Melhorando a reprodutibilidade para atender informações mínimas para estudos de diretrizes extracelulares de vesículas 2018 em análise de rastreamento de nanopartículas

Este protocolo foi desenvolvido para operadores novatos do NanoSight LM10. Seguindo as instruções passo a passo, podem ser obtidos resultados precisos e reprodutíveis. Esta técnica ajuda a garantir resultados consistentes em várias corridas de teste, independentemente do nível de habilidade do usuário.

A caracterização de nanopartículas, especialmente a quantificação, continua a ser um desafio no campo de pesquisa de vesículas extracelular. Este protocolo permite uma análise consistente de tamanho e concentração de nanopartículas em suspensão. Comece limpando as superfícies de vidro do módulo laser com uma lente de boa qualidade limpador e papel de lente.

Antes da montagem do módulo, certifique-se de que o selo o-ring esteja devidamente sentado na ranhura da tampa da célula de fluxo. Em seguida, coloque a tampa da célula de fluxo no módulo laser, garantindo que os contatos elétricos estejam na orientação adequada. Em seguida, coloque os quatro parafusos de polegar carregados de mola através da placa da célula de fluxo e engaje os fios do módulo laser sem apertar individualmente.

Ao colocar pressão uniforme na tampa da célula de fluxo, aperte uniformemente os parafusos do polegar de forma diagonal alternada até ficar confortável. Lave duas seringas de tuberculina de um mililitro com adaptadores de bloqueio de deslizamento três vezes com um mililitro de DPBS. Remova e descarte o êmbolo da primeira seringa tuberculina antes de inserir a seringa na porta restante para servir como um diluído ou reservatório de amostra vazio.

Em seguida, encha a segunda seringa com um mililitro de DPBS e conecte-a à porta de entrada da tampa da célula de fluxo. Segure o módulo laser inclinado com a porta de seringa de saída elevada para permitir que o ar seja expurgado da câmara à medida que o DPBS é injetado lentamente no módulo laser. Lave o DPBS restante do módulo laser injetando um mililitro de ar na porta de entrada.

Repita a descarga duas vezes. Após a última descarga, esvazie o módulo laser o mais completamente possível e carregue o módulo para foco e posicionamento. Abra o software.

Sob a guia de captura na caixa de canto superior esquerdo, clique na câmera iniciar. Se a câmera desligar automaticamente após cinco minutos, clique em iniciar a câmera para reiniciá-la. Na mesma guia, ajuste o nível da câmera para 14 a 16 para iluminar a linha laser e simplificar a identificação e o foco das partículas.

Movendo o controle deslizante superior do lado esquerdo da parte da cabeça para dentro ou para fora, desvie a imagem da câmera para as oculares. No campo de visão, encontre a área de maior densidade, referida como impressão digital e central, e concentre a impressão digital verticalmente. No campo de visão, centralize a linha laser e mova o controle deslizante superior para desviar a luz para a câmera, como observado na tela do computador.

A imagem na tela do computador é uma imagem espelhada da vista nas oculares do microscópio. Ajuste o foco para aguçar a imagem de partículas móveis individuais na tela com o botão de foco. Para carregar as amostras, elave um mililitro da amostra em uma seringa de tuberculina de um mililitro enxaguado e conecte a seringa à porta de entrada da tampa celular de fluxo.

Continue avançando o êmbolo até que o fluido fique evidente na seringa aberta presa à porta de saída. O módulo deve ser inclinado para permitir que o ar seja expurgado do módulo laser. Na visão da câmera, mova o foco para a direita da linha laser para uma área de um número uniforme de partículas.

Ajuste a orientação vertical para centralizar as faixas horizontais de luz e refocar até que o maior número de partículas esteja à vista. Certifique-se de manter a posição do foco consistente para todas as medidas subsequentes. Ajuste o nível da câmera ao ponto em que o símbolo de informações escuras pisca intermitentemente no canto superior direito da visão da câmera.

Para análise de rastreamento de nanopartículas, ou NTA, defina a duração para 30 ou 60 segundos e o número de vídeos para cinco. Para alterar o nome de arquivo base existente, clique na guia de um novo site de armazenamento para obter dados gerados com um novo nome de arquivo. Em seguida, verifique a caixa de temperatura alvo para inserir a temperatura desejada e clique em criar script para reutilizar a medição padrão.

Uma vez que a amostra esteja carregada e o experimento esteja pronto para ser executado, clique em criar e executar o script. No relatório definido detalha a tela pop-up, preencha os campos com as informações necessárias sobre o operador, amostra e diluente. Quando todos os campos desejados tiverem sido preenchidos, clique em configurações OK para iniciar o script.

Antes de cada captura de vídeo, procure um prompt para avançar o êmbolo manualmente. Injete aproximadamente 0,05 mililitros da amostra na câmara laser. À medida que as partículas vêm descansar, clique em OK. Ao completar a quinta captura de vídeo, uma caixa de confirmação de configurações aparecerá junto com a caixa de processo.

Como os quadros são avançados manualmente a partir da parte inferior da tela de vídeo, observe o número de cruzes azuis que fazem partículas na tela e defina o limiar de detecção para processamento da amostra. Aguarde que os vídeos sejam processados automaticamente em um histograma de resultados antes que uma notificação de caixa de diálogo de conclusão seja exibida e, em seguida, clique em OK. Após a montagem da caixa de configurações de exportação, salve os resultados clicando na exportação. Destaque todos os cinco vídeos de captura listados no experimento atual.

Em seguida, clique em processar arquivos selecionados e aguarde que a caixa de confirmação de configuração apareça na caixa de processo para piscar para alterar o limiar de detecção e, em seguida, ajustar o limiar de detecção para o nível desejado e ir para a configuração e clicar em OK. Os vídeos serão processados automaticamente em um histograma de resultados e uma notificação de caixa de diálogo de conclusão será exibida. Clique OK.In análise representativa, os resultados da análise de nano-rastreamento, ou NTA, para as amostras de lipossomo e um diluente DPBS representativo são mostrados. As amostras filtradas apresentaram diâmetro médio de partículas de 108 nanômetros e uma concentração de 7,4 vezes 10 a oitavas partículas por mililitro.

Em contraste, amostras não filtradas apresentaram diâmetro médio de partículas de 159 nanômetros e uma concentração de 7,6 vezes 10 a oitavas partículas por mililitro. Nos níveis combinados de câmera, como o limiar de detecção foi aumentado de dois para cinco, o tamanho médio e de partículas de modo mostrou uma diminuição significativa no tamanho das partículas das amostras filtradas. As concentrações de partículas nos níveis combinados de câmera foram diminuídas à medida que o limiar de detecção foi aumentado.

Não foi detectada diferença significativa nas concentrações de partículas entre amostras filtradas e não filtradas. Em limiares combinados de detecção, à medida que o nível da câmera aumentava de 12 para 14, observou-se uma diminuição no tamanho médio e de partículas de modo das amostras filtradas. As concentrações de partículas em limiares combinados de detecção aumentaram à medida que os níveis de câmera aumentavam de 12 para 14.

Não foram observadas diferenças significativas entre amostras filtradas e não filtradas. As etapas 4.1 a 5.2 são importantes para encontrar a área de visualização correta. Alcançar resultados consistentes em várias corridas de ensaio depende dessa habilidade repetível.

A dispersão dinâmica da luz é frequentemente usada como um companheiro para análise de rastreamento de nanopartículas principalmente para obter o potencial zeta, que é a carga superficial das partículas. Para a análise de nanopartículas, a NTA continua a ser um método muito valioso de quantificação de partículas úteis para pesquisas de vesículas extracelulares.