Name: Aprimoramento do relaxamento paramagnético para detecção e caracterização de auto-associações de proteínas intrinsecamente desordenadas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Aprenda a usar espectroscopia de RMN com relaxação paramagnética para detectar interações fracas em proteínas intrinsecamente desordenadas. Este protocolo permite quantificar estados dinâmicos invisíveis a outras técnicas.

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Agradecemos aos Drs. Jinfa Ying e Kristin Cano pelas discussões úteis e assistência técnica. A DSL é St. Baldrick's Scholar e reconhece o apoio da St. Baldrick's Foundation (634706). Este trabalho foi apoiado em parte pela Fundação Welch (AQ-2001-20190330) para DSL, o Fundo Max e Minnie Tomerlin Voelcker (Voelcker Foundation Young Investigator Grant para DSL), UTHSA Start-Up Funds para DSL, e uma bolsa de pós-graduação Greehey em Saúde Infantil para CNJ. Este trabalho é baseado em pesquisas conduzidas nas Instalações do Núcleo de Biologia Estrutural, parte dos Núcleos de Pesquisa Institucionais do Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Texas em San Antonio, apoiados pelo Escritório do Vice-Presidente de Pesquisa e pelo Mays Cancer Center Drug Discovery and Structural Biology Shared Resource (NIH P30 CA054174).

Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito. Não são declarados conflitos de interesse.

Um método para caracterizar interações transitórias que existem em populações baixas entre proteínas intrinsecamente desordenadas e vários parceiros de ligação usando PRE foi apresentado. No exemplo mostrado, a proteína é auto-associativa e, portanto, a PRE pode surgir de uma combinação de interações inter e intramoleculares. Este método é prontamente estendido para amostras heterogêneas onde as interações entre duas proteínas diferentes podem ser caracterizadas. Informações complementares sobre como diferentes regiões d...

