Name: Isolamento rápido de células únicas de dentes humanos e de camundongos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Aprenda a isolar células únicas de dentes humanos e de camundongos com este protocolo rápido e eficiente. Este método preserva a viabilidade celular para análise de RNA sequenciamento de célula única em pesquisas odontológicas.

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J.K. foi apoiado pela Agência de Subvenção da Universidade de Masaryk (MUNI/H/1615/2018) e por fundos da Faculdade de Medicina MU para pesquisador júnior. J.L. foi apoiado pela Agência de Subvenção da Universidade de Masaryk, (MUNI/IGA/1532/2020) e é Bolsista de Talentos de Doutorado de Brno - Financiado pela Prefeitura municipal de Brno. T.B. foi apoiado pelo Fundo Austríaco de Ciência (bolsa Lise Meitner: M2688-B28). Agradecemos a Lydie Izakovicova Holla e Veronika Kovar Matejova pela ajuda na obtenção de dentes humanos. Finalmente, agradecemos a Radek Fedr e Karel Soucek por sua gentil assistência com a classificação FACS.

Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com as regulamentações internacionais e locais e aprovados pelo Ministério da Educação, juventude e esportes, República Tcheca (MSMT-8360/2019-2; MSMT-9231/2020-2; MSMT-272/2020-3). Este protocolo foi testado com camundongos machos e femininos wildtype C57BL/6 e CD-1 e com sox10:::iCreERT2 mice17 (combinado com vários sistemas de repórteres) em um fundo C57BL/6. Experimentos com amostras humanas foram realizados com a aprovação dos Comitês de Ética da Faculdade de Medicina, Masaryk University Brno & St. Anne's Faculty Hospital em Brno, República Tcheca.
1. Configuração experimental e elaboração de soluções
<ol><li>Configuração do instrumento<ol>
<li>Esfrie a centrífuga a 4 °C.</li>
		<li>Aqueça a câmara de incubação a 37 °C.</li>
		<li>Inicie a máquina de classificação celular ativada pela Fluorescência (FACS) e defina todas as temperaturas do classificador (incluindo o suporte do tubo de coleta) para 4 °C. Execute o controle de qualidade do instrumento, defina o atraso de queda.</li>
		<li>Defina a estratégia preliminar de gating e realize a classificação do teste. NOTA: Ao usar FACS, use o bocal de 100 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare as soluções (etapas 1.2.1-1.2.3).<ol>
<li>Solução de lavagem: Prepare fbs frescos de 2% (Soro Bovino Fetal) no HBSS (Solução de Sal Balanceado da Hanks).</li>
		<li>Mistura de digestão: Prepare colagenase fresca P (3 U/mL) totalmente dissolvida no HBSS.</li>
		<li>Opcional: Prepare HBSS + BSA fresco (0,04%) e esfrie metanol analítico em um congelador de -20 °C para armazenar suspensão unicelular a -80 °C. NOTA: O passo 1 precisa ser realizado antes do início do experimento. A composição das soluções utilizadas está resumida na Tabela Complementar 1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparação de dentes experimentais de animais/s e humanos
<ol><li>Prepare os animais experimentais (rato).<ol>
<li>Eutanize o rato de acordo com as regulamentações locais; por exemplo, por overdose de anestésicos como descrito anteriormente1. ATENÇÃO: Os regulamentos para eutanásia humana de animais experimentais variam localmente. Siga sempre as normas locais válidas.</li>
		<li>Proceda imediatamente para a etapa de dissecção tecidual (etapa 3). NOTA: Se o tecido dos animais experimentais não puder ser dissecado imediatamente (por exemplo, por causa da transferência de instalações de habitação animal), coloque os animais experimentais no gelo e realize a dissecção tecidual o mais rápido possível. Para obter mais células de polpas molares de camundongos, use animais mais jovens (6 semanas e menos). Com o aumento da idade, o tamanho da polpa dentária diminui. Os incisivos de camundongos mantêm principalmente sua estrutura com idade crescente para que animais de várias idades possam ser usados para dissecção tecidual.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare o dente humano NOTA: Os dentes humanos foram extraídos por uma razão clinicamente relevante. Cada diagnóstico foi tratado individualmente, e um cirurgião-dentista experiente sempre realizou a extração dentária.<ol>
<li>Coloque o dente recém-extraído imediatamente em um tubo de 50 mL com HBSS gelado e mantenha o tubo no gelo até que seja mais processado. NOTA: O uso de dentes do siso retidos de pacientes até os 25-30 anos é recomendado para o maior rendimento celular.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Dissecção tecidual
<ol><li>Segure o animal experimental atrás de sua cabeça, olhando para o aspecto ventral de sua cabeça para que a cauda aponte para longe.</li>
	<li>Usando uma tesoura pequena e afiada, remova rapidamente a pele da mandíbula para expor o arco mandibular, o tecido mole entre cada metade das mandíbulas e os músculos faciais adjacentes.<ol>
<li>Faça um corte profundo de cada lado da mandíbula; em primeiro lugar, através de m. masseter ao longo do lado bucal da mandíbula até a articulação temporomandibular, e, em seguida, ao longo da parte interna de cada metade da mandíbula através da base da cavidade oral (ver Figura Suplementar 1).</li>
	</ol></li>
	<li>Corte todos os músculos e ligamentos ao longo da mandíbula até a articulação temporomandibular tanto de fora quanto dentro da cavidade oral. NOTA: Evite cortar ossos. Isso pode danificar a parte mais apical do incisivo.</li>
	<li>Segure a mandíbula usando pinças de ponta torta e remova-a. Em seguida, divida a mandíbula dissecada em duas metades com tesouras cortando a profíase mandibular (ver Figura Suplementar 1).</li>
	<li>Use uma limpeza industrial de fiapos baixos para chafe o tecido mole restante de cada metade da mandíbula. Depois que ambas as partes da mandíbula forem limpas, coloque-as em uma placa de Petri pré-preparada com HBSS gelado. NOTA: De agora em diante, trabalhe no gelo. Uma dissecção adicional de incisivos e molares de rato é realizada sob um estereótipo com fundo preto.</li>
	<li>Incisivos mandibulares de rato<ol>
<li>Para a dissecação de incisivos mandibulares, remova a crista alveolar com os três molares e quebre transversalmente o arco mandibular no local correspondente à posição entre o primeiro e o segundo molar. NOTA: Uma lâmina de bisturi afiada nº 11 e pinças são usadas para realizar esta etapa (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Puxe cuidadosamente o incisivo para fora do resto da tomada dentária. NOTA: Se for bem sucedido, o incisivo extraído conterá partes apical intactas, incluindo tecido epitelial com laços cervicais completos.</li>
		<li>Se necessário, remova os fragmentos restantes de osso ainda ligados ao incisivo com pinças e um bisturi.</li>
