% WT camundongos) (Figura 3E,F). Este parâmetro NMJ também foi calculado no GA dos mutantes ColQ Dex2/Dex2, mas não foi encontrada diferença estatisticamente significativa em comparação com os companheiros de ninhada de controle (dados não mostrados).
Além disso, analisamos as características da membrana pós-sináptica quantificando a distância entre as pregas juncionais e a largura das listras AChR, que estão localizadas na crista dessas dobras, no músculo deficiente em ColQ, usando microscopia de depleção de emissão estimulada por super-resolução (STED). Como mostrado na Figura 4, o aspecto dessas estruturas pode ser claramente visualizado pela marcação fluorescente de α-bungarotoxina e análise do perfil de intensidade. Avaliamos esses parâmetros do NMJ e encontramos um aumento na distância da prega juncional (d) e largura (w) das listras AChR no músculo gastrocnêmio dos mutantes (358,3 nm ± 11,97 nm e 320,8 nm ± 10,90 nm para a distância, e 216,9 nm ± 10,51 nm e 186,3 nm ± 7,015 nm para a largura, em ColQ Dex2/Dex2 em comparação com camundongos do tipo selvagem, respectivamente, p &lt; 0,05) (Figura 4C,D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig01.jpg"> Figura 1: Fluxograma do protocolo de vídeo para caracterização de NMJ multiescala 3D por microscopia confocal e STED. Os músculos tibial anterior (AT) e gastrocnêmio (GA) foram coletados de camundongos, e as fibras musculares foram provocadas antes da marcação com α-bungarotoxina-F488 ou α-bungarotoxina-F633, DAPI, anticorpos primários direcionados contra o neurofilamento M (NF-M) e glicoproteína 2 da vesícula sináptica (SV2) e anticorpos secundários conjugados com fluoróforo (F488 ou F594). As pilhas de imagens foram adquiridas por microscopia confocal e processadas para medir o volume de NMJ pós-sináptica, o acúmulo pré-sináptico de NF-M, a ocupação terminal do axônio NMJ, a área da placa terminal da projeção de intensidade máxima pós-sináptica (MIP) e a tortuosidade (d Obj(AB) é a distância entre A e B ao longo do perímetro do objeto (linha vermelha), enquanto dEuc(AB) é a distância euclidiana entre A e B (linha verde)). Para a análise da microscopia STED, a largura das listras do receptor de acetilcolina (AChR) e a distância entre as pregas juncionais foram quantificadas a partir de perfis de intensidade da coloração α-BTX-F633. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig01large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig02.jpg"> Figura 2: Caracterização do NMJ pós-sináptico multiparâmetro em modelos de camundongos de atrofia muscular espinhal (AME) e síndrome miastênica congênita (CMS) relacionada ao ColQ. (A) Imagens representativas de placas terminais motoras pós-sinápticas dos músculos AT e GA marcadas com α-bungarotoxina-F488 (α-BTX). (B ) Quantificação do volume da placa terminal pós-sináptica NMJ, (C) área de projeção de intensidade máxima (PImáx) e (D) tortuosidade relativa em AT de camundongos tipo selvagem (WT) e Smn2B/- de 3 semanas de idade (gráficos à esquerda, N = 3 animais por genótipo, n = 37 e n = 56 NMJs, respectivamente) e WT e ColQ Dex2/Dex2 de 6 semanas de idade camundongos (gráficos à direita, N = 5 camundongos por genótipo, n = 89 e n = 97 NMJs, respectivamente). Os dados são expressos como a média por rato (ponto) ± EPM. As diferenças entre os grupos foram analisadas pelo teste de Mann-Whitney (* p &lt; 0,05). A barra de escala é de 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig03.jpg"> Figura 3: Análise morfométrica da distribuição terminal axônica pré-sináptica em músculos de camundongos WT e mutantes. Padrão de inervação NMJ nos músculos tibial anterior (TA) e gastrocnêmio (GA) de camundongos CMS do tipo selvagem, SMA e relacionados ao ColQ. (A, B) Junções neuromusculares representativas de AT de camundongos WT e Smn2B/- aos 21 dias de idade marcadas com anticorpos contra o neurofilamento M (NF-M, vermelho) e α-bungarotoxina-F488 (α-BTX, verde) (A), e resultados de análise quantitativa do acúmulo de neurofilamentos (B); (C, D) Junções neuromusculares representativas do GA de camundongos WT e ColQ Dex2/Dex2 de 6 semanas de idade marcadas com anticorpos contra o neurofilamento M (NF-M, vermelho) e α-bungarotoxina-F488 (α-BTX, verde), mostrando placas finais pós-sinápticas (C) fragmentadas e imaturas e resultados de acúmulo de neurofilamentos nos dois grupos de animais (D). N= 4 (n = 34 NMJs) (B) e N = 3 (n = 54 NMJs) (D) animais WT, e N=3 (n = 36 NMJs) Smn2B/- e N = 3 (n = 55 NMJs) foram analisados nos experimentos ColQ Dex2/Dex2 camundongos (B, D). (E, F) Imagens representativas da ocupação terminal axônica em NMJs de AT de camundongos WT e Smn2B/- de 3 semanas de idade, marcados com anticorpos contra glicoproteína 2 da vesícula sináptica (SV2, vermelho) e α-bungarotoxina-F488 (α-BTX, verde) (E), e resultados da ocupação do NMJ (relação volume SV2/AChR) (F). Foram analisados os músculos de N = 3 (n = 50 NMJs) do tipo selvagem e N = 4 (n = 62 NMJs) Smn2B/- camundongos. Os dados são expressos como o valor médio por rato (ponto) ± MEV. As diferenças entre os grupos foram analisadas pelo teste de Mann-Whitney (* p &lt; 