A desordem intrínseca (DI) descreve proteínas (IDPs) ou regiões dentro de proteínas (IDRs) que não se dobram espontaneamente em estruturas secundárias ou terciárias estáveis, mas são biologicamente ativas. Geralmente, a função das IDPs/IDRs é facilitar interações específicas, porém reversíveis, com biomoléculas em condições fisiológicas1. Assim, IDPs e IDRs estão envolvidas em uma variedade de funções celulares, incluindo recrutamento, organização e estabilização de complexos multiproteicos, por exemplo, a montagem e atividade do spliceossomo2, recrutamento e organização de componentes em locais de dano ao DNA3, organização e estabilização do recrutamento de complexos de transcrição4, ou do remodelador de cromatina BAF5. Além disso, os IDPs são encontrados em nexos de sinalização, onde sua promiscuidade para diferentes parceiros de ligação lhes permite mediar a transferência de informações através de redes de proteínas celulares6. Trabalhos recentes também revelaram uma propensão para regiões IDR se auto-associarem formando condensados biomoleculares através do processo de separação de fases líquido-líquido7. Acredita-se que muitas das funções acima mencionadas envolvendo ID também envolvam algum aspecto da formação do condensado8. Apesar da importância do ID para montagem de complexos biomoleculares, estabilização, andaimes e transdução de sinal, os detalhes atômicos de suas interações específicas são difíceis de identificar, uma vez que IDPs e IDRs normalmente não são passíveis de investigações estruturais usando cristalografia de raios X ou microscopia eletrônica criogênica.
A ressonância magnética nuclear (RMN) é uma técnica ideal para investigar a DI, pois não depende da presença de conjuntos estruturais rígidos ou homogêneos, mas relata o ambiente local imediato de núcleos individuais. A frequência de ressonância, ou deslocamento químico, de um núcleo em uma dada molécula é influenciada por campos magnéticos fracos induzidos pela distribuição eletrônica local, que por sua vez é dependente de comprimentos de ligação, ângulos, proximidade de outros núcleos, interações com parceiros de ligação e outros fatores9. Assim, cada núcleo atua como uma sonda estrutural única, sítio-específica, sensível a mudanças em seu ambiente químico local. Apesar dessas vantagens, a RMN é uma técnica de massa, e o deslocamento químico observado é a média de todos os ambientes amostrados por um determinado núcleo. Uma série de técnicas de RMN, muitas das quais são descritas neste número, foi desenvolvida para recuperar informações estruturais, dinâmicas e cinéticas sobre conformações biomoleculares de alta energia e baixa densidade populacional contidas no deslocamento químico médio10,11. Embora transitoriamente povoados, a identificação e quantificação desses estados são importantes para determinar os detalhes dos mecanismos funcionais12. Por exemplo, no caso de IDPs e IDRs, o conjunto conformacional pode ser enviesado para amostras preferenciais de conformações que são produtivas para a formação de complexos de encontro com parceiros de ligação fisiológicos. A detecção desses estados, bem como a identificação das interações e dinâmicas inter e intramoleculares específicas do resíduo, são importantes para determinar os mecanismos estruturais subjacentes da função proteica e da formação de complexos.
Um protocolo para o uso de RMN de realce de relaxação paramagnética (PRE) para investigar estados transitórios e pouco povoados importantes para a formação de complexos biomoleculares mediados por IDP/IDR é descrito13. Essa abordagem é útil para estudar as interações proteína-proteína transitórias, como as que promovem a montagem de fibrilas amiloides a partir da α-sinucleína 14,15 ou a autoassociação de USF16, bem como para caracterizar interações proteína-proteína específicas, como entre proteínas sinalizadoras17. Um exemplo de PDI auto-associado é apresentado, onde interações inter e intramoleculares específicas resultam em estados preferencialmente compactados, bem como interações sítio-específicas que impulsionam a auto-associação.
O PRE surge da interação dipolar magnética de um núcleo a um centro paramagnético com um tensor g isotrópico, comumente fornecido na forma de um elétron não pareado em um grupo de nitróxidos ou como um átomo de metal paramagnético18 (Figura 1). Enquanto átomos com tensores g anisotrópicos também produzem um efeito PRE, a análise desses sistemas é mais difícil devido aos efeitos de confusão contribuídos pelos deslocamentos de pseudocontato (PCS) ou acoplamento dipolar residual (RDC)13,19. A força da interação entre um núcleo e o centro paramagnético é dependente da distância <r-6> entre os dois. Essa interação resulta em um aumento nas taxas de relaxação nuclear, o que causa um alargamento detectável da linha mesmo para interações de longo alcance (~10-35 Å), porque o momento magnético do elétron não pareado é muito forte20,21. A detecção de estados transitórios com o PRE é possível se as duas condições seguintes forem atendidas; (1) a interação transitória está em troca rápida na escala de tempo de RMN (o deslocamento químico observado é uma média ponderada pela população dos estados de troca); e (2) a distância núcleos/centro paramagnético é menor no estado transitoriamente