		<li>Coloque os incisivos dissecados em HBSS frescos e gelados e disseca o tecido de interesse: laço cervical, polpa dentária ou outras partes do dente.</li>
		<li>Coloque o tecido mole dissecado em uma gota de HBSS fresco e gelado no meio de uma placa de Petri de 10 cm. Mantenha-se no gelo.</li>
	</ol></li>
	<li>Molares mandibulares de rato<ol>
<li>Para dissecar molares mandibulares, remova completamente a crista alveolar do resto da mandíbula usando uma lâmina de bisturi.</li>
		<li>Mova a crista alveolar dissecada em HBSS fresco e gelado em uma placa de Petri e remova cuidadosamente todos os fragmentos restantes de ossos alveolares ligados às raízes.</li>
		<li>Coloque os molares dissecados sem osso alveolar em HBSS fresco e gelado. Para expor a polpa, comece a remover partes da dentina do lado apical usando pinças finas e afiadas até chegar à cavidade da polpa.</li>
		<li>Uma vez alcançada a cavidade da polpa, disseque cuidadosamente a polpa dentária usando um par de pinças afiadas e coloque o tecido mole da polpa dentária em uma gota de HBSS fresco e gelado no meio de uma placa de Petri de 10 cm mantida no gelo. NOTA: Uma vez que as polpas molares do mouse são extremamente pequenas, adapte a ampliação no estereomicroscópio em conformidade.</li>
	</ol></li>
	<li>Dente humano<ol>
<li>Lave o dente humano mais uma vez no HBSS gelado para remover o sangue restante.</li>
		<li>Coloque o dente em três sacos plásticos estéreis de parede grossa e use o torno de um engenheiro de bancada de ferro fundido para quebrar o dente. Use mandíbulas vísas com uma superfície plana para evitar penetrar os sacos.</li>
		<li>Aperte lentamente o torno até ouvir o dente rachando; removê-lo dos sacos e colocá-lo em HBSS fresco e gelado em uma placa de Petri.</li>
		<li>Usando duas pinças, retire a polpa dentária, limpe-a de todos os restos de tecido duro e coloque-a em uma gota de HBSS gelada no meio de uma placa de Petri de 10 cm mantida no gelo. ATENÇÃO: O tecido humano pode ser potencialmente infeccioso. Ao trabalhar com tecido humano, use equipamentos de proteção para evitar contato direto com o tecido.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Preparação de suspensão unicelular
<ol><li>Prepare um tubo de 15 mL com 2,5 mL de mistura de digestão composta de Collagenase P (3 U/mL) totalmente dissolvido no HBSS. Mantenha a solução no gelo até o uso. NOTA: Use sempre collagenase P recém-preparada; não congele as alíquotas. A atividade P de colagenase varia de lote a lote. Verifique a atividade do seu lote antes de diluir. A colagenase P é ativada por cálcio, cuja quantidade já é suficiente no pó liofilizado. Portanto, é desnecessário enriquecer a mistura de enzimas com cálcio. A colagenase P não é inativada pela FBS, mas pode ser inativada por agentes querantes (por exemplo, etilenodiaminetetraacético - EDTA). A interrupção do processo de dissociação é garantida pela diluição da solução Collagenase P in Wash (2% de FBS no HBSS). Foi demonstrado que a adição de FBS aumenta a viabilidade celular e o número final de células após a triagem18.</li>
	<li>Usando uma lâmina de bisturi em forma redonda nº 10, corte o tecido em todas as direções nas menores peças possíveis. Reagregar os pedaços de tecido no meio da gotícula e cortar repetidamente os agregados teciduais usando uma lâmina de bisturi em forma redonda (nº 10). Repita este processo várias vezes até que o material esteja suficientemente picado.</li>
	<li>Transfira as peças de tecido desfiado usando uma ponta de pipeta de 1 mL para a mistura de digestão preparada. NOTA: No caso de um número maior de animais sendo processados de uma só vez, divida o tecido em vários tubos com Colagenase P. A quantidade máxima por tubo são polpas obtidas de aproximadamente 10 incisivos de camundongos. No caso dos molares, onde as polpas são muito menores, o número de polpas processadas pode ser aumentado adequadamente. Ao usar dentes humanos, use no máximo 2-3 polpas por tubo, dependendo do tamanho da polpa.</li>
	<li>Coloque o tubo em uma incubadora pré-aquecido de 37 °C com um shaker. Incline o tubo dentro do agitador para um ângulo de 60° e afina a velocidade para 150-200 rpm para garantir movimentos constantes de suspensão dentro do tubo.</li>
	<li>Triturar vigorosamente a suspensão a cada 3-4 min com uma ponta de pipeta de 1 mL para desintegrar todos os aglomerados. NOTA: Com o tempo, os aglomerados ficarão cada vez menores e mais macios até que quase desapareçam.</li>
	<li>No total, incubar por 15-20 min. No final da incubação, triturar pela última vez e, em seguida, adicione lentamente a solução de lavagem gelada a um volume final de 12 mL.</li>
	<li>Remova os demais aglomerados ou pedaços de tecido calcificado filtrando a suspensão usando um coador celular de 50 μm.</li>
	<li>Pegue 10-20 μL da suspensão celular filtrada e conte as células durante a centrifugação usando uma câmara de contagem de células (Hemocitômetro). Centrifugar por 5 min a 300 x g a 4 °C. Remova o supernatante usando uma pipeta sorológica de 10 mL. NOTA: Se o número de células for limitado que não pode ser contado em suspensão diluída, pule a contagem de células e use todas as células para processamento posterior.</li>
	<li>Opcional: Proceda para fixação e armazenamento21.<ol>
<li>Suspenda des suspenda as pelotas (até 107 células) em 100 uL de HBSS + BSA (0,04%).</li>
		<li>Adicione 400 μL de metanol resfriado e misture lentamente.</li>
		<li>Incubar a suspensão celular por 15 minutos no gelo.</li>
		<li>Armazenar a -80 °C até ser processado (não mais que 1 mês).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspenja a pelota na solução Wash. Aponte para 700-1200 células/μL da solução Wash.</li>
	<li>Mantenha o tubo no gelo até que seja mais processado. NOTA: Se necessário, realize a fixação e o armazenamento a -80 °C. No entanto, recomenda-se o processamento imediato da suspensão celular para scRNA-seq. Outras etapas dependerão do protocolo RNA seq de célula única. Quando o protocolo scRNA-seq usa um sistema microfluido (algumas empresas sc-RNA-seq fazem), carregue as células com base nas diretrizes do fabricante, diretamente ou após a classificação celular.</li>
	<li>Para facs, proceda à etapa 5.</li>
</ol>5. Classificação celular ativada por fluorescência (FACS)
<ol><li>Antes de classificar, prepare o instrumento de classificação celular.<ol>
<li>Esfrie todo o sistema para 4 °C, execute o controle de qualidade do instrumento, defina o atraso de queda e a tensão das placas de deflexão. Coloque tubos de coleta no suporte do tubo de coleta. NOTA: Para evitar etapas adicionais de centrifugação que resultem em uma perda celular inevitável, classifique as células em um microtubo (1,5 mL) com uma pequena quantidade (25-50 μL) da solução Wash.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Opcional: realize a coloração de viabilidade antes do FACS.<ol>
