Name: Monitoramento do crescimento do câncer de mama e formação de colônia metastática em camundongos usando bioluminescência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Aprenda a monitorar crescimento tumoral e colonização metastática em câncer de mama usando bioluminescência em camundongos. Este método não invasivo permite acompanhamento em tempo real para estudos de eficácia de drogas anticâncer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos aos membros do laboratório Y.D.S. Gostaríamos de agradecer ao Instituto Wohl de Medicina Translacional no Centro Médico Hadassah, em Jerusalém, por fornecer a pequena instalação de imagens de animais. Este estudo foi apoiado pelo Research Career Development Award do Israel Cancer Research Fund.

Todos os experimentos com camundongos foram realizados sob o protocolo MD-21-16429-5, aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso da Universidade Hebraica. Além disso, a Universidade Hebraica é certificada pela Associação de Avaliação e Acreditação de Cuidados Com Animais Laboratoriais (AAALAC).
1. Manutenção da linha celular
NOTA: As linhas de células cancerígenas de mama humanas (MCF-7, MDA-MB-468 e MDA-MB-231) foram utilizadas neste protocolo.
<ol><li>Cultura todas as linhas de células cancerígenas de mama no meio de Águia modificada (DMEM) modificada de Dulbecco, suplementada com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% penicilina-estreptomicina a 37 °C em uma incubadora de dióxido de carbono umidificado (5% CO2). NOTA: Verifique regularmente a densidade celular; dividir e expandir para uso futuro quando atingir 70% de confluência.</li>
</ol>2. Preparação de vírus
<ol><li>Trate as células HEK293T com 1 mL de trippsina até que se desprendem.</li>
	<li>Adicione 10 mL de DMEM (10% FBS) para neutralizar a atividade de trippsina e transfira a suspensão celular para um novo tubo de centrífugas de 15 mL.</li>
	<li>Centrífuga a 150 × g por 5 min para sedimentar as células. Descarte o supernatante após a centrifugação e adicione 1 mL de meio DMEM fresco.</li>
	<li>Determine a concentração celular e a semente 1,2 × 106 células/poço em uma placa de seis poços.</li>
	<li>No dia seguinte, pré-aquecimento todos os reagentes necessários, incluindo reagente de transfecção, DMEM sem soro, plasmídeo envelope plasmídeo (VSV-G), plasmídeo de embalagem de lentivírus (ΔVPR) e plágio de explosão pLX304 Luciferase-V5 ou plasmídeo FUW GFP.</li>
	<li>Em um tubo de centrífuga autoclaved de 1,5 mL, misture 50 μL de DMEM sem soro com 0,3 μg de plasmídeo VSV-G, 1 μg de ΔVPR e 1,2 μg de pLX304 Luciferase-V5 plasmid ou plasmídeo fuw gfp.</li>
	<li>Depois de misturar bem esses plasmídeos com o meio, adicione 5 μL do reagente de transfecção, misture suavemente e incubar a mistura em temperatura ambiente por 15 minutos.</li>
	<li>Após a incubação, adicione a mistura dropwise às células HEK293T.</li>
	<li>Após 24h, substitua o meio de crescimento por 2 mL de (30% FBS) DMEM. No dia seguinte (48 h pós-transfecção), colhe o meio contendo os vírus ("pLX304 Luciferase-V5 ou os vírus FUW GFP"). NOTA: O uso de 30% de FBS aumenta a eficiência de produção do vírus.</li>
	<li>Para evitar quaisquer resíduos de células HEK293T, passe o meio contendo vírus através de um filtro de seringa de 0,45 μm ou centrífuga a 150 × g por 5 min, e colete o supernatante. NOTA: Para armazenamento a longo prazo, mantenha as alíquotas de trabalho do vírus a -80 °C.</li>
</ol>3. Estabelecer células expressando stably GFP e luciferase ("Células GFP + Luc+ ")
<ol><li>Um dia antes de infectar as células, a semente 8 × 105 células por poço em uma placa de seis poços.</li>
	<li>Após a incubação durante a noite, substitua o meio de crescimento por meio fresco contendo 8 μg/mL de polibrene. Adicione 200 μL de vírus FUW GFP dropwise às células.</li>
	<li>Opcional: Para aumentar a eficiência do vírus, centrifugar a placa a 560 × g por 30 min (37 °C) (infecção por giro).</li>
	<li>Incubar as células por 48 h e verificar a expressão GFP por microscopia de fluorescência.</li>
	<li>Classifique as células expressas por GFP por classificação celular ativada por fluorescência (FACS) (GFP+) (Figura 1A).</li>
	<li>Infecte as células classificadas por GFP com os vírus da explosão pLX304 Luciferase-V5, conforme descrito na etapa 3.2.</li>