povoado do que no estadomaior11. O PRE transversal é indicado Γ2 e, para fins práticos, é calculado a partir da diferença nas taxas de relaxação transversal de 1H entre uma amostra contendo um centro paramagnético e um controle diamagnético. Para um tratamento aprofundado da teoria da PRE e dos respectivos deslocamentos de pseudocontato em regimes de troca rápida e lenta, remete-se o leitor às revisões abrangentes de Clore e colaboradores 13,22. Aqui, considera-se apenas a situação em que 1H N-Γ2 está no regime de troca rápida, onde devido à dependência r-6 do PRE, a taxa de relaxamento observada está relacionada tanto com a distância a que o centro paramagnético se aproxima do núcleo quanto com a quantidade de tempo que ele gasta nessa conformação. Portanto, conformações transitórias que não envolvem uma abordagem próxima produzem um PRE pequeno, enquanto interações mais próximas, mesmo que de curta duração, produzirão um PRE maior.
Para IDPs, o PRE é usado para medir e diferenciar as interações que ocorrem dentro de uma única molécula (intramolecular) e entre moléculas separadas (intermolecular). Ao anexar um centro paramagnético a uma proteína de RMN visível (por exemplo, marcada com 15N) ou invisível de RMN (por exemplo, abundância natural de 14N), a fonte (inter ou intramolecular) do PRE pode ser determinada (Figura 2). A mutagênese sítio-dirigida que introduz um resíduo de cisteína é uma abordagem conveniente para anexar um centro paramagnético (spin-label) a uma proteína23. Vários tipos de moléculas têm sido propostos para uso como spin labels, incluindo quelantes de metais (à base de EDTA) e radicais livres (à base de nitróxido)24. Vários marcadores de spin de nitroóxido foram descritos e estão disponíveis com diferentes químicas reativas à cisteína, como metanetiossulfonato, maleimida e iodoacetamida25,26 (Figura 1). A flexibilidade inerente do tag ou do linker pode ser problemática para certas análises e, nessas situações, diferentes estratégias têm sido propostas para limitar o movimento do tag, como a adição de grupos químicos volumosos ou o uso de um segundo ligante para ancorar o tag à proteína (dois locais de fixação)27, 28º. Além disso, etiquetas comercialmente disponíveis podem conter proteínas diastereoméricas, mas geralmente isso não contribuirá para a PRE observada29. O uso do 3-Maleimido-PROXYL ligado a uma cisteína livre via química da maleimida é descrito por ser prontamente disponível, custo-efetivo, não reversível, e o agente redutor tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) pode ser mantido na solução durante toda a reação de marcação. Como o 3-Maleimido-PROXYL possui um tensor g isotrópico, nenhum PCS ou RDCs é induzido, e as mesmas atribuições de deslocamento químico podem ser usadas tanto para as amostras paramagnéticas quanto diamagnéticas13.
O 1HN-T 2 é medido usando uma estratégia de dois pontos de tempo (T a, Tb) que já se mostrou tão precisa quanto coletar uma série completa de evolução consistindo de 8 a 12 pontos de tempo30. O primeiro ponto de tempo (T a) é definido tão próximo de zero quanto possível, e o comprimento ótimo do segundo ponto de tempo é dependente da magnitude do maior PRE esperado para uma dada amostra e pode ser estimado a partir de: Tb ~ 1,15/(R 2,dia + Γ 2) onde R 2,dia representa o R 2 da amostra diamagnética13. Se a magnitude dos maiores PREs é desconhecida, definir T b para ~ uma vez o 1H T 2 da proteína é uma boa estimativa inicial e ainda mais otimizada ajustando T2 para melhorar o sinal ao ruído. Essa estratégia de medição de dois pontos reduz significativamente o tempo experimental necessário para medir PREs e permite tempo para mais médias de sinal, particularmente porque amostras relativamente diluídas são usadas para minimizar os efeitos de contatos não específicos entre moléculas. Uma sequência de pulso baseada em HSQC é usada para medir 1H N-T2 e foi descrita em detalhes em outra publicação30. Para melhorar a sensibilidade, os pulsos duros das transferências INEPT para frente e para trás podem ser substituídos por pulsos moldados; alternativamente, a sequência é prontamente convertida para uma leitura baseada em TROSY31. Uma vez que os IDPs tipicamente têm taxas de relaxamento transversal muito mais longas, resultando em larguras de linha mais estreitas (devido à desordem inerente) do que proteínas globulares de tamanho semelhante, longos tempos de aquisição na dimensão indireta podem ser usados para melhorar a resolução espectral e aliviar a limitação de dispersão de deslocamento químico inerente aos IDPs.
PRE é uma ferramenta útil para estudar interações proteína-proteína e proteína-ácido nucleico, particularmente interações que são transitórias ou pouco povoadas. Um protocolo detalhado para a preparação de uma amostra de RMN adequada para medir PREs, incluindo etapas para purificação de proteínas, marcação de spin direcionada ao local, configuração e calibração do programa de pulso, processamento e interpretação dos dados de RMN, é fornecido. Considerações experimentais importantes são observadas ao longo do tempo que podem afetar a qualidade dos dados e os resultados experimentais, incluindo a concentração da amostra, a seleção do spin-label e a remoção de componentes paramagnéticos.