<li>Adicione o iodeto de propidium na suspensão celular antes do FACS a uma concentração final de 0,5 μg/mL e incubar por 15 min a 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque a amostra no classificador de células. Defina uma estratégia rigorosa de gating para remover detritos celulares, dobras e células mortas. Classifique as células em um tubo preparado ou placas multi-poços. Um exemplo de estratégia de gating é mostrado na Figura 2. NOTA: Para minimizar as etapas de manipulação e acelerar o protocolo, recomenda-se a aplicação de uma estratégia de gating rigorosa (sugerida na Figura 2) em vez de usar uma coloração de viabilidade. Para separar as células imunes da população isolada, a coloração de anticorpos CD45 pode ser realizada. Para isso, resuspend suspensão celular em 100 μL de solução de coloração (PBS + 2% FBS + anticorpo conjugado anti-CD45-APC 1/100 diluição). Incubar por 15 minutos no gelo protegido da luz e executar FACS diretamente.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Estudar dentes e ossos no nível celular ou molecular é geralmente desafiador, uma vez que as células que formam esses tecidos são cercadas por diferentes tipos de matrizes duras19. Um dos principais objetivos para a realização de RNA-seq unicelulares no tecido dental é a necessidade de obter células de interesse rapidamente e sem alterações artificiais em seus transcriptomes. Para isso, foi desenvolvido um protocolo altamente eficiente adequado para isolar células de fábulas de dentes de camundongos e humanos, o que permite a rápida geração de suspensões unicelulares para todas as aplicações transcriômicas. Isso foi assegurado pelo isolamento rápido do tecido, minimizando os passos das manipulações teciduais e celulares, e agilizando a digestão mecânica e enzimática.
As etapas mais críticas deste protocolo são o processamento rápido do tecido e a preparação adequada de suspensão unicelular8,9. Uma abordagem manual é usada para obter polpas dentárias sem utilizar uma broca dentária ou outros dispositivos geradores de calor. O superaquecimento pode causar uma expressão artificial de proteínas de choque térmico e outros genes, levando, em última análise, aos padrões analisados de expressão genética não representativos do tecido original20. A colheita manual de tecidos pode ser um passo desafiador que provavelmente precisará de algum treinamento de antemão. A polpa é então cortada em pequenos pedaços e digerida enzimática a 37 °C. Com exceção dos 15-20 min de digestão enzimática, todo o protocolo é realizado a 4 °C. O processamento tecidual e especialmente a digestão enzimática foram minimizados ao menor tempo possível, uma vez que uma incubação mais prolongada a 37 °C pode causar alterações nos padrões de expressão genética10. Recomenda-se a remoção mecânica da dentina antes da digestão enzimática. A dentina e a predentina anexada à polpa contêm uma grande quantidade de colágeno, e sua presença excessiva pode diminuir a eficácia da solução de digestão. Após ser removido do corpo (ou morte de organismos), foi demonstrado que as células começam a modificar seus padrões de expressão genética rapidamente12. Portanto, o isolamento e o processamento das células devem ser realizados o mais rápido possível. O protocolo atual reduz o tempo de processamento para 35-45 minutos desde a isolação do tecido (animal eutanizador) até o preparo da suspensão unicelular.
Uma modificação alternativa desta técnica é a preservação celular para uso posterior. Isso é conseguido pela fixação do metanol. A suspensão celular fixada com metanol pode ser armazenada por até 1 mês a -80 °C, conforme descrito no protocolo21. No entanto, sempre que possível, execute o scRNA-seq diretamente, uma vez que foi demonstrado que os dados unicelulares de suspensões unicelulares fixas por metanol podem sofrer de aumento da expressão de genes relacionados ao estresse e contaminação com RNA22 ambiente. Esta etapa pode precisar de modificações adicionais de acordo com os protocolos do fabricante.
Antes da primeira aplicação deste protocolo, recomenda-se a realização de várias etapas de validação para testar a técnica. Pela nossa experiência, sugerimos testar as etapas críticas acima mencionadas do protocolo. Além disso, sugerimos testar a eficácia da solução P de colagenase e testar o manuseio da etapa de dissociação tecidual. Especificamente, cerca de 5 minutos após o início da incubação P de colagem, os pedaços de tecido devem se agregar juntos. Esta é uma situação comum. Os agregados são desintegrados a cada 3-4 min usando uma pipeta de 1 mL, e com o tempo crescente, eles devem ficar menores até que mal visíveis.
Além disso, recomenda-se realizar a contagem de células em uma câmara de contagem de células antes da centrifugação e antes e depois da filtragem para detectar possíveis perdas celulares devido à remoção de supernantes subótimos. Se a suspensão única final precisar ser purificada, o FACS pode ser usado. A classificação celular permite não apenas remover detritos ou células mortas, mas, importante, permite enriquecer a suspensão final com células fluorescentes rotuladas13,19. Para evitar o estresse da tesoura ou entupimento do classificador de células, é utilizado um bocal largo (85 μm ou 100 μm). Isso melhorará ainda mais a viabilidade das células classificadas.
Esta técnica foi projetada e testada em dentes humanos e de camundongos. O principal fator limitante é o pequeno número de células nas polpas dentárias reduzidas dos dentes de camundongos mais velhos (molares) e humanos. Suponha que um número maior de células precise ser obtida ou células dos dentes de pacientes mais velhos devem ser adquiridas. Uma solução possível é processar um número maior de dentes e mesclá-los em um único lote, posteriormente processados como uma amostra.
As células vivas da polpa dentária humana foram isoladas há mais de vinte anos usando uma mistura enzimática de colagemnase I e dispase23. Desde então, os isolamentos das células de polpa dentária tornaram-se amplamente utilizados, e várias técnicas têm sido utilizadas5,6,7,8. O significado crítico do método aqui apresentado é a adaptação de todas as etapas de isolamento para tornar o isolamento rápido e suave para garantir a alta qualidade da suspensão celular final para scRNA-seq. O maior rendimento celular pode ser obtido por uma incubação mais prolongada com enzimas. Este protocolo fornece uma solução eficiente para a obtenção rápida de células únicas a partir de dentes de camundongos e humanos de qualidade adequada para sequenciamento de RNA unicelular. Espera-se que esta técnica seja amplamente utilizada para outros tecidos ou organismos com apenas pequenas modificações técnicas.