0,05). As barras de escala são de 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig04.jpg"> Figura 4: Imagem STED de placas finais pós-sinápticas NMJ. (A) Imagem STED representativa de um NMJ marcado com α-bungarotoxina-F633 (α-BTX) de gastrocnêmio de um camundongo selvagem de 6 semanas de idade mostrando listras AChR pós-juncionais (a barra de escala é de 5 μm). (B) Maior ampliação de uma região com listras AChR (painel inferior) que foi utilizada para gerar o perfil de intensidade. A largura (w) das listras AChR e a distância entre duas listras adjacentes (d) dessa região foram quantificadas e apresentadas no gráfico de barras. Representação esquemática da placa final pós-sináptica para ilustrar a largura (w) e a distância da faixa AChR (d). Esses parâmetros, (C) distância da faixa AChR e (D) largura, foram medidos em camundongos ColQDex2/Dex2 e companheiros de ninhada controle às 6 semanas de idade. NMJs de 5 WT (n total = 29 NMJs) e 6 ColQ Dex2/Dex2 (n total = 43 NMJs) foram analisados cegamente. Os dados são expressos como a média por rato (ponto) ± EPM. As diferenças estatísticas entre os grupos foram analisadas pelo teste de Mann-Whitney (* p &lt; 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig04large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura suplementar 1: Lançamento do software LAS X e parâmetros para aquisições confocais. As várias etapas para a aquisição de imagens confocais são descritas nas seções 3.1.2 a 3.1.7 do protocolo. Para cada aquisição de pilha NMJ, um projeto é aberto (etapa 3.1.4) e os parâmetros de tamanho da imagem, velocidade de aquisição, eixos X, Y e Z são selecionados (etapa 3.1.7), com cada varredura sequencial indicada (Seq.1, laser 405 para DAPI; Seq.2, laser 488 para α-BTX-F488; e Seq.3, laser 552 para anticorpos secundários conjugados F594). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%201.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura suplementar 2: Lançamento do software e parâmetros LAS X para aquisições STED. As etapas para adquirir imagens STED estão descritas nas seções 3.2.2 a 3.2.8 do protocolo. O microscópio é iniciado no modo de configuração STED ON (etapa 3.2.2) e um projeto é aberto (etapa 3.2.3). Os parâmetros para aquisição de imagem (etapa 3.2.7) (tamanho da imagem, velocidade de aquisição, fator de zoom, eixo X), com cada varredura sequencial são indicados (Seq.1 para α-BTX-F633; Seq.2 para anticorpos secundários conjugados F488). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%202.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura suplementar 3: Imagens de pregas juncionais coradas com α-BTX obtidas por microscopia STED. Exemplos de imagem de uma placa final pós-sináptica rotulada com α-BTX-F633 de um rato selvagem de 6 semanas de idade que foram adquiridos com um foco correto (à esquerda) ou incorreto (à direita). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%203.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura 4 suplementar: Pop-ups do Windows para descrever os dados de entrada e saída obtidos pelas macros ImageJ personalizadas. Exemplos de dados de entrada (arquivos .tif e .lif) de imagens NMJ são mostrados na coluna da esquerda. Os dados de saída das macros (coluna da direita) são salvos em pastas (Save_Volume, Save_Accu) que contêm imagens da junção (.tif) e folhas de dados contendo os resultados (arquivos .csv). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%204.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura 5 Suplementar: Análise de distância e largura da faixa AChR de uma aquisição STED usando o software LAS X. As etapas para analisar as imagens de NMJ STED estão descritas na seção 5 do protocolo. A) Imagem de uma região da placa terminal pós-sináptica marcada contendo listras AChR. A região de interesse para a análise de listras é selecionada desenhando uma linha perpendicular (linha verde, para distância da faixa) ou um retângulo perpendicular (retângulo roxo, para largura da faixa). (B, C) Os perfis de intensidade das regiões selecionadas e as medições para calcular a distância entre as listras AChR (B) e a largura da faixa AChR (C) são mostradas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%205.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo de codificação suplementar 1: Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal. Macro personalizada ImageJ para extrair medições de parâmetros NMJ (volume NMJ, área da placa final MIP e tortuosidade NMJ). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal_63032.ijm" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo de codificação suplementar 2: Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal. Macro personalizada ImageJ para extrair acúmulo de NF-M e coloração SV2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal_63032.ijm" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Este protocolo descreve um método para análise morfométrica de junções neuromusculares por microscopia confocal combinada e STED que é usado para quantificar alterações patológicas em modelos de camundongos de SMA e CMS relacionada ao ColQ.

