Name: Métodos espectrofotométricos para o estudo do metabolismo do glicogênio eucariótico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Aprenda métodos espectrofotométricos para estudar o metabolismo do glicogênio eucariótico sem isótopos radioativos. Estas técnicas acessíveis medem atividade de enzimas como glicogênio sintase com segurança e baixo custo.

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O autor gostaria de agradecer a Karoline Dittmer e Andrew Brittingham por seus insights e muitas discussões úteis. Este trabalho foi apoiado em parte por doações do Iowa Osteopathic Education and Research Fund (IOER 03-17-05 e 03-20-04).

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<li>Dittmer, K. E., Pradhan, P., Tompkins, Q. C., Brittingham, A., Wilson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+glycogen+branching+and+debranching+enzymes+from+the+parasitic+protist+Trichomonas+vaginalis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of glycogen branching and debranching enzymes from the parasitic protist Trichomonas vaginalis.</a> Biochimie. 186, 59-72 (2021).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse conhecidos associados a este trabalho e não houve apoio financeiro para este trabalho que pudesse ter influenciado o seu resultado.

Em geral, as principais vantagens de todos os métodos apresentados são seu baixo custo, facilidade, velocidade e falta de dependência de equipamentos especializados. A principal desvantagem que todos eles compartilham é a sensibilidade em comparação com outros métodos disponíveis. A sensibilidade dos procedimentos que envolvem a produção ou o consumo de NADH/NADPH é fácil de estimar. Dado que o coeficiente de extinção do NADH/NADPH é de 6,22 M-1 cm-1, a aritmética simples indica que ~10-20 μM de mudanças na co...