	<li>Trate as células com blasticidina (10 μg/mL) 30 h pós-infecção para enriquecer para células de expressão de explosão pLX304 Luciferase-V5 (células GFP+, Luc+ ). Em seguida, a cada dois dias, substitua por meio fresco contendo blasticidina. Além disso, como controle, trate células ingênuas com o mesmo meio contendo blasticidina. NOTA: Uma clara diferença entre as células infectadas e de controle deve ser observada após alguns dias de tratamento com blasticidina. Este efeito é dependente de linha celular e geralmente leva ~8-10 dias. Uma baixa taxa de sobrevivência indicará um baixo rendimento de produção viral. Se assim for, produzir um novo lote de vírus, pois a baixa eficiência pode afetar experimentos futuros.</li>
</ol>4. Validação da atividade de luciferase in vitro
<ol><li>Cresça as células MCF-7, MDA-MB-468 e MDA-MB-231 GFP+ Luc+ em uma placa de 15 cm a 80% de confluência. Colher as células por trippsinização, conforme descrito nas etapas 2.1-2.2.</li>
	<li>Semente um número crescente de células em cada poço (0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4 × 104) em uma placa preta de 96 poços. NOTA: As placas pretas de 96 poços são mais adequadas para medir os níveis de luciferase, pois placas brancas ou transparentes produzirão sinais de autoluminescência. Como controle, use salina tamponada com fosfato (PBS) sozinha em um poço para garantir que não haja autoluminescência da PBS.</li>
	<li>Encha todos os poços com 100 μL de DMEM e incubar por 16-24 h.</li>
	<li>Prepare a solução de luciferina em PBS a uma concentração de 1,5 mg/mL a partir do estoque de 30 mg/mL. Aliquot o estoque da solução de luciferina e armazene a -20 °C.</li>
	<li>Lave as células uma vez com PBS suavemente, adicione 100 μL de solução de luciferina em cada poço e espere por 2 min. Por fim, meça a atividade da luciferase em todas as células cancerígenas de mama utilizando bioluminescência. NOTA: Examinar a expressão in vitro de GFP e luciferase antes de experimentos em animais é crucial. Além disso, poços em branco são usados para subtrair o fundo.</li>
</ol>5. Injetando camundongos com células GFP+ Luc+
<ol><li>Transferir 5 × 106 (MCF-7 e MDA-MB-468) ou 2 × 106 (MDA-MB-231) células GFP+ Luc+ em 200 μL ou 100 μL PBS, respectivamente.</li>
	<li>Antes da injeção, limpe a capa biológica estéril com 5% de solução desinfetante (veja a Tabela de Materiais). Em seguida, anestesia os camundongos com ar filtrado (0,2 μm) contendo 4% de isoflurane a uma taxa de fluxo de ar de 1 L/min por 2-3 min. NOTA: É essencial confirmar a anestesia adequada; beliscar o dedo do mouse e procurar qualquer resposta.</li>
	<li>Coloque um cone sobre a cabeça do rato anestesiado em uma posição supina. Aplique pomada veterinária aos olhos para evitar o ressecamento enquanto estiver sob anestesia.</li>
	<li>Limpe a área abdominal do rato, acima da glândula mamária, com etanol usando um cotonete e levante a4ª glândula mamária com fórceps.</li>
	<li>Insira a agulha 27 G x 3/4 (0,4 x 19 mm) sob a almofada de gordura e injete lentamente 100 μL da suspensão celular. NOTA: Uma protuberância redonda aparecerá sob a pele. Além disso, uma injeção inadequada pode levar a desvio na taxa de crescimento do tumor ou ausência de tumor no mesmo grupo experimental.</li>
	<li>Após o procedimento de injeção, tire os ratos do capô e transfira-os para uma nova gaiola. Monitore os ratos até que eles retornem à consciência. NOTA: Certifique-se de que todas as agulhas e seringas usadas sejam descartadas na caixa afiada.</li>
</ol>6. Medir os níveis de luciferase em camundongos GFP+ Luc+
<ol><li>Antes da detecção da bioluminescência, contenha o rato consciente segurando seu pescoço com a mão esquerda. Em seguida, incline a mão para a esquerda, resultando na face do rato para cima com a parte inferior do corpo em uma posição supina.</li>
	<li>Injete 100 μL de luciferina (30 mg/mL) intraperitoneally (i.p.) na superfície abdominal do camundongo no quadrante abdominal inferior esquerdo usando uma seringa de 1,0 mL com tamanho de agulha 27 G x 3/4 (0,4 x 19 mm). NOTA: A ponta da agulha não deve ser inserida a mais de 3-5 mm da parede abdominal, pois pode penetrar órgãos viscerais. Além disso, recomenda-se realizar injeção i.p. sem anestesia, pois a distribuição de luciferina no corpo de camundongos anestesiados é mais lenta do que em camundongos conscientes. Assim, monitorar os níveis de luciferase em camundongos conscientes é um procedimento mais rápido.</li>
	<li>Mantenha o rato por 7 minutos sem anestesia seguido por 3 minutos dentro da câmara de anestesia antes de medir a cinética tumoral. NOTA: O tempo de incubação varia entre os diferentes experimentos, linhas celulares e espécies para espécies. Assim, recomenda-se calibrar o tempo de incubação antes de iniciar os experimentos.</li>
	<li>Anestesiar os camundongos conforme descrito nas etapas 5.2-5.3.</li>