<table><tbody><tr><td>0,45 &micro; m e 0,22 &micro; Filtros de seringa</td><td>Millipore Sigma</td><td>SLHVM33RS SLGVR33RS</td><td>Filtre o lisado antes da primeira etapa de purificação e antes da cromatografia de exclusão de tamanho.</td></tr><tr><td>Placa de Petri de 100 mm</td><td>Placas de ágar FB0875713 Fisher</td><td></td><td>para transformação bacteriana.</td></tr><tr><td>14N Cloreto de amônio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>576794</td><td>O uso de 15N em meio M9 produzirá uma proteína visível de RMN, 14N produzirá uma proteína invisível de RMN</td></tr><tr><td>15N Cloreto de amônio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>299251</td><td>O uso de 15N em meio M9 produzirá uma proteína visível de RMN, 14N produzirá uma proteína invisível de RMN</td></tr><tr><td>3 L de frasco defletor de Fernbach</td><td>Corning</td><td>431523</td><td>Cultura de expressão bacteriana</td></tr><tr><td>3-Maleimido-Proxyl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>253375</td><td>Rótulo de rotação de nitróxido</td></tr><tr><td>50 mL tubos de centrífuga cônicos</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-432-22</td><td>Solução/proteína armazenamento</td></tr><tr><td>Filtro centrífugo Amicon</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC900308</td><td>Concentração de proteínas</td></tr><tr><td>Ampicillan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5354</td><td>Antibiótico para um marcador seletivo, a escolha exata depende da expressão plasmídeo de construção</td></tr><tr><td>Balança analítica</td><td>Oahus</td><td>30061978</td><td>Explorer Pro, para pesagem de reagentes</td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>AX1775</td><td>Reduz o rótulo de rotação de nitróxido</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td></td><td></td><td>Esterilizar vidraria e meios de cultura</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901</td><td>Componente de mídia M9</td></tr><tr><td>Frascos de centrífuga</td><td>Thermo Fisher</td><td>010-1459</td><td>Colher células de E. coli após expressão de proteína recombinante</td></tr><tr><td>Centrífuga, manivela</td><td>Thomas Scientific</td><td>0241C68</td><td>Centrífuga manual de baixa velocidade Boekel com baldes de 15 mL que podem acomodar tubos de RMN</td></tr><tr><td>Chelex 100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7901</td><td>Remova compostos paramagnéticos contaminantes de soluções tampão</td></tr><tr><td>Estação de trabalho</td><td></td><td></td> de computador <td>Linux ou Mac OS compatível com pacotes de software de processamento e análise de dados de RMN, como NMRPipe e Sparky</td></tr><tr><td>Óxido de deutério</td><td>Sigma Aldrich</td><td>151882</td><td>Necessário para o sinal de bloqueio de NMR</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9434</td><td>M9 componente de mídia</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5136</td><td>M9 componente de mídia</td></tr><tr><td>Reagente de Ellman (5,5-ditio-bis- (ácido 2-nitrobenzóico)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>22582</td><td>Quantificação de resíduos de cistiene livre Tubos de</td></tr><tr><td>centrífuga de alta velocidade</td><td>Thermo Fisher</td><td>3114-0050</td><td>Usado para limpar lisado bacteriano.</td></tr><tr><td>Instrumento de RMN de alto campo (600 - 800 MHz)</td><td>Bruker</td><td></td><td>Equipado com uma sonda criogênica multicanal e coluna IMAC de controle de temperatura</td></tr><tr><td>, HisTrap FF</td><td>Cytvia</td><td>17528601</td><td>Fracionamento inicial do lisado bacteriano bruto</td></tr><tr><td>Isopropil B-D-tiogalactosídeo (IPTG)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6758</td><td>Induz a expressão de proteínas para genes sob controle do operador lac</td></tr><tr><td>Ágar LB</td><td>Thermo Fisher</td><td>22700025</td><td>Os itens são usados para transformar E. coli para expressar proteína de interesse, substições para qualquer um desses itens com produtos semelhantes são aceitáveis.