O sequenciamento de RNA unicelular é uma poderosa ferramenta para decifrar a estrutura populacional de células in vivo, hierarquia, interações e homeostase1,2. No entanto, seus resultados dependem fortemente do primeiro passo desta análise avançada - a preparação de uma suspensão unicelular de perfeita qualidade fora do tecido complexo e bem organizado. Isso engloba manter as células vivas e prevenir mudanças artificiais indesejadas nos perfis de expressão genética das células3,4. Tais mudanças podem levar à caracterização imprecisa da estrutura populacional e à má interpretação dos dados coletados.
Protocolos específicos para o isolamento de uma ampla gama de tecidos foram desenvolvidos5,6,7,8. Eles geralmente empregam dissociação mecânica em combinação com mais incubação com várias enzimas proteolíticas. Estes geralmente incluem trippsina, colagens, despases, papain6,7,8,9, ou misturas enzimáticas disponíveis comercialmente, como Accutase, Tryple, etc.5. A parte mais crítica que afeta a qualidade do transcriptome é a digestão enzimática. Mostrou-se que a incubação prolongada com enzimas a 37 °C influencia a expressão genética e causa a regulação de muitos genes relacionados ao estresse10,11,12,13. O outro parâmetro crítico do processo de isolamento é o seu comprimento geral, como foi demonstrado que os transcriptomes celulares mudam após a isquemia tecidual14. Este protocolo apresenta um protocolo eficiente para o isolamento suave de células únicas de dentes de camundongos e humanos, mais rápido do que outros protocolos anteriormente utilizados para isolamento de células de tecidos complexos5,6,9,11,13,15,16.
Este protocolo apresenta como dissecar rapidamente o tecido mole do dente duro e preparar uma suspensão unicelular adequada para scRNA-seq. Este método emprega apenas uma etapa de centrifugação e minimiza o efeito de alterações transcricionais indesejadas, reduzindo o tempo de manuseio e digestão do tecido e mantendo o tecido e as células a 4 °C na maior parte do tempo. O procedimento mostra o isolamento das células dos incisivos de camundongos, molar e dentes do siso humano como exemplo, mas principalmente deve trabalhar para outros dentes em vários organismos. O protocolo completo é estrategicamente visualizado na Figura 1. Este protocolo tem sido usado recentemente para gerar um atlas tipo células odontológicas obtido a partir de dentes de camundongos e humanos1.