	<li>Abra o software (Tabela de Materiais) durante a incubação, inicialize o sistema de imagem e clique no botão Initialize . NOTA: Esteja ciente de que a câmera levará ~10 min para esfriar e atingir -90 °C. Além disso, como controle de fundo, meça os níveis de luciferase em camundongos ingênuos (ou seja, camundongos GFP+ injetados com células que não expressam o gene da luciferase).</li>
	<li>Mantenha a configuração em exposição automática usando as seguintes configurações: tempo de exposição auto, 60 s; Binning Medium, F/Stop 1; Filtro de excitação bloqueado; Filtro de emissão aberto. Quando a inicialização terminar, selecione | do assistente de imagem Bioluminescência e clique em Next | | de filtro aberto selecionar Mouse no assunto imagem.</li>
	<li>Em Field View, selecione o estágio C (10 cm) e a Altura do Assunto: 1,50 cm.</li>
	<li>Clique em Configuração de imagem Estágio para C e antes de clicar no botão Adquirir , certifique-se de que o mouse seja colocado no palco na posição supina adequada.</li>
	<li>Feche a porta, clique no botão Adquirir e aguarde que uma imagem apareça na tela. NOTA: Com a opção Auto-Exposição , um sinal forte leva de 5 a 20 s dependendo do sinal; um sinal fraco levará em torno de 60 s.</li>
	<li>Repita este passo para os outros ratos.</li>
	<li>Para detectar a metástase pulmonar, cubra o forte sinal do tumor primário usando papel de papelão preto espesso e exponha apenas o lado ventral dos pulmões em direção à câmera. Capture a imagem usando os mesmos parâmetros descritos acima.</li>
</ol>7. Aquisição de imagem ex vivo usando bioluminescência e fluorescência
<ol><li>Eutanize os camundongos usando inalação de dióxido de carbono (CO2) no desiccador e disseque os camundongos usando tesouras autoclavadas e fórceps.</li>
	<li>Perfunda os camundongos usando 0,9% de soro fisiológico, colhe os órgãos e enxágue com 1x PBS para eliminar manchas de sangue do órgão.</li>
	<li>Transfira o órgão enxaguado para uma placa de Petri e coloque-o no estágio da máquina de bioluminescência. Aplique a mesma configuração de bioluminescência descrita nas etapas 6.2-6.6. NOTA: Devido à diminuição do sinal de luciferase, esta etapa é limitante. Assim, após eutanásia de camundongos, visualize imediatamente o órgão por bioluminescência.</li>
	<li>Para imagens GFP, aplique a mesma configuração descrita na etapa 6.3, usando filtro GFP de Fluorescência em vez de Bioluminescência.</li>
	<li>Tire imagens pulmonares usando um microscópio estéreo para examinar a presença de colônias GFP+ .</li>
</ol>8. Análise de dados de bioluminescência
<ol><li>Clique duas vezes no software e selecione Abrir no menu Arquivo .</li>
	<li>Abra todos os arquivos e minimize-os. Certifique-se de que todas as unidades são Radiance (Fótons). Além disso, clique em Aplicar a Todos para manter os mesmos parâmetros para todas as imagens.</li>
	<li>No menu Exibir , selecione a Paleta de ferramentas, que abrirá uma nova janela.</li>
	<li>Na janela Paleta de ferramentas , selecione a guia Ferramentas do ROI e, em Tipo, escolha o ROI Bkg médio.</li>
	<li>A partir das ferramentas do ROI, selecione Circle e desenhe um pequeno círculo na área torácica do mouse.</li>
	<li>Clique duas vezes no círculo, selecione o Usar como BKG para futura opção ROIs na guia ROI de fundo e clique em Fazer.</li>
</ol>9. Medir o fluxo total
<ol><li>Na janela Paleta de ferramentas , selecione a guia Ferramentas do ROI e digite, escolha a medição do ROI.</li>
	<li>A partir das ferramentas do ROI, selecione Circle e desenhe um grande círculo sobre o tumor primário do mouse.</li>
	<li>Clique com o botão direito do mouse no ROI e clique com o botão direito do mouse no ROI de cada arquivo individual de cada mouse.</li>
	<li>Clique em Medir ROIs da guia FERRAMENTAS ROI , que abrirá uma nova janela chamada ROI Measurements. A partir desta guia, mantenha os Tipos de Medição como Radiance (Fótons) e Atributos de Imagem como Todos os Valores Povoados.</li>
	<li>Exporte o arquivo como arquivo de medição (*.txt) ou formato Csv (*.csv).</li>
	<li>Abra os dados exportados em uma planilha e pegue o Fluxo Total (p/s) e os valores para as semanas. NOTA: Esta etapa pode ser usada para medir diferentes grupos. Por exemplo, camundongos tratados com um veículo versus aqueles tratados com uma droga.</li>
	<li>Gere um plot XY, onde o Tempo é apresentado ao longo do eixo X e fluxo total (p/s) ao longo do eixo Y. Para cada semana, pegue o parâmetro Total Flux (p/s) para cada grupo amostral e determine quaisquer diferenças significativas usando o teste t do Aluno não paramétrico.</li>
</ol>