</td></tr><tr><td>Caldo LB</td><td>Thermo Fisher</td><td>12780052</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de cromatografia de baixa pressão</td><td>Bio-Rad</td><td>7318300</td><td>BioRad BioLogic é usado para chomatógrafo de baixa pressão, como colunas IMAC em execução</td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td>M9 componente de mídia</td></tr><tr><td>Sistema de cromatografia de média pressão</td><td>Bio-Rad</td><td>7880007</td><td>BioRad NGC equipado com um detector de vários comprimentos de onda, monitores de pH e condutividade e coletor automático de frações</td></tr><tr><td>Solução de vitamina MEM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6895</td><td>M9 componente de mídia</td></tr><tr><td>Microfluidizer</td><td>Avestin</td><td>EmulsiFlex-C3</td><td>Fornece lise celular bacteriana rápida e eficiente</td></tr><tr><td>Micropipetas</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>Conjunto calibrado de micropipetas com pontas descartáveis devidamente ajustadas (disponíveis em vários fabricantes, por exemplo, Eppendorf)</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1551139</td><td>M9 componente de mídia</td></tr><tr><td>Pipetas de RMN</td><td>Sigma Aldrich</td><td>255688</td><td>Para remover amostra do tubo de RMN Tubo de amostra de</td></tr><tr><td>RMN</td><td>NewEra</td><td>NE-SL5</td><td>Adequado para espectrômetros</td></tr> <tr><td>de RMN de alto campoCentrífuga preparativa</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti J-HC</td><td>Colheita de células de E. coli após expressão de proteína recombinante</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de poliestireno de fundo redondo</td><td>Corning</td><td>352057</td><td>Lisado bacteriano transparente</td></tr><tr><td>Incubadora de agitação</td><td>Eppendorf</td><td>S44I200005</td><td>Crescimento controlado por temperatura de culturas iniciais e de expressão de E. coli</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5886</td><td>Componente de mídia M9</td></tr><tr><td>Sonicação banho-maria e fonte de vácuo</td><td>Thomas Scientific</td><td></td><td>Usado para desgaseificar soluções tampão</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Thermo Fisher</td><td>FB505110</td><td>Usado para lise celular bacteriana ou cisalhamento de DNA bacteriano</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro</td><td>Implen</td><td>OD600 Dilufotômetro</td><td>Monitore o crescimento de culturas de expressão de proteínas E.coli</td></tr><tr><td>Superdex 200 16/600 tamanho exculsão colum</td><td>Cytvia</td><td>28989333</td><td>Etapa final de purificação de proteínas</td></tr><tr><td>Software Topspin, versão 3.2 ou posterior</td><td>Bruker</td><td></td><td>Software operacional para o instrumento de RMN</td></tr><tr><td>Células de E. coli competentes para transformação</td><td>Thermo Fisher</td><td>C600003</td><td>One Shot BL21 Star (DE3) E. coli quimicamente competente, outras cepas podem ser compatíveis</td></tr><tr><td>Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP)</td><td>ThermoFisher</td><td>20490</td><td>Agente redutor compatível com algumas conjugações sulfidril-reativas</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro UV-Vis</td><td>Implen</td><td>NP80</td><td>Medir a concentração de proteínas.</td></tr><tr><td>Banho-maria, temperatura controlada</td><td>ThermoFisher</td><td>FSGPD25</td><td>Para a etapa de choque térmico da transformação bacteriana</td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y1625</td><td>Para suplementar o meio M9, se necessário</td></tr></tbody></table>