<table><tbody><tr><td>Anticorpo anti-camundongo APC CD45</td><td>BioLegend</td><td>103112</td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Albumina Fração V</td><td>Roche</td><td>10735078001</td><td></td></tr><tr><td>CellTrics 50 &micro; m, estéril</td><td>Sysmex</td><td>04-004-2327</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase P (COLLP-PRO)Lâminas</td> de bisturi <td></td><td>Roche 11213857001</td><td></td></tr><tr><td>CUTFIX, Fig. 10</td> Lâminas de bisturi <td>AESCULAP</td><td>16600495</td><td></td></tr><tr><td>CUTFIX, Fig. 11</td> Soro bovino fetal <td>16600509</td><td></td><td>AESCULAP</td></tr><tr><td>(América do Sul),</td><td>Biossoro</td> de endotoxina ultrabaixa <td>FB-1101/500</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina balanceada de Hank (HBSS) sem Ca2+ e Mg2+</td><td>SIGMA</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Toalhetes industriais de baixa formação de fiapos, MAX60</td><td>Dirteeze</td><td>MAX60B176</td><td></td></tr><tr><td>Pinças industriais fortes, estilo 660, pontas pontiagudas serrilhadas dobradas, 150mm</td><td>Value-Tec</td><td>50-014366</td><td></td></tr><tr><td>Álcool metílico A.G.</td><td>Penta</td><td>21210-11000</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Iodeto de Propídio</td><td>BioLegend</td><td>421301</td><td></td></tr><tr><td>Cabo de bisturi</td><td>CM Instrumente</td><td>AG-013-10</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas 10mL, embaladas individualmente, 200 unid.</td><td>CAPP</td><td>SP-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio estéreo</td><td>Leica</td><td>EZ4</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica (9cm)</td><td>CM Instrumente</td><td>AI-430-09Y</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos &Oslash; 100 mm</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento rápido de células únicas de dentes humanos e de camundongos