O glicogênio é amplamente distribuído na natureza, com o composto sendo encontrado em bactérias, muitos protistas, fungos e animais. Nos microrganismos, o glicogênio é importante para a sobrevivência celular quando os nutrientes são limitantes e, em organismos superiores, como mamíferos, a síntese e a degradação do glicogênio servem para tamponar os níveis de glicose no sangue 1,2,3. O estudo do metabolismo do glicogênio é, portanto, de importância para campos tão diversos como a microbiologia e a fisiologia dos mamíferos. Compreender o metabolismo do glicogênio requer estudar as principais enzimas da síntese de glicogênio (glicogênio sintase e a enzima ramificada) e degradação do glicogênio (glicogênio fosforilase e enzima desramificadora). Os ensaios padrão-ouro de glicogênio sintase, fosforilase, atividades enzimáticas ramificadas e desramificantes empregam isótopos radioativos. Por exemplo, a glicogênio sintase é geralmente medida em um ensaio radioquímico interrompido seguindo a incorporação de glicose de UDP-[14 C]glicose (no caso de enzimas animais e fúngicas) ou ADP-[14C]glicose (no caso de enzimas bacterianas) no glicogênio 4,5. Da mesma forma, a glicogênio fosforilase é medida na direção da síntese de glicogênio, após a incorporação de glicose de [14C]glicose-1-fosfato em glicogênio6. A enzima ramificada é ensaiada medindo a capacidade desta enzima de estimular a incorporação de [14 C]glicose da glicose-1-fosfato em cadeias ligadas a α1,4 pela glicogênio fosforilase7, e a atividade enzimática de desramificação é determinada seguindo a capacidade da enzima de incorporar [14C]glicose no glicogênio8 . Embora muito sensíveis, permitindo seu uso em extratos de células brutas com baixos níveis de atividade enzimática, os substratos radioativos são caros e sujeitos aos requisitos regulatórios inerentes ao uso de radioisótopos. Essas barreiras colocam o uso de certos ensaios fora do alcance de muitos trabalhadores. No entanto, ao longo de muitos anos, uma impressionante variedade de abordagens espectrofotométricas para a medição dessas enzimas foram descritas. Em geral, essas abordagens dependem da medição da produção ou consumo de NADH / NADPH, ou a geração de complexos coloridos entre glicogênio e iodo. Assim, eles são simples e podem ser realizados usando espectrofotômetros simples equipados apenas com lâmpadas de tungstênio ou xenônio.
Os ensaios espectrofotométricos da glicogênio sintase dependem da medição do difosfato nucleosídeo liberado do doador de nucleotídeos de açúcar à medida que a glicose é adicionada à crescente cadeia de glicogênio 9,10. O procedimento para medir a atividade da glicogênio sintase descrito na seção 1 do protocolo, abaixo, é uma modificação do delineado por Wayllace et al.11, e o esquema de acoplamento é mostrado abaixo:
(Glicose) n + UPD-glicose → (Glicose)n+1 + UDP
UDP + ATP → ADP + UTP
ADP + fosfoenolpiruvato → piruvato + ATP
Piruvato + NADH + H + Lactato de → + NAD +
A glicogênio sintase adiciona glicose da UDP-glicose ao glicogênio. O UDP gerado neste processo é convertido em UTP pelo nucleosídeo difosfato quinase (NDP quinase), em uma reação que gera ADP. O ADP, por sua vez, serve então como substrato para a piruvato quinase, que fosforila o ADP usando fosfoenolpiruvato como doador de fosfato. O piruvato resultante é convertido em lactato pela enzima lactato desidrogenase em uma reação que consome NADH. O ensaio pode, portanto, ser realizado de forma contínua, monitorando a diminuição da absorvância a 340 nm à medida que o NADH é consumido. É prontamente adaptado para uso com enzimas que requerem ADP-glicose como um doador de glicose. Aqui, as etapas de acoplamento são mais simples, uma vez que o ADP liberado pela ação da glicogênio sintase é diretamente atuado pela piruvato quinase.
Há uma variedade de ensaios espectrofotométricos disponíveis para a determinação da atividade da glicogênio fosforilase. Na versão clássica, a enzima é conduzida para trás, na direção da síntese de glicogênio, como mostrado abaixo:
(Glicose) n + Glicose-1-fosfato → (Glicose)n+1 + Pi
Em intervalos cronometrados, as alíquotas da mistura reacional são removidas e a quantidade de fosfato liberado é quantificada12,13. Em nossas mãos, este ensaio tem sido de uso limitado devido à presença de fosfato livre prontamente mensurável em muitas preparações comerciais de glicose-1-fosfato, combinado com as altas concentrações de glicose-1-fosfato necessárias para a ação da fosforilase. Em vez disso, temos empregado rotineiramente um ensaio alternativo que mede a glicose-1-fosfato liberado à medida que o glicogênio é degradado pela fosforilase13. Um esquema de reação acoplado, ilustrado abaixo, é empregado.
(Glicose) n + Pi → (Glicose)n-1 + Glicose-1-fosfato
Glicose-1-fosfato → Glicose-6-fosfato
Glicose-6-fosfato + NADP+ → 6-fosfogluconolactona + NADPH + H+
A glicose-1-fosfato é convertida em glicose-6-fosfato pela fosfoglucomutase, e a glicose-6-fosfato é então oxidada em 6-fosfogluconolactona, com a concomitante redução de NADP+ para NADPH. O procedimento detalhado na seção 2 do protocolo, a seguir, é derivado dos métodos descritos por Mendicino et al.14 e Schreiber & Bowling 15. O ensaio pode ser prontamente realizado de forma contínua, com o aumento da absorbância a 340 nm ao longo do tempo, permitindo a determinação da taxa de reação.
A determinação espectrofotométrica da atividade enzimática desramificadora baseia-se na mensuração da glicose liberada pela ação da enzima sobre a dextrina limite de fosforilase16. Este composto é feito através do tratamento exaustivo do glicogênio com glicogênio fosforilase. Uma vez que a ação da glicogênio fosforilase pára 4 resíduos de glicose de distância de um ponto de ramificação α1,6, a dextrina limite contém glicogênio, cujas cadeias externas foram encurtadas para ~ 4 resíduos de glicose. O preparo da dextrina limite de fosforilase é descrito aqui, utilizando-se um procedimento derivado daqueles desenvolvidos por Taylor et al.17 e Makino & Omichi 18.
A desramificação é um processo de duas etapas. A atividade da 4-α-glucanotransferase da enzima desramificadora bifuncional primeiro transfere três resíduos de glicose do ponto de ramificação para a extremidade não redutora de uma cadeia de glicose ligada a α1,4 próxima. O único resíduo de glicose ligado a α1,6 remanescente no ponto de ramificação é então hidrolisado pela atividade da α1,6-glucosidase19. O ensaio é tipicamente realizado de forma interrompida, a glicose liberada após um determinado tempo (ou série de vezes) sendo medida em um ensaio enzimático acoplado, conforme mostrado abaixo:
(Glicose) n → (Glicose)n-1 + Glicose 
Glicose + ATP → Glicose-6-fosfato + ADP
Glicose-6-fosfato + NADP+ → 6-fosfogluconolactona + NADPH + H+
A determinação do NADPH produzido fornece uma medida da produção de glicose. O procedimento descrito na seção 3 do protocolo, a seguir, baseia-se em um descrito por Nelson et al.16. Como os outros métodos que dependem do consumo ou geração de NADH / NADPH, o ensaio é bastante sensível. No entanto, a presença de amilases ou outras glucosidases, que também podem liberar glicose livre da dextrina limite de fosforilase, causará interferência significativa (ver Discussão).
A determinação colorimétrica da atividade enzimática ramificada baseia-se no fato de que cadeias de glicose ligadas a α1,4 adotam estruturas helicoidais que se ligam ao iodo, formando complexos coloridos20. A cor do complexo formado depende do comprimento das cadeias ligadas a α1,4. Assim, a amilose, que consiste em cadeias longas, em grande parte não ramificadas, de glicose ligada a α1,4, forma um complexo azul profundo com iodo. Em contraste, os glicogênios, cujas cadeias externas são geralmente da ordem de apenas 6 a 8 resíduos de glicose de comprimento, formam complexos vermelho-alaranjados. Se uma solução de amilose é incubada com enzima ramificada, a introdução de ramos na amilose resulta na geração de cadeias de glicose mais curtas ligadas a α1,4. Assim, o máximo de absorção dos complexos amilose/iodo muda para comprimentos de onda mais curtos. O procedimento discutido aqui é derivado do detalhado por Boyer & Preiss21 e a atividade enzimática ramificada é quantificada como uma redução na absorção do complexo amilose/iodo a 660 nm ao longo do tempo.
Como deve ser facilmente aparente a partir da discussão acima, o fato de que as cores dos complexos formados entre as cadeias de iodo e α1,4-glicose variam com o comprimento da cadeia significa que os espectros de absorvância dos complexos glicogênio/iodo devem variar com o grau de ramificação do glicogênio. Este é de fato o caso, e glicogênios / glicogênios menos ramificados com cadeias externas mais longas absorvem a luz em um comprimento de onda mais longo do que os glicogênios que são mais ramificados / têm cadeias externas mais curtas. A reação de coloração de iodo pode, portanto, ser usada para obter dados qualitativos rápidos sobre o grau de ramificação do glicogênio22. A cor laranja-marrom se forma quando os complexos de glicogênio com iodo não são particularmente intensos. No entanto, o desenvolvimento da cor pode ser potencializado pela inclusão de solução saturada de cloreto de cálcio22. Isso aumenta a sensibilidade do método cerca de 10 vezes e permite a análise pronta das quantidades de microgramas de glicogênio. O ensaio para a determinação da ramificação descrito na seção 4 do protocolo, a seguir, é adaptado de um procedimento desenvolvido por Krisman22. É realizado simplesmente combinando a amostra de glicogênio com solução de iodo e cloreto de cálcio em uma cubeta e coletando o espectro de absorção de 330 nm a 800 nm. A absorbância máxima muda para comprimentos de onda mais longos à medida que o grau de ramificação diminui.
Coletivamente, os métodos aqui descritos fornecem meios simples e confiáveis de avaliar as atividades das principais enzimas do metabolismo do glicogênio e de obter dados qualitativos sobre a extensão da ramificação do glicogênio.