aprimoramento do relaxamento paramagnético para detecção e caracterização de auto-associações de proteínas intrinsecamente desordenadas

Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins

Proteínas intrinsecamente desordenadas e regiões intrinsecamente desordenadas dentro das proteínas compõem uma grande e funcionalmente significativa parte do proteoma humano. A natureza altamente flexível dessas sequências permite que elas formem interações fracas, de longo alcance e transitórias com diversos parceiros biomoleculares. Interações específicas, mas de baixa afinidade, promovem ligação promíscua e permitem que um único segmento intrinsecamente desordenado interaja com uma infinidade de locais-alvo. Devido à natureza transitória dessas interações, elas podem ser difíceis de caracterizar por métodos de biologia estrutural que dependem de proteínas para formar uma única conformação predominante. A RMN de aumento por relaxação paramagnética é uma ferramenta útil para identificar e definir a base estrutural de interações fracas e transitórias. Um protocolo detalhado para o uso de aprimoramento de relaxamento paramagnético para caracterizar os complexos de encontro pouco povoados que se formam entre proteínas intrinsecamente desordenadas e sua proteína, ácido nucleico ou outros parceiros biomoleculares é descrito.

PREs 1 HN-Γ 2 intramolecularesforam registrados em um fragmento auto-associado, intrinsecamente desordenado (resíduos 171-264) derivado do domínio de baixa complexidade da proteína ligadora de RNA EWSR142 (Figura 3). Espera-se que os resíduos em estreita proximidade sequencial com o ponto de fixação do rótulo de spin (por exemplo, resíduos 178 ou 260 na Figura 3) sejam significativamente ampliados...

Um protocolo para a aplicação de espectroscopia de RMN de realce por relaxação paramagnética para detectar interações inter e intramoleculares fracas e transitórias em proteínas intrinsecamente desordenadas é apresentado.

Aprimoramento do relaxamento paramagnético para detecção e caracterização de auto-associações de proteínas intrinsecamente desordenadas

Intrinsically disordered proteins and intrinsically disordered regions within proteins make up a large and functionally significant part of the human ...

