Uso de Crystal Violet para melhorar a leitura baseada em efeito citopático visual para titulação viral usando ensaios TCID50
12 de fevereiro de 2022
Este protocolo mostra uma abordagem precisa e objetiva para visualizar as titulações virais usando violeta cristalina, comparando-a com microscopia óptica e coloração imunocitômica.
O objetivo deste protocolo é produzir uma titulação de estoque de vírus e visualizá-lo usando coloração violeta cristalina. Para isso, uma titulação viral geral será demonstrada seguida pela coloração. Esta titulação será realizada em uma placa de 96 poços por um período de sete dias em um armário de biossegurança dentro de um laboratório de biossegurança nível 2.
Para isso, uma placa de 96 poços da linha celular preferida será semeada usando a mídia correspondente e deixar crescer até confluente. O estoque do vírus será diluído usando diluições dez vezes, misturando 900 microliters de mídia e 100 microliters de vírus, ou a diluição correspondente. Certifique-se de vórtice de cada tubo para garantir a mistura adequada da mídia e do vírus e evitar erros nas diluições.
Escreva o layout da placa no lead, bem como cada diluição para ajudar durante o processo de infecção. Antes da infecção, lave usando 200 microliters de PBS. Adicione 50 microliters do seu inóculo nos poços correspondentes.
Em seguida, incubar a 37 graus celsius em uma incubadora de CO2 de 5% por sete dias. Após a incubação de sete dias, lave usando 200 microliters de PBS. Fixar as células adicionando 50 microliters por poço de PFA a 4% em PBS e incubar por 15 minutos à temperatura ambiente.
Após a incubação, lave as células novamente duas vezes com 200 microliters de PBS antes da adição de 50 microliters por poço de violeta cristalina na água e incubar por cinco minutos à temperatura ambiente. Por fim, aspirar o cristal violeta dos poços e, opcionalmente, deixar as placas secarem por dois a cinco minutos em temperatura ambiente ou lavá-la com 200 microliters de água para remover a mancha excessiva antes da visualização. Como resultado, após re coloração, as células negativas serão manchadas.
Poços positivos serão limpos. Essas informações serão usadas em uma das duas fórmulas descritas para calcular seu título viral final. Quando o título obtido com cada método foi comparado, mostrou que em monócito a coloração química poderia, em alguns casos, detectar poços positivos adicionais em comparação com o cristal violeta, e que da mesma forma, ambos os métodos de coloração poderiam detectar poços mais positivos do que a avaliação visual via microscopia.
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Visão Geral
Este protocolo demonstra um método preciso para visualizar titulações virais utilizando coloração com violeta de cristal. Ele compara este método com microscopia óptica e coloração imunocitoquímica.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Virologia
- Biologia Celular
- Técnicas Laboratoriais
Contexto
- A titulação viral é essencial para quantificar estoques de vírus.
- A coloração com cristal violeta fornece uma representação visual da presença viral.
- Os métodos comparativos incluem microscopia óptica e coloração imunocitoquímica.
- As técnicas adequadas de diluição são cruciais para resultados precisos.
Objetivo do Estudo
- Produzir uma titulação de estoque viral.
- Visualizar a titulação utilizando coloração com violeta de cristal.
- Garantir a precisão nos métodos de quantificação viral.
Métodos Utilizados
- Placamento de uma linhagem celular preferencial em uma placa de 96 poços.
- Realização de diluições decimais do estoque viral.
- Vortexação de cada diluição para mistura adequada.
- Coloração com violeta de cristal após um período de incubação de sete dias.
Resultados Principais
- Visualização bem-sucedida de titulações virais utilizando violeta cristal.
- A comparação com outros métodos de coloração mostrou consistência.
- Quantificação precisa de estoques virais obtida.
- O protocolo fornece um método confiável para estudos futuros.
Conclusões
- A coloração com violeta de cristal é um método eficaz para visualizar titulações virais.
- O protocolo aprimora a precisão da quantificação viral.
- Estudos futuros podem se basear neste método para diversas aplicações.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A titulação viral precisa é fundamental para a triagem de antivirais e o desenvolvimento de vacinas, em que a detecção inconsistente do ECP pode comprometer a identificação de candidatos promissores e decisões de continuidade ou interrupção. A coloração com violeta cristal oferece uma alternativa econômica e reprodutível à coloração imunocitoquímica, melhorando a padronização do ensaio e reduzindo a variabilidade em fluxos de trabalho de descoberta precoce. Isso aumenta a confiança preditiva nas avaliações de eficácia antiviral e permite triagem escalonável e de alto rendimento baseada em TCID50 para vírus que formam ECP.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a quantificação objetiva da infectividade viral, reduzindo a dependência da microscopia subjetiva e apoiando a desmistificação mecanicista de alvos antivirais.
- Valor Operacional: Oferece um método de coloração rápido e de baixo custo que aumenta a produtividade e a reprodutibilidade do ensaio na validação de hits antivirais.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera pontos finais claros e quantificáveis para ensaios de TCID50, melhorando a relação sinal-ruído em campanhas de triagem de compostos.
- Valor Operacional: Elimina a necessidade de reagentes caros de ICC, reduzindo o custo por ensaio e permitindo uma aplicação mais ampla em plataformas de descoberta de antivirais.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Fornece medidas consistentes de título viral entre estudos, apoiando modelos confiáveis de dose-resposta em estudos pré-clínicos de eficácia.
- Valor Operacional: Facilita a padronização entre laboratórios no preparo de estoques virais, reduzindo a variabilidade entre experimentos em estudos habilitantes para registro (IND).
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método insere-se no espectro de descoberta de antivirais, desde a confirmação inicial de hits até a otimização de compostos líderes, onde a titulação viral precisa orienta as relações estrutura-atividade e o perfil de resistência.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao fornecer modelos reprodutíveis de desafio viral para estudos de mecanismo de ação.
- Triagem: Fornece resultados padronizados e quantificáveis essenciais para a progressão de "acertos" a "candidatos líderes" em cascatas de triagem antiviral.
- Análises: Permite o cálculo preciso de valores de TCID50, possibilitando a comparação exata da potência de compostos em diferentes condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Garante a continuidade da triagem antiviral in vitro até modelos de desafio in vivo por meio da quantificação consistente de estoques virais.
- Reutilização Corporativa: Representa uma capacidade escalável e de baixo custo aplicável a múltiplos alvos virais e áreas terapêuticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva da eficácia antiviral ao reduzir falsos negativos provenientes da avaliação visual do CPE.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e escalabilidade dos ensaios de TCID50 por meio de coloração simplificada e padronizada.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital em programas antivirais ao reduzir os custos dos ensaios sem comprometer a qualidade dos dados.
- Impacto no Portfólio: Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco ao fornecer dados confiáveis de título viral para critérios de prosseguir/não prosseguir.
Considerações de Implementação
- Requer treinamento básico em virologia e técnica asséptica para o manuseio seguro de vírus em ambientes BSL-2.
- Depende de equipamentos laboratoriais padrão, incluindo incubadoras, centrífugas e leitores de placas para quantificação opcional.
- Necessita de acordo entre equipes sobre a duração da coloração e protocolos de lavagem para garantir reprodutibilidade entre laboratórios.
- Aplicável a linhagens celulares aderentes que suportam a formação de efeito citopático; pode ser necessária otimização para vírus não aderentes ou que não induzem ECP.
- Limitado a vírus que induzem efeito citopático detectável; não é adequado para modelos de infecção não citopática ou persistente sem modificações.