<ol><li>Waks, A. G., Winer, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+treatment%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Breast cancer treatment: A review.</a> JAMA. 321 (3), 288-300 (2019).</li>
<li>Jin, X., Mu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer%3A+Basic+and+Clinical+Research%22%5BJournal%5D)">Targeting breast cancer metastasis.</a> Breast Cancer: Basic and Clinical Research. 9, Suppl 1 23-34 (2015).</li>
<li>Saha, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+of+tumor+hypoxia+dynamics+of+breast+cancer+brain+metastasis+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3175(2011).</li>
<li>Rashid, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+tail+vein+injection+a+relevant+breast+cancer+lung+metastasis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+Disease%22%5BJournal%5D)">Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model.</a> Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).</li>
<li>Fantozzi, A., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Mouse models of breast cancer metastasis.</a> Breast Cancer Research. 8 (4), 212(2006).</li>
<li>Kocatürk, B., Versteeg, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+injection+of+breast+cancer+cells+into+the+mammary+fat+pad+of+mice+to+study+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e51967(2015).</li>
<li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+whole+picture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The whole picture.</a> Nature. 463 (7283), 977-979 (2010).</li>
<li>Wang, Y., Tseng, J. -C., Sun, Y., Beck, A. H., Kung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+imaging+of+tumor+burden+and+molecular+pathways+in+mouse+models+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Noninvasive imaging of tumor burden and molecular pathways in mouse models of cancer.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 135-144 (2015).</li>
<li>Kim, J. E., Kalimuthu, S., Ahn, B. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cell+tracking+with+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nuclear+Medicine+and+Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">In vivo cell tracking with bioluminescence imaging.</a> Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (1), 3-10 (2015).</li>
<li>Paschall, A. V., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthotopic+mouse+model+of+spontaneous+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">An orthotopic mouse model of spontaneous breast cancer metastasis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), (2016).</li>
<li>Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Three+Different+Methods+for+Determining+Cell+Proliferation+in+Breast+Cancer+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), e54040(2016).</li>
<li>Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+metastasis+and+CTL+adoptive+transfer+immunotherapy+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Experimental metastasis and CTL adoptive transfer immunotherapy mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2077(2010).</li>
<li>Lv, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+transplantation+of+breast+tumors+as+preclinical+models+for+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Orthotopic transplantation of breast tumors as preclinical models for breast cancer.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61173(2020).</li>
<li>Cheng, R. Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+triple+negative+breast+cancer+using+orthotopic+breast+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Studying triple negative breast cancer using orthotopic breast cancer model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60316(2020).</li>
<li>Bajikar, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-suppressor+inactivation+of+GDF11+occurs+by+precursor+sequestration+in+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor-suppressor inactivation of GDF11 occurs by precursor sequestration in triple-negative breast cancer.</a> Developmental Cell. 43 (4), 418-435 (2017).</li>
<li>Khatib, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glutathione+peroxidase+8+%28GPX8%29%2FIL-6%2FSTAT3+axis+is+essential+in+maintaining+an+aggressive+breast+cancer+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The glutathione peroxidase 8 (GPX8)/IL-6/STAT3 axis is essential in maintaining an aggressive breast cancer phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21420-21431 (2020).</li>
</ol>