Caracterização de Junções Neuromusculares em Camundongos por Microscopia Confocal Combinada e Super-Resolução

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the ...

Este protocolo ajuda a analisar quantitativamente a estrutura 3D das junções neuromusculares em uma resolução próxima à microscopia eletrônica usando um procedimento simples. A principal vantagem deste protocolo é que as amostras musculares são processadas de forma semelhante e imunomarcadas para microscopia confocal e STED, reduzindo o tempo para avaliação precisa da estrutura da junção neuromuscular em modelos animais. A quantificação morfológica que desenvolvemos pode ser facilmente adaptada para analisar outras estruturas subcelulares.Tenho o prazer de apresentar a Dra. Martina Marinello, uma cientista da minha equipe que mostrará como são realizadas provocações musculares e imunocolorações e dará algumas recomendações para a aplicação bem-sucedida deste protocolo. Tenho o prazer de apresentar o Dr. Jeremie Cosette, da plataforma de imagem da Genethon, que mostrará a aquisição e análise de imagens usando microscópios confocais e STED. Após a eutanásia, comece a provocar os músculos tibiais anteriores em pequenos feixes de fibras de cerca de um milímetro de largura usando duas pinças serrilhadas finas.Em seguida, transfira esses feixes musculares para uma placa de 24 poços contendo 1% de Triton X-100 preparado em PBS e permita que ele agite suavemente por uma hora à temperatura ambiente ou cinco horas a quatro graus Celsius. Após lavar as amostras três vezes por cinco minutos com PBS à temperatura ambiente, incubar as amostras com uma solução de bloqueio composta de BSA a 4% preparada em PBS com 1%Triton X-100 por quatro horas a quatro graus Celsius sob agitação suave. Em seguida, incubar as amostras durante a noite com a mesma solução de bloqueio contendo anticorpos monoclonais primários contra o neurofilamento M ou a glicoproteína 2 da vesícula sináptica para rotular terminais axônicos pré-sinápticos ou zonas ativas, respectivamente.No dia seguinte, lave os feixes musculares rotulados três vezes por cinco minutos com PBS sob agitação suave. Em seguida, incube-os com anticorpos secundários apropriados, colocando-os em um agitador por duas horas à temperatura ambiente. Depois de lavar os feixes musculares novamente, coloque-os em um slide com meio de montagem.Em seguida, coloque uma tampa de vidro de 1,5 grau na parte superior, seguida por ímãs cilíndricos em ambos os lados da lâmina para aplicar pressão e achatar os músculos. Para adquirir imagens usando o microscópio confocal, inicie o software do microscópio e escolha a máquina como modo de configuração e colete pilhas de imagens das junções neuromusculares em cada grupo experimental, de acordo com as configurações mencionadas no manuscrito do texto. No final da sessão, clique em Abrir no visualizador 3D e escolha uma junção neuromuscular representativa de um grupo experimental para visualizar a rotulagem 3D.Para calcular a junção neuromuscular pós-sináptica e o volume da placa, a área de projeção de intensidade máxima e a tortuosidade relativa, arraste e solte a macro para quantificação do volume da junção neuromuscular na janela da Imagem J e, quando a macro abrir em uma segunda janela, clique em Macros e Executar macro. Selecione a pasta nativa que contém as subpastas de junção a serem analisadas e clique em Selecionar. Em seguida, no menu pop-up da pasta de salvamento, selecione a pasta de armazenamento e clique em Selecionar.No novo menu pop-up chamado Tipo de imagem, selecione o formato das aquisições da pilha Z. Selecione o canal RGB correspondente à coloração de interesse e indique X, tamanho de pixel Y e etapa Z. Se os formatos de arquivo proprietários forem selecionados, a macro lerá diretamente o tamanho do pixel e a etapa Z.Para quantificar o acúmulo de neurofilamentos pré-sinápticos, arraste e solte a macro para quantificação da acumulação de junção neuromuscular na janela Imagem J e clique em Macros e Executar macro. Selecione as subpastas de junção, a pasta de armazenamento e o formato das aquisições de pilha Z, conforme demonstrado anteriormente. Em