<table><tbody><tr><td>Amilopectina (sem amilose) de milho ceroso</td><td>Fisher Scientific</td><td>A0456</td><td></td></tr><tr><td>Amylose</td><td>Biosynth Carbosynth</td><td>YA10257</td><td></td></tr><tr><td>ATP, sal dissódico</td><td>MilliporeSigma</td><td>A3377</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose-1,6-bifosfato, sal de potássio</td><td>MilliporeSigma</td><td>G6893</td><td></td></tr><tr><td>D-glicose-6-fosfato, sal de sódio</td><td>MilliporeSigma</td><td>G7879</td><td></td></tr><tr><td>Glicose-6-fosfato desidrogenase, Grau I, de levedura</td><td>MilliporeSigma</td><td>10127655001</td><td></td></tr><tr><td>Glicogênio, Tipo II de ostra</td><td>MilliporeSigma</td><td>G8751</td><td></td></tr><tr><td>Hexoquinase</td><td>MilliporeSigma</td><td>11426362001</td> Cuvetes de <td></td></tr><tr><td>metacrilato, 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-128</td><td>O metacrilato é necessário, pois alguns procedimentos são conduzido a 340 nm ou menos</td></tr><tr><td>&beta;-Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato sal de sódio</td><td>MilliporeSigma</td><td>N0505</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Nicotinamida adenina dinucleotídeo, sal dissódico reduzido</td><td>MilliporeSigma</td><td>43420</td><td></td></tr><tr><td>Nucleosídeo 5'-difosfato quinase</td><td>MilliporeSigma</td><td>N0379</td><td></td></tr><tr><td>Fosfoenolpiruvato, sal</td> <td>monopotássicoMilliporeSigma</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>Fosfoglucomutase do músculo de coelho</td><td>MilliporeSigma</td><td>P3397</td><td></td></tr><tr><td>Fosforilase A do músculo de coelho</td><td>MilliporeSigma</td><td>P1261</td><td></td></tr><tr><td>Enzimas piruvato quinase / desidrogenase láctica do músculo de coelho</td><td>MilliporeSigma</td><td>P0294</td><td></td></tr><tr><td>UDP-glicose, sal dissódico</td><td>MilliporeSigma</td><td>U4625</td><td></td></tr></tbody></table>