Todos os autores revelaram que não têm conflitos de interesse.

Experimentos em animais são obrigatórios para a pesquisa sobre câncer 7,8,9, e de fato muitos protocolos foram desenvolvidos 3,6,10,11,12,13,14. No entanto, a maioria desses estudos determinou o efe...

Os cânceres de mama são tipos frequentes de câncer em todo o mundo, com aproximadamente 250.000 novos casos diagnosticados a cada ano nos Estados Unidos1. Apesar de sua alta incidência, um novo conjunto de medicamentos anticancerígenos melhorou significativamente os resultados de pacientes com câncerde mama 2. No entanto, esses tratamentos ainda são inadequados, pois muitos pacientes experimentam recaída da doença e propagação metastática para órgãos vitais2, que é a principal causa de morbidade e mortalidade do paciente. Portanto, um dos principais desafios na pesquisa sobre câncer de mama é identificar os mecanismos moleculares que regulam a formação de metástases distais para desenvolver novos meios para inibir seu desenvolvimento.
A metástase do câncer é um processo dinâmico no qual as células se desprendem do tumor primário e invadem tecidos vizinhos através da circulação sanguínea. Assim, modelos animais em que as células sofrem uma cascata metastática semelhante podem facilitar a identificação dos mecanismos que regem esse processo 3,4. Além disso, esses modelos in vivo são essenciais para o desenvolvimento de agentes terapêuticos de câncer de mama 5,6. No entanto, esses modelos ortotópicos não podem indicar a cinética real do crescimento do tumor, pois o efeito só é determinado após o término. Por isso, estabelecemos uma ferramenta baseada em luciferase para detectar o desenvolvimento de tumores e a colonização metastática em tempo real. Além disso, essas células expressam GFP para detectar as colônias metastáticas. Esta abordagem é relativamente simples e não envolve nenhum procedimento invasivo3. Assim, combinar a detecção de luciferase e fluorescência é uma estratégia útil para avançar nos estudos pré-clínicos de terapêutica do câncer de mama e manejo de doenças.