Rapid Isolation of Single Cells from Mouse and Human Teeth

Os dentes de camundongos e humanos representam órgãos desafiadores para o isolamento rápido e eficiente das células para transcrição unicelular ou outras aplicações. O tecido de polpa dentária, rico na matriz extracelular, requer um longo e tedioso processo de dissociação que é tipicamente além do tempo razoável para transcrição de células únicas. Para evitar mudanças artificiais na expressão genética, o tempo decorrido da eutanásia de um animal até que a análise de células únicas precisa ser minimizada. Este trabalho apresenta um protocolo rápido que permite obter suspensão unicelular de dentes de camundongos e humanos em uma excelente qualidade adequada para scRNA-seq (sequenciamento de RNA unicelular). Este protocolo baseia-se em etapas aceleradas de isolamento tecidual, digestão enzimática e preparação subsequente da suspensão final de células únicas. Isso permite o processamento rápido e suave dos tecidos e permite o uso de mais amostras animais ou humanas para a obtenção de suspensões celulares com alta viabilidade e alterações transcricionais mínimas. Espera-se que este protocolo possa orientar pesquisadores interessados em realizar o scRNA-seq não apenas no rato ou dentes humanos, mas também em outros tecidos extracelulares ricos em matriz, incluindo cartilagem, tecido conjuntivo denso e dermis.