A técnica de realce por relaxação paramagnética pode ser utilizada para caracterizar e medir distâncias intermoleculares e quantificar interações biomoleculares transitórias e/ou pouco povoadas. Aqui, aplicamos essa técnica para capturar interações que precedem a condensação de proteínas. A sensibilidade dos PREs permite a identificação, detecção e quantificação de resolução atômica de estados dinâmicos que permanecem invisíveis e inacessíveis a outras técnicas de RMN.As principais etapas deste protocolo incluem a remoção da etiqueta de spin de nitroóxido não conjugado e a análise cuidadosa dos espectros para medir com precisão a altura do pico. Além disso, deve-se ter cautela durante a instalação do experimento de RMN e calibração do pulso. Para começar, adicione 3-maleimido-PROXYL de uma solução estoque a 20 vezes o excesso molar da proteína marcada isotopicamente 15N de interesse.Incubar durante a noite à temperatura ambiente ou quatro graus Celsius protegido da luz e do oxigénio e com balanço suave ou nutação. No dia seguinte, remova o rótulo de spin livre não reagido para evitar PRE de solvente não específico usando diálise extensiva da amostra de proteína ou filtração em gel. Em seguida, use o reagente de Ellman para quantificar grupos sulfidrila livres na solução.Meça a absorbância usando um leitor de microplacas e construa a curva padrão. Para medir a PRE intramolecular, preparar proteína marcada com spin isotopicamente enriquecida com 15N para uma concentração de pelo menos 100 micromolares, mas não superior a 300 micromolares, em um tampão adequado para RMN. Em seguida, usando uma pipeta de vidro de haste longa ou micropipeta, transfira a amostra de RMN para um tubo de RMN de cinco milímetros apropriado para uso em ímãs de alto campo.Coloque a amostra no ímã. Bloqueie o sinal de deutério usando o comando lock e sintonize e combine o canal de prótons de acordo com os protocolos da instalação. Em seguida, ajuste os calços usando a sub-rotina do calço superior para otimizar a supressão do sinal do solvente.Em seguida, calibre o pulso de prótons usando o programa P-OPT. Em seguida, calibre o pulso de 15N contra uma amostra padrão. Determine a atenuação correta para pulsos moldados usando a sub-rotina da ferramenta de forma.Em seguida, abra o arquivo de forma de pulso apropriado clicando no ícone de pasta. Os pulsos em forma são encontrados na seção de parâmetros de pulso dos parâmetros de aquisição. Depois de carregar o arquivo de definição de pulso, clique em Analisar Forma de Onda, seguido por Integrar Forma.Insira o próton calibrado pulso duro de 90 graus, o comprimento de pulso de forma desejado e a rotação. Em seguida, calcule o nível de potência do pulso em forma adicionando a mudança do nível de potência à atenuação para o pulso calibrado de 90 graus. Registre um HSQC de próton 15N padrão para otimizar a largura de varredura, a frequência da portadora e verificar a supressão de água.Finalmente, ajuste a largura da varredura e o número de incrementos de dimensão indireta usando os comandos SW e TD ou diretamente nas caixas de diálogo apropriadas. Calibre os pulsos em forma conforme demonstrado anteriormente. Em seguida, insira os comprimentos de pulso calibrados na seção de parâmetros de pulso na guia Parâmetros de aquisição.Para medir o próton amida T2 usando a abordagem de dois pontos de atraso de tempo, defina os atrasos de tempo editando o arquivo de lista VD. O primeiro atraso é definido como 0,01 milissegundos. Usando a relação com o PRE máximo esperado, escolha o segundo atraso.Em seguida, determine um valor adequado comparando os primeiros incrementos do primeiro e segundo espectros de atraso e ajustando o segundo atraso de tal forma que o sinal decaia para entre 40 a 50% do seu valor inicial. Determine o número de pontos complexos a serem registrados e o número de varreduras para obter uma média de sinal suficiente. Em seguida, use o comando EXPT para calcular o tempo de experimento e iniciar o experimento com o comando ZG. Depois de dissolver o ascorbato de sódio no tampão de RMN, ajuste o pH para corresponder ao do tampão de RMN original.Em seguida, adicione o ácido ascórbico ao tubo de RMN em um excesso molar de 10 vezes sobre a concentração do rótulo de spin, colocando uma gotícula abaixo da borda do tubo. Tampe o tubo e inverta cuidadosamente para misturar. Gire a 200 a 400 G por 10 a 20 segundos em uma centrífuga manual para fixar a amostra no fundo do tubo.Depois de envolver o tubo em papel alumínio, deixe a reação prosseguir por pelo menos três horas. Em seguida, registre o próton amida T2 na amostra diamagnética usando os mesmos parâmetros usados para a amostra paramagnética. Os PREs gama de prótons amida intramoleculares foram registrados em um fragmento auto-associado intrinsecamente desordenado derivado do domínio de baixa complexidade da proteína ligadora de RNA EWSR1.Espera-se que os resíduos em estreita proximidade sequencial com o ponto de fixação da etiqueta de spin sejam significativamente ampliados e não sejam detectáveis no espectro. Os resíduos que foram espaçados sequencialmente a partir do ponto de fixação, mas mostraram gama aumentada, estavam espacialmente próximos ao rótulo de spin. No caso de proteínas intrinsecamente desordenadas, o registro e a análise de purês produzirão informações sobre contatos intramoleculares e superfícies de interação transitórias.A combinação de medições PRE com outros métodos biofísicos, como espalhamento dinâmico de luz, cromatografia de exclusão de tamanho, ultracentrifugação analítica e métodos computacionais, pode fornecer insights mais profundos. A medição do PRE auxilia na caracterização de um estado transitório escassamente povoado. Esta abordagem pode ser expandida para caracterizar interações importantes para uma miríade de processos biológicos, tais como reconhecimento molecular, seleção conformacional alostérica e processos de montagem, incluindo a montagem de organelas sem membrana via separação de fases.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

O objetivo desta experiência é determinar e controlar o tamanho, forma e estabilidade da auto-montagem anfifílicos discotic na água. Para aquosos baseados em polímeros supramoleculares tal nível de controle é muito difícil. Nós aplicamos uma estratégia usando ambas as interações repulsivas e atrativas. As técnicas experimentais aplicadas para caracterizar este sistema são amplamente aplicáveis.

Controlando o tamanho, forma e estabilidade de Polímeros Supramoleculares na Água

Este artigo descreve métodos para marcação de spin dirigida ao local e reconstituição de canais controlados por ligantes pentaméricas para estudos de ressonância paramagnética eletrônica. Este protocolo pode ser adaptado para qualquer proteína de membrana. O método de reconstituição descrito aqui também pode ser usado para medições de patch clamp de correntes macroscópicas e de canal único em um sistema lipídico definido.