<table><tbody><tr><td>Tubos eppendorf de 1,7 mL</td><td>Lifegene</td><td>LMCT1.7B-500</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; Pontas L</td><td>Lifegene</td><td>LRT10</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; Pontas L</td><td>Lifegene</td><td>LRT1000</td><td></td></tr><tr><td>tubos de 15 mL</td><td>Lifegene</td><td>LTB15-500</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; Pontas em L</td><td>Lifegene</td><td>LRT200</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de 6 poços</td><td>COSTAR</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 96 poços PRETO barra de fundo plano</td><td>Naor</td><td>BN30496</td><td></td></tr><tr><td>Contadores de células automatizados</td><td>Thermofisher</td><td>A50298</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria III classificador</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Microlance 3 agulhas 27 G (3/4'')</td><td>BD</td><td>302200</td><td></td></tr><tr><td>Seringas BD Plastipak 1 mL x 120</td><td>BD</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>Corning 100 mm x 20 mm Prato Estilo</td><td>CORNING</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Corning 150 mm x 20 mm Prato Estilo</td><td>CORNING</td><td>430599</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas da câmara de contagem de células da Condessa</td><td>Thermofisher</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), glicose alta, sem glutamina</td><td>Microscópio Eclipse</td> 80i da Biological Industries <td>01-055-1A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Centrífuga eppendorf Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5810 R</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EP5820740000</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Biological Industries</td><td>04-127-1A</td><td></td></tr><tr><td>FUW GFP</td><td></td><td></td><td>Presenteado do laboratório do Dr. Yossi Buganim (Universidade Hebraica de Jerusalém)</td></tr><tr><td>HEK293T</td><td></td><td></td><td>Dotado do laboratório do Dr. Lior Nissim (Universidade Hebraica de Jerusalém)</td></tr><tr><td>Isoflurano, USP Terrell</td><td>Piramal</td><td>NDC 66794-01-25</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Imagem In Vivo de Espectro IVIS</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>Solução de L-Glutamina</td><td>Indústrias biológicas</td><td>03-020-1A</td><td></td></tr><tr><td>Software de Imagem Viva</td><td>Bioluminescência PerkinElmer</td><td></td><td> medição</td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>ATCC</td><td>ATCC HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>ATCC</td><td>ATCC HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-468</td><td>ATCC</td><td>ATCC HTB-132</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur</td><td>NORMAX</td><td>2430-475</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hylabs</td><td>BP655/500D</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-dR8.2-dvpr</td><td>Addgene</td><td>#8455</td><td>Fornecido por David M. Sabatini' s lab (Instituto Whitehead, Boston, EUA)</td></tr><tr><td>pCMV-VSV-G</td><td>Addgene</td><td>#8454</td><td>Fornecido por David M. Sabatini' s lab (Instituto Whitehead, Boston, EUA)</td></tr><tr><td>Solução de Penicilina-Estreptomicina</td><td>Biological Industries</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri 90 mm (90x15)</td><td>MINI PLAST</td><td>820-090-01-017</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas 10ml</td><td>Lifegene</td><td>LG-GSP010010S</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas 25ml</td><td>Lifegene</td><td>LG-GSP010050S</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas 5ml</td><td>Lifegene</td><td>LG-GSP010005S</td><td></td></tr><tr><td>pLX304 Luciferase-V5 plasmídeo de explosão</td><td>Addgene</td> <td># 98580</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma Aldrich</td> <td># 107689</td><td></td></tr><tr><td>Prism 9</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reservatórios de reagentes</td><td>Bar Naor</td><td>BN20621STR200TC</td><td></td></tr><tr><td>SMZ18 Microscópios estéreo</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Bio-Lab</td><td></td><td></td>190359400</tr><tr><td>Filtros de seringa</td><td>Lifegene</td><td>LG-FPV403030S</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue 0,5% solução</td><td>Biological industries</td><td>03-102-1B</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina EDTA Solução B (0,25%), EDTA (0,05%)</td><td>Biological Industries</td><td>03-052-1a</td><td></td></tr><tr><td>Filtros acionados a vácuo</td><td>SOFRA LIFE SCIENCE</td><td>SPE-22-500</td><td></td></tr><tr><td>Virusolve</td><td></td><td>desinfetante</td><td></td></tr><tr><td>VivoGlo Luciferina, In Vivo Grau</td><td>Promega</td><td>P1043</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagente</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#6366236001</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoramento do crescimento do câncer de mama e formação de colônia metastática em camundongos usando bioluminescência

Monitoring Breast Cancer Growth and Metastatic Colony Formation in Mice using Bioluminescence