O isolamento exemplar de células individuais foi realizado a partir de dois incisivos mandibulares de um rato C57BL/6 de 6 semanas de idade. Seguindo este protocolo, foi preparada uma suspensão unicelular e, posteriormente, foi realizada sequenciamento unicelular. A suspensão de célula única preparada foi analisada e classificada utilizando FACS (Figura 2). Em primeiro lugar, o plotagem FSC-A (dispersão para a frente, área) e SSC-A (dispersão lateral, área) foi aplicado, e uma estratégia de gating apropriada foi usada para selecionar uma população com tamanho e granularidade esperados para filtrar nossos detritos celulares e dobras celulares ou agregados (Figura 2A). Esta população selecionada (P1), contando 38% de todos os eventos, foi utilizada, e os parâmetros FSC-A e FSC-H (dispersão dianteira, altura) foram aplicados para remover os dobradores de célula restantes (Figura 2B). A população sem doublets de células (P2) contando 95% do P1 pode ser posteriormente utilizada para scRNA-seq. Alternativamente, o gating adicional pode ser usado para selecionar a população de interesse (por exemplo, expressão de proteínas fluorescentes ou coloração viva/morta). Para verificar o número de células vivas/mortas na suspensão final, foi realizada a coloração do PI (iodeto de propídio) (Figura 2C). A população P3 contendo células PI- (vivas) foi de 98,4% da população P2 pai e 35,5% do total de eventos. O número total de células filtradas e mortas (PI+) foi de 1887.
O número final de células obtidas sem coloração de viabilidade adequada para RNA-seq (P2) contabilizou 118.199 células de duas polpas incisivos de camundongos. Isso significa o número de quase 60.000 células vivas de um incisivo mandibular.
Para esclarecer o número de células imunes na suspensão final de células únicas, foram utilizadas duas abordagens. Em primeiro lugar, foram utilizadas a coloração de anticorpos CD45 e a análise subsequente do FACS. Como método complementar, analisou-se o número total de células imunes (CD45+) em dados de scRNA-seq. A análise FACS mostrou 14,44% das células CD45+ (13,20% vivas e 1,24% mortas) (Figura 3A). A análise dos dados do SCRNA-seq mostrou 10,90% das células expressas por CD45 (Figura 3B). A diminuição das células CD45+ em dados scRNA-seq pode ser causada por limiares adicionais durante a análise scRNA-seq.
Esses dados representativos sobre o exemplo do incisivo do mouse mostram que o protocolo dado em combinação com a estratégia de gating estrita é eficiente na obtenção de um alto número de células de um único dente de rato sem a necessidade de uso adicional de coloração de viabilidade. A proporção de células imunes (CD45+) foi menor (13,2%). Além disso, foi demonstrado anteriormente que as células imunes são essenciais na manutenção da homeostase dentária, por isso removê-las da análise scRNA-seq durante o FACS seria contraproducente em algumas aplicações.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63043/63043fig01.jpg"> Figura 1: Representação esquemática do protocolo. Diferentes passos, incluindo condições de temperatura e tempo esperado, são representados para preparar a suspensão unicelular de dentes de camundongos e humanos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63043/63043fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63043/63043fig02.jpg"> Figura 2: Exemplo da estratégia de gating. FSC-A e SSC-A foram usados para produzir o portão P1, refletindo a população celular com tamanho e granularidade esperados e filtrando os detritos da matriz celular e extracelular e a maioria dos grandes eventos (A). Posteriormente, a população P1 foi plotada na trama FSC-H e FCS-A, que filtrava os duplos celulares (B). Essa população P2 foi então analisada para a presença de células mortas por iodeto de propídio (C). O número de eventos/células por portão está representado em (D). (FSC-A - dispersão para a frente, área; SSC-A - dispersão lateral, área; FSC-H - dispersão dianteira, altura; PI - iodeto de propídio). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63043/63043fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63043/63043fig03.jpg"> Figura 3: Quantificação das células imunes. A quantificação das células imunes foi realizada pela análise FACS de células manchadas com anticorpo anti-CD45 e análise live/dead utilizando coloração de iodeto de propídio (A). Maior quantificação das células imunes foi realizada durante a análise de scRNA-seq (B). (CD45-APC - anticorpo conjugado anti-CD45 aofiliacocyanina; PI - iodeto de propidium; t-SNE - t-distributed estocástico vizinho incorporando). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63043/63043fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura suplementar 1: Visão geral do processo de dissecção da mandíbula. Linhas tracejadas ilustram cortes sugeridos. TMJ - articulação temporomandibular, m. masseter - musculus masseter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63043/Supplementary%20figure%201.png" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Tabela Suplementar 1: As composições das soluções utilizadas no estudo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63043/Supplemental%20table%201.docx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta Tabela.</a>

O protocolo atual apresenta um método rápido, eficiente e suave para isolar células únicas adequadas para análise de RNA-seq unicelular a partir de um incisivo de rato em crescimento contínuo, molar de rato e dentes humanos.

Isolamento rápido de células únicas de dentes humanos e de camundongos

Mouse and human teeth represent challenging organs for quick and efficient cell isolation for single-cell transcriptomic or other applications. The dental ...