Local Dirigido Labeling rotação e EPR espectroscópicos Estudos de Canais pentamérica Ligand-Gated Ion

Descrevemos aqui um método para identificar fosforilações múltiplas de uma proteína intrinsecamente desordenada por Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN), usando a proteína Tau como estudo de caso. A Tau recombinante é isotopicamente enriquecida e modificada in vitro por uma quinase antes da aquisição e análise dos dados.

Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear para a identificação de múltiplas fosfolarização de intrinsecamente desordenados Proteínas

Estruturas de conjuntos supramoleculares proteína em resolução atômica são de alta relevância, por causa de seus papéis cruciais em uma variedade de fenômenos biológicos. Neste documento, apresentamos um protocolo para realizar estudos estruturais de alta resolução em assemblies de proteína macromolecular insolúvel e não cristalina por magia-ângulo girando espectroscopia da ressonância magnética nuclear Solid-State (MAS SSNMR).

Escala atômica estudos estruturais de conjuntos macromoleculares por espectroscopia de estado sólido da ressonância magnética Nuclear

Nós apresentamos um protocolo para medir a dependência do campo magnético do tempo do abrandamento da girar-estrutura de 13C-compostos enriquecidos, hyperpolarizado por meio da polarização nuclear dinâmica, usando o relaxometry Field-Cycled rápido. Especificamente, temos demonstrado isso com [1-13C] piruvato, mas o protocolo pode ser estendido para outros substratos hiperpolarizados.

Medindo a dependência do campo magnético do abrandamento da girar-estrutura de Hyperpolarizado [1-13C] piruvato

Aqui, é fornecida uma descrição detalhada do protocolo implementado no laboratório para aquisição e análise de perfis de dispersão de relaxamento de 15N por espectroscopia de solução NMR.

15 N CPMG Relaxation Dispersão para a Investigação da Dinâmica Conformacional de Proteínas na escala de tempo μs-ms

Aqui, apresentamos um protocolo detalhando a aquisição, processamento e análise de uma série de experimentos de RMN destinados a caracterizar as interações proteína-glicano em solução. As metodologias mais comuns baseadas em ligantes e proteínas são descritas, o que, sem dúvida, contribui para os campos da glicobiologia estrutural e estudos de reconhecimento molecular.

Desembaraçando as interações glicano-proteína: ressonância magnética nuclear (RMN) para o resgate

A espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) pode caracterizar a dinâmica estrutural da proteína de maneira específica do resíduo. Fornecemos um protocolo prático para registrar experimentos de relaxamento de RMN 15N R1 e R2 e {1H}-15N heteronuclear Overhauser effect (hetNOE), sensíveis à escala de tempo de picossegundos a nanossegundos.

Experimentos de relaxamento de RMN 15N para a investigação da dinâmica estrutural de proteínas de picossegundos a nanossegundos

Espectroscopia de ressonância paramagnética (EPR) de elétrons é um método inequívoco para medir radicais livre. A utilização de sondas de rotação seletiva permite detecção de radicais livres em diferentes compartimentos celulares. Apresentamos um método prático e eficiente para coletar amostras biológicas que facilitam a tratar, armazenar e transferir amostras para medições de EPR.

Uso de ressonância paramagnética electrónica em amostras biológicas em temperatura ambiente e 77 K

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado descrevendo uma fluorescente nova técnica para detecção de proteínas totais em gel de poliacrilamida de coloração. O protocolo utiliza uma sonda de excitante prata íon-específicos de fluorescência, que detecta Ag+-complexos de proteínas e elimina determinadas limitações de manchas de prata cromogênica tradicionais.

Coloração fluorescente de prata das proteínas em gel de poliacrilamida

Aprenda a usar espectroscopia de RMN com relaxação paramagnética para detectar interações fracas em proteínas intrinsecamente desordenadas. Este protocolo permite quantificar estados dinâmicos invisíveis a outras técnicas.

Aprimoramento do relaxamento paramagnético para detecção e caracterização de auto-associações de proteínas intrinsecamente desordenadas (Vídeo) | JoVE Journal

Aprimoramento do relaxamento paramagnético para detecção e caracterização de auto-associações de proteínas intrinsecamente desordenadas

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