O câncer de mama é uma malignidade heterogênea frequente e a segunda principal causa de mortalidade em mulheres, principalmente devido à metástase de órgãos distantes. Vários modelos animais foram gerados, incluindo os modelos de camundongos ortotópicos amplamente utilizados, onde células cancerígenas são injetadas na almofada de gordura mamária. No entanto, esses modelos não podem ajudar a monitorar cinética de crescimento tumoral e colonização metastática. Ferramentas de ponta para monitorar células cancerígenas em tempo real em camundongos avançarão significativamente na compreensão da biologia tumoral. 
Aqui, foram estabelecidas linhas de células cancerígenas de mama expressando a luciferase e a proteína fluorescente verde (GFP). Especificamente, esta técnica contém duas etapas sequenciais iniciadas pela medição da atividade luciferase in vitro e seguida pela implantação das células cancerosas em almofadas de gordura mamária de camundongos de imunodeficiência combinada (NOD-SCID) de nonobese. Após a injeção, tanto o crescimento do tumor quanto a colonização metastática são monitorados em tempo real pelo sistema de imagem de bioluminescência não invasiva. Em seguida, a quantificação das metástases expressas por GFP nos pulmões será examinada por microscopia de fluorescência para validar os resultados de bioluminescência observados. Este sofisticado sistema que combina ferramentas de detecção baseadas em luciferase e fluorescência avalia a metástase do câncer in vivo, que tem grande potencial para uso em terapêutica do câncer de mama e manejo de doenças.

Geramos linhas celulares de câncer de mama (MDA-MB-231, MCF-7 e MDA-MB-468) expressando vetores GFP e luciferase. Especificamente, isso foi conseguido por uma infecção sequencial. Primeiro, as linhas de células cancerígenas de mama foram infectadas com um vetor de lentivírus expressando GFP fluorescente. As células GFP-positive (GFP+) foram classificadas 2 dias após a infecção (Figura 1A,B) e infectadas com o vetor pLX304 Luciferase-V5. Em seguida, blasticidina fo...

Aqui, descrevemos um método de monitoramento não invasivo envolvendo expressão de luciferase e proteína fluorescente verde em várias linhas de células cancerígenas de mama. Este protocolo fornece uma técnica para monitorar a formação de tumores e a colonização metastática em tempo real em camundongos.

Monitoramento do crescimento do câncer de mama e formação de colônia metastática em camundongos usando bioluminescência

Breast cancer is a frequent heterogeneous malignancy and the second leading cause of mortality in women, mainly due to distant organ metastasis. Several ...

Usando essa ferramenta sofisticada e não invasiva, podemos monitorar em tempo real cinética de crescimento de tumores e colonização metastática em camundongos, que tem um grande potencial no tratamento terapêutico e de doenças do câncer de mama. A combinação de detecção de luciferase e fluorescência é uma estratégia útil para avançar nos estudos pré-clínicos de progressão do câncer de mama e manejo de doenças. Isso pode ser aplicado para estudos de drogas anticancerígenas.Este protocolo não se restringe ao câncer de mama e pode ser aplicado a outros carcinomas, como pulmão e pâncreas. Comece cultivando as células MCF-7, MDA-MB-468 e MDA-MB-231 GFP e luciferase-positive separadamente em uma placa de 16 centímetros a 80% de confluência. Depois de colher as células por trippsinização, as sementes aumentaram um número crescente de células em cada poço em uma placa preta de 96 poços.Em seguida, encha todos os poços com 100 microliters de DMEM, e incubar por 16 a 24 horas em 37 graus Celsius, incubadora de 5%DE CO2. Prepare a solução de luciferina em PBS a uma concentração de 1,5 miligramas por mililitro, e armazene a solução a menos 20 graus Celsius. Após a incubação, lave as células um

monitoring-breast-cancer-growth-metastatic-colony-formation-mice

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Um modelo de camundongo experimental de metástase óssea foi estabelecido após a entrega intracardíaca da luciferase expressando células tumorais mamárias. Desenvolvimento do tumor e resultou lesão osteolítica foram monitorados longitudinalmente, com a bioluminescência e CT micro imagem.

Monitoramento metástases tumorais e lesões osteolíticas com bioluminescência e CT Micro Imagem

Imagem de bioluminescência de hipóxia induzida a atividade do fator-1α é aplicada para monitorar o desenvolvimento hipóxia intracraniana tumor em um câncer de mama modelo de cérebro de rato metástase.