seguida, no pop-up Informações de Mancha, indique o rótulo e a cor pré-sinápticos e pós-sinápticos e clique em OK.In pop-up Tamanho do Pixel, indique o tamanho do pixel X, Y como 0,072 micrômetros, o passo Z como 0,5 micrômetros e clique em OK. Se os formatos de arquivo proprietários forem selecionados, a macro lerá diretamente o tamanho do pixel e a etapa Z.Para calcular a distância entre as listras do receptor de acetilcolina, selecione o menu Quantificar na parte superior da janela central. Clique na guia Ferramentas, selecione intensidade e clique no ícone de perfil de linha. Defina Oversampling como um e marque Classificar canais.Clique na guia Abrir Projetos e selecione a imagem filtrada a ser analisada. Em seguida, clique no ícone de linha de desenho e trace uma linha cruzando perpendicularmente várias listras ou dobras juncionais. Clique na parte superior do primeiro pico e mova o ponteiro do mouse enquanto pressiona o botão esquerdo do mouse até que o próximo pico máximo seja atingido.Observe o valor DX, que corresponde à distância entre os dois picos. Clique com o botão direito do mouse enquanto estiver na imagem da janela direita e selecione Salvar ROIs. Depois de clicar no ícone de seta, clique no ROI e exclua-o clicando no ícone da lixeira.Para calcular a largura da faixa do receptor de acetilcolina, selecione a intensidade no painel superior esquerdo sob a guia ferramentas, clique no ícone determinar FWHM e marque os canais de classificação. Em seguida, clique na guia Abrir Projetos e selecione a imagem filtrada a ser analisada. Em seguida, clique no ícone de retângulo de desenho no menu superior da janela direita.Selecione uma faixa horizontal ou vertical e desenhe um retângulo perpendicularmente à listra. Um perfil aparece na janela central. Clique na vertical ou horizontal do menu Projeção média localizado no painel esquerdo, dependendo se a orientação da faixa é vertical ou horizontal.Clique nas Estatísticas na janela central para ler o valor FWHM e, em seguida, salve e exclua os ROIs, conforme demonstrado anteriormente. A placa final motora pós-sináptica, marcada com alfa-bungarotoxina fluorescente, mostrou-se menor e fragmentada nos mutantes de duas linhagens de camundongos. A quantificação das pilhas Z da junção neuromuscular usando as macros personalizadas da Imagem J revelou uma diminuição acentuada no volume da placa final, projeção de intensidade máxima e tortuosidade relativa em ambos os modelos de camundongos com doença em comparação com os controles, indicando defeitos de maturação da junção neuromuscular.A quantificação da distribuição do ramo terminal axônico pré-sináptico utilizando a macro personalizada da Imagem J revelou um padrão alterado na distribuição do neurofilamento M nos dois modelos animais com aumento da imunomarcação. Através da coloração da glicoproteína 2 da vesícula sináptica, foi observada uma redução de 43% na razão de ocupação das regiões contendo receptores de acetilcolina com zonas ativas terminais nervosas adjacentes em camundongos Smn 2B/camundongos. O aspecto das placas finais pós-sinápticas da junção neuromuscular foi claramente visualizado pela marcação fluorescente de alfa-Bungarotoxina e análise do perfil de intensidade.A avaliação dos parâmetros da junção neuromuscular revelou um aumento na distância da prega juncional e na largura das listras receptoras de acetilcolina no músculo gastrocnêmio dos mutantes. Para obter resultados confiáveis, é crucial provocar os músculos adequadamente, prestando uma atenção especial à força aplicada para separar os feixes musculares. Esse protocolo pode ajudar a obter uma caracterização morfológica mais aprofundada da junção neuromuscular, que antes era contabilizada apenas por procedimentos complexos e demorados, como a microscopia eletrônica de transmissão.O procedimento de imagem STED abriu caminho para a investigação de novos insights sobre marcadores pré e pós-sinápticos, que contribuem para a fisiopatologia de doenças que afetam a junção neuromuscular.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Dissecção e imagem das Zonas de Ativos no Drosophila Junção neuromuscular