métodos espectrofotométricos para o estudo do metabolismo do glicogênio eucariótico

Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism

O glicogênio é sintetizado como uma forma de armazenamento de glicose por uma ampla gama de organismos, variando de bactérias a animais. A molécula compreende cadeias lineares de resíduos de glicose ligados a α1,4 com ramos introduzidos através da adição de ligações α1,6. Compreender como a síntese e degradação do glicogênio são reguladas e como o glicogênio atinge sua estrutura ramificada característica requer o estudo das enzimas de armazenamento de glicogênio. No entanto, os métodos mais comumente usados para estudar essas atividades enzimáticas normalmente empregam reagentes ou técnicas que não estão disponíveis para todos os investigadores. Aqui, discutimos uma bateria de procedimentos que são tecnicamente simples, econômicos e, ainda assim, capazes de fornecer informações valiosas sobre o controle do armazenamento de glicogênio. As técnicas requerem acesso a um espectrofotômetro, operando na faixa de 330 a 800 nm, e são descritas assumindo que os usuários empregarão cuvetes plásticas descartáveis. No entanto, os procedimentos são facilmente escaláveis e podem ser modificados para uso em um leitor de microplacas, permitindo análises altamente paralelas.

Determinação da atividade da glicogênio sintase A Figura 1 mostra resultados representativos de ensaios de glicogênio sintase utilizando enzimas purificadas. No painel A, após um ligeiro atraso, houve uma diminuição linear na absorção a 340 nm ao longo do tempo por um período de cerca de 12 min. A taxa de mudança na absorção na Figura 1A foi de ~0,12 unidades de absorbância/min. Uma taxa de mudança na absorbância entre ~0,010 e ~0,20 unidades...

Técnicas para medir a atividade de enzimas-chave do metabolismo do glicogênio são apresentadas, usando um espectrofotômetro simples operando na faixa visível.

Métodos espectrofotométricos para o estudo do metabolismo do glicogênio eucariótico

Glycogen is synthesized as a storage form of glucose by a wide array of organisms, ranging from bacteria to animals. The molecule comprises linear chains ...

Os protocolos são significativos, pois evitam o uso de isótopos radioativos e removem uma barreira que pode impedir muitos trabalhadores de estudar enzimas do metabolismo do glicogênio. Os procedimentos descritos são baratos, exigindo apenas acesso a um espectrofotômetro simples. Para começar com a determinação da atividade da glicogênio sintase, descongele as soluções-estoque previamente preparadas de UDP glicose, ATP, fosfoenolpiruvato e NDP quinase no gelo.Pré-aqueça um banho-maria a 30 graus Celsius. Quando as soluções-mãe estiverem prontas, preparar uma mistura de ensaio suficiente de acordo com o número de ensaios de glicogénio sintase, adicionando os reagentes a um tubo de 15 mililitros, conforme descrito no protocolo de texto. Prepare uma reação em branco, substituindo o NADH da mistura de reação com a água e transfira a reação para uma cubeta de metacrilato descartável.Use a reação em branco para definir zero no espectrofotômetro no comprimento de onda de 340 nanômetros. Pegue uma alíquota de 770 microlitros da mistura de reação em um tubo de 1,5 mililitro e adicione sequencialmente dois microlitros cada de mistura de NDP quinase e piruvato quinase lactato desidrogenase ao

spectrophotometric-methods-for-study-eukaryotic-glycogen

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este vídeo descreve um ensaio espectrofotométrico para a estimativa da atividade da glicogênio sintase. O método baseia-se na redução da absorbância do NADH com o tempo e indica a atividade da glicogênio sintase.