Na imagem de bioluminescência vivo Tumor de mama Dynamics Hipóxia metástase do cancro cerebral em um modelo de rato

Fonte:Marina Arantes Radicchi1, Victor Carlos Mello1,Victória Paz Machado1, Márcia Cristina Oliveira da Rocha1, Jaqueline Vaz de Oliveira1, Luana Cristina Camargo1,2, Luís Alexandre Muehlmann1, Ricardo Bentes Azevedo1, Sônia Nair Bao1, João Paulo Figueiró Longo11Instituto de Ciências Biológicas, Universidade de Brasília, 2Departamento de Processos Psicológicos Básicos, Instituto de Psicologia, Universidade de BrasíliaEste vídeo demonstra o procedimento para rastrear a progressão do tumor in...

Imagem bioluminescente da progressão do tumor de mama em um modelo de camundongo fêmea

imagem de bioluminescência é uma ferramenta bem conhecida para localizar tumores e metástases, mas a quantificação dessas imagens muitas vezes requer cálculos complexos e instrumentos particulares. Nós descrevemos o método luminoscore de usar fácil, com base nas condições de aquisição precisas, sem necessidade de cálculos, e permitindo que a carga tumoral e resposta ao tratamento a ser monitorado em modelos do rato.

Método Tumor Quantificação Baseada em bioluminescência para a progressão do tumor Monitoramento e efeitos do tratamento em modelos de ratos linfoma

Um modelo de tumor primário do cancro da mama ortotópico e remoção cirúrgica do tumor primário para prolongar a vida do rato para gerar metástase espontânea são descritos. O crescimento do tumor e progressão são monitorados e quantificado por imagens de fluorescência da luciferase.

Um modelo de camundongo ortotópico de câncer de mama espontânea metástase

Apresentamos um modelo de câncer de mama murino ortotópico e modelo de mastectomia radical com tecnologia de bioluminescência para quantificar a carga do tumor para imitar a progressão do câncer de mama humano.

Gerar um modelo de câncer de mama metastático murino ortotópico e realizando a mastectomia Radical murino

Este protocolo descreve o estabelecimento de um modelo do rato do tumor-rolamento para monitorar a progressão e a angiogênese do tumor no tempo real pela imagem latente dupla do bioluminescência.

Imagem de bioluminescência dupla de progressão tumoral e angiogênese

Este trabalho predefine um protocolo avançado para avaliar com precisão o carregamento de tumores por meio da detecção de sinais de proteína fluorescente verde e bioluminescência, bem como a integração da técnica de detecção molecular quantitativa.

Estudando o câncer de mama triplo negativo usando modelo de câncer de mama ortotópico

A abordagem descrita combina ensaios experimentais de metástase da veia da cauda com imagens de animais vivos in vivo in vivo para permitir o monitoramento em tempo real da formação e crescimento da metástase do câncer de mama, além da quantificação do número e tamanho da metástase nos pulmões.

Uso combinado de ensaios de metástase de veia de cauda e imagens in vivo em tempo real para quantificar a colonização metastática do câncer de mama e carga nos pulmões

O manuscrito descreve uma metodologia para o estabelecimento, bem como o monitoramento longitudinal do crescimento de metástases pulmonares espontâneas de tumores de mama injetados ortotopicamente, passíveis de intervenção em todos os estágios da cascata metastática.

In vivo Imagem para medir metástase pulmonar espontânea de células tumorais de mama injetadas ortotopicamente

Aqui, descrevemos o protocolo para entrega in vivo de nanopartículas magnéticas de óxido de ferro carregando oligômeros de RNA para câncer de mama metastático em modelos animais, fornecendo uma abordagem clinicamente viável para o silenciamento terapêutico de ácidos nucléicos oncogênicos.

Monitoramento do acúmulo de nanodrogas em metástases de câncer de mama murino

Aprenda a monitorar crescimento tumoral e colonização metastática em câncer de mama usando bioluminescência em camundongos. Este método não invasivo permite acompanhamento em tempo real para estudos de eficácia de drogas anticâncer.

Monitoramento do crescimento do câncer de mama e formação de colônia metastática em camundongos usando bioluminescência

Explorar mais vídeos