A qualidade da suspensão unicelular preparada é crucial para obter resultados de alta qualidade e confiáveis para qualquer metodologia de omics unicelular. E este protocolo mostrará como isolar as células de forma rápida, suave e robusta de tecidos até mesmo muito desafiadores. A principal vantagem deste protocolo é o processamento simplificado de tecidos que permite a dissociação tecidual e o isolamento das células de um grande número de amostras em um curto espaço de tempo com perfeita qualidade.Embora este método tenha sido desenvolvido para dentes de camundongos e humanos, também pode ser aplicado para outros tecidos extracelulares ricos em matriz, incluindo cartilagem, osso ou tecido conjuntivo denso. O procedimento de isolar polpas dentárias de dentes humanos e especialmente de camundongos é manualmente desafiador. Aconselhamos a todos que testem isso antes que os experimentos de verdade comecem.Para começar, segure o rato eutanizado atrás de sua cabeça olhando para o aspecto ventral de sua cabeça para que a cauda se destaque. Usando a tesoura pequena e afiada, remova rapidamente a pele da mandíbula para expor o arco mandibular, o tecido mole entre cada metade das mandíbulas e os músculos faciais adjacentes. Para fazer um corte profundo de cada lado da mandíbula, primeiro corte através do masseter ao longo do lado bucal da mandíbula até a articulação temporomandibular e, em seguida, corte ao longo da parte interna de cada metade da mandíbula através da base da cavidade oral.Corte todos os músculos e ligamentos ao longo da mandíbula até a articulação temporomandibular tanto de fora quanto dentro da cavidade oral. Segure a mandíbula usando a pinça de ponta dobrada e remova-a. Em seguida, com a tesoura, corte através da profífisis mandibular para dividir a mandíbula dissecada em duas metades.Use uma limpeza industrial de fiapos baixos para chafe o tecido mole restante de cada metade da mandíbula. Depois que ambas as partes da mandíbula forem limpas, coloque-as em uma placa de Petri pré-preparada com HBSS gelado. Para a dissecção de incisivos mandibulares, remova a crista alveolar com os três molares e quebre transversamente o arco mandibular no local correspondente à posição entre o primeiro e o segundo molar.Puxe cuidadosamente o incisivo para fora do resto da tomada dentária. Se necessário, remova os fragmentos restantes de osso presos ao incisivo com pinças e um bisturi. Coloque os incisivos dissecados em HBSS frios frescos.Depois de dissecar o tecido de interesse, coloque o tecido mole dissecado em uma gota de HBSS gelado fresco no meio de uma placa de Petri de 10 centímetros mantida no gelo. Usando uma lâmina de bisturi em forma redonda 10, corte o tecido nos menores pedaços possíveis. Depois de reagregar os pedaços de tecido no meio da gotícula, corte repetidamente os agregados teciduais com a mesma lâmina de bisturi e repita esse processo até que o material seja suficientemente picado.Transfira as peças de tecido desfiado usando uma ponta de pipeta de um mililitro em uma mistura de digestão previamente preparada. Em seguida, coloque o tubo em um ângulo de 60 graus e defina a velocidade para 150 a 200 RPM para garantir movimentos constantes de suspensão dentro do tubo e incubar por 15 a 20 minutos. Após cada três a quatro minutos durante a incubação, titula vigorosamente a suspensão usando uma ponta de pipeta de um mililitro para desintegrar todos os aglomerados.No final da incubação, depois de titular a suspensão celular pela última vez, adicione lentamente a solução de lavagem gelada a um volume final de 12 mililitros. Centrifugar a suspensão celular a 300 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius e, em seguida, remova cuidadosamente o supernasce com uma pipeta sorológica de 10 mililitros. Resuspenja a pelota na solução de lavagem para alcançar a concentração final de 700 a 1.200 células por microliter.Passe a suspensão celular através de um coador de células de 50 micrômetros para remover os aglomerados ou pedaços restantes de tecido calcificado e manter o tubo no gelo até um processamento adicional. Em seguida, para a classificação celular fluorescente ativada, carregue as células em um tubo preparado. Carregue o tubo no classificador celular e configure uma estratégia de gating rigorosa para remover detritos celulares, dobras e células mortas, conforme descrito no manuscrito do texto.Primeiro, a coloração de anticorpos CD45 e a análise subsequente do FACS foram utilizadas para esclarecer o número de células imunes na suspensão única final. Como método complementar, analisou-se o número total de células imunes positivas cd45 nos dados de sequenciamento de RNA unicelulares. Utilizando FACS, foram identificadas células positivas 14,44%CD45.A análise dos dados de sequenciamento de RNA unicelulares mostrou que 10,9% das células expressas por CD45 e a diminuição das células em dados de sequenciamento de RNA unicelulares poderia ser causada por limiares adicionais durante a análise de sequenciamento. As coisas-chave são ser rápidos e manter este tecido ou células no gelo sempre que possível. O número de células isoladas pode ser muito baixo especialmente durante o isolamento molar do rato.Evite a perda de celular. Reduzir o tempo de isolamento unicelular é muito importante para o sucesso de todos os experimentos unicelulares. E este método específico realmente permitiu reduzir esse tempo e abrir caminho para o tipo de células odontológicas de alta qualidade para sistemas de camundongos e humanos.

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Research

JoVE Journal

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Aprenda a isolar células únicas de dentes humanos e de camundongos com este protocolo rápido e eficiente. Este método preserva a viabilidade celular para análise de RNA sequenciamento de célula única em pesquisas odontológicas.

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