Ensaio espectrofotométrico para determinar a atividade da glicogênio sintase

Neste vídeo, descrevemos um ensaio espectrofotométrico qualitativo para determinar a extensão da ramificação em uma amostra de glicogênio com uma estrutura não caracterizada. A comparação dos máximos de absorbância da amostra não caracterizada com os de polissacarídeos com estruturas ramificadas conhecidas indica a presença de ramificação na amostra não caracterizada.

Ensaio de ramificação de glicogênio para medir o grau de ramificação de glicogênio

Descrevemos aqui um método bioquímico exato, reprodutível e conveniente para a titulação de glicogênio in vitro. Esta técnica utiliza o kit de ensaio Abcam do glicogénio e é baseado na hidrólise sucessiva de glicogênio a glicose e glicose titulação por fluorescência.

Titulação Bioquímica de glicogênio<em&gt; In vitro</em

A coloração com ácido periódico de Schiff é uma técnica que visualiza o conteúdo de polissacarídeos dos tecidos. Este artigo demonstra o protocolo de coloração de Schiff com ácido periódico adaptado para uso em células mononucleares do sangue periférico purificadas de sangue venoso humano. Essas amostras são enriquecidas para linfócitos e outros glóbulos brancos do sistema imunológico.

Detecção de glicogênio no sangue periférico células mononucleares com Periodic Acid Schiff Coloração

Aqui, apresentamos um ensaio confiável e fácil para medir o teor de glicogênio em células cianobacterianas. O procedimento implica a precipitação, despolimerização selecionável e a detecção de resíduos de glicose. Este método é adequado para ambas as variedades de tipo selvagem e geneticamente modificado e pode facilitar a engenharia metabólica de cianobactérias.

Determinação do conteúdo de glicogênio em cianobactérias

Uma concentração ótima de sacarose foi determinada para a extração de glicogênio hepático usando centrifugação por gradiente de densidade de sacarose. A adição de uma etapa de ebulição de 10 min para inibir enzimas degradadoras de glicogênio mostrou-se benéfica.

A extração de moléculas de glicogênio hepático para determinação da estrutura do glicogênio

Um procedimento pós-fixação modificado aumenta o contraste das partículas de glicogênio no tecido. Este artigo fornece um protocolo passo-a-passo descrevendo como lidar com o tecido, conduzir a imagem e usar métodos esterológicos para obter dados imparciales e quantitativos sobre a distribuição de glicogênio subcelular específico do tipo de fibra no músculo esquelético.

Quantificação da Distribuição de Glicogênio Subcelular em Fibras Musculares Esqueléticas usando Microscopia eletrônica de transmissão

O ensaio de tecido animal utiliza detecção de cintilação nuclear para determinar a atividade enzimática da glicogênio sintase medindo a incorporação de glicose radiomarcada no glicogênio.

Avaliação radioquímica da atividade da enzima glicogênio sintase em tecido animal

Descrevemos aqui um método novo, robusto e eficiente de purificação por afinidade em tandem (TAP) para a expressão, isolamento e caracterização de complexos proteicos de células eucarióticas. Este protocolo pode ser utilizado para a caracterização bioquímica de complexos discretos, bem como a identificação de novos interagentes e modificações pós-traducionais que regulam sua função.

A purificação de afinidade em tandem de complexos de proteínas a partir de células eucarióticas

Nós descrevemos uma extração de pequena escala modificada e ensaios colorimétricos de lactato e piruvato no nemátodo elegans do c.. Quando utilizando kits de ensaio comercial, o desenvolvimento técnico da sua sensibilidade e a precisão é importante. Precipitação de proteínas em extração é o passo mais crítico para a determinação quantitativa de metabólitos intracelulares.

Em pequena escala colorimétrica ensaios de intracelular lactato e piruvato no nemátode Caenorhabditis elegans

Aprenda métodos espectrofotométricos para estudar o metabolismo do glicogênio eucariótico sem isótopos radioativos. Estas técnicas acessíveis medem atividade de enzimas como glicogênio sintase com segurança e baixo custo.

Métodos espectrofotométricos para o estudo do metabolismo do glicogênio eucariótico

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