Descrevemos os procedimentos para a administração repetida de inibidores da sinalização muscarínicos ao longus levantador auris (LAL) muscular de ratos adultos jovens e para a imunocoloração subseqüente de sua junções neuromusculares (NMJs) em wholemounts. O músculo LAL tem vantagens exclusivas para...

A administração subcutânea de antagonistas muscarínicos e Triple-A imunocoloração do músculo Longus Levator Auris em Ratos

Visualizando as células individuais em tecidos densamente compactados, tais como as células de Schwann terminais (SCs) em junções neuromusculares (NMJs), é um desafio. "Sequential foto-branqueamento" permite delinear SCs terminais individuais, por exemplo, no explante triangularis músculo Sterni, uma preparação conveniente nervo-músculo, onde sequencial de branqueamento podem ser combinados com o lapso de tempo de imagem...

Sequencial de foto-branqueamento de delinear células de Schwann individuais na junção neuromuscular

Fonte: Marinello, M., et al. Caracterização de junções neuromusculares em camundongos por microscopia confocal e super-resolução combinada. J. Vis. Exp. (2021)Este vídeo demonstra a preparação, imunocoloração e imagem de junções neuromusculares no tecido muscular de ratos usando microscopia confocal e de super-resolução para visualizar e analisar estruturas pré-sinápticas e pós-sinápticas.

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Neste vídeo demonstramos um protocolo de dissecção do músculo transversus abdominis do camundongo e usamos imunofluorescência e microscopia para visualizar junções neuromusculares.

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A junção neuromuscular (JNM) é alterada em uma variedade de condições que às vezes podem culminar em insuficiência sináptica. Este relatório descreve métodos baseados em microscópio de fluorescência para quantificar essas mudanças estruturais.

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Imagem de super-resolução para estudar co-localização de proteínas e marcadores sinápticos em neurônios primários

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O protocolo descreve o método de carregar um corante de cálcio fluorescente através do nervo cortado em terminais nervosos motores do rato. Além disso, é apresentado um método único para o registro de transintes rápidos de cálcio nas terminações nervosas periféricas usando microscopia confocal.

Registro de Transintes de Cálcio na Junção Neuromuscular do Rato com Alta Resolução Temporal utilizando Microscopia Confocal

O protocolo mostra um método para examinar a correlação espacial entre os terminais pré-sinápticos, receptores pós-sinápticos e células schwann peri-sinápticas no músculo gastrocnemius medial de ratos usando imunohistoquímica fluorescente com diferentes biomarcadores, ou seja, neurofilamento 200, transporte de acetilcholina vesicular, alfa-bungarotoxina e S100.

Visualizando as Características Morfológicas da Junção Neuromuscular no Músculo Gastrocnemius De Rato Medial

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para visualizar as redes de microtúbulos nas junções neuromusculares e células musculares. Combinado com as poderosas ferramentas genéticas de Drosophila melanogaster, este protocolo facilita muito a triagem genética e a análise da dinâmica de microtúbulos para o papel das proteínas reguladoras da rede de microtúbulos no sistema nervoso.

Usando a junção neuromuscular de larvas de Drosophila e células musculares para visualizar a rede de microtúbulos

Aprenda a analisar junções neuromusculares em camundongos usando microscopia confocal e STED combinadas. Este método quantifica alterações morfológicas em modelos de atrofia muscular espinhal e síndromes miastênicas congênitas.

Caracterização de Junções Neuromusculares em Camundongos por Microscopia Confocal Combinada e Super-Resolução

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