Name: In situ Visualização da Dinâmica do Cone de Crescimento e Crescimento do Axon em Culturas agudas de fatias de cérebro embrionário ex vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Aprenda a visualizar dinâmica de cones de crescimento e crescimento axonal em fatias agudas de cérebro embrionário de camundongo ex vivo. Este método permite imagem de alta resolução para estudar plasticidade neural in situ.

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Gostaríamos de agradecer a Maria Eugenia Bernis por fotografar os procedimentos. Agradecemos também a Emily Burnside, Emily Handley, Thorben Pietralla, Max Schelski e Sina Stern por lerem e discutirem o manuscrito. Somos gratos às nossas excelentes assistentes técnicas, Jessica Gonyer, Blanca Randel e Anh-Tuan Pham. Reconhecemos o valioso apoio das instalações de microscópio leve e instalações de animais da DZNE. Este trabalho foi apoiado pela Deutsche Forschungsgesellschaft (DFG), a Fundação Internacional para a Pesquisa em Paraplegia (IRP) e as Asas pela Vida (para F.B). F.B. é membro do cluster de excelência ImmunoSensation2, os SFBs 1089 e 1158, e é um dos ganhadores do Prêmio Roger De Spoelberch.

<ol><li>Schelski, M., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+polarization%3A+From+spatiotemporal+signaling+to+cytoskeletal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Neuronal polarization: From spatiotemporal signaling to cytoskeletal dynamics.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 84, 11-28 (2017).</li>
<li>Lowery, L. A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trip+of+the+tip%3A+understanding+the+growth+cone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The trip of the tip: understanding the growth cone machinery.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).</li>
<li>Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+axon+guidance%3A+are+we+nearly+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Understanding axon guidance: are we nearly there yet.</a> Development. 145 (10), (2018).</li>
<li>Bradke, F., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+local+actin+instability+in+axon+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The role of local actin instability in axon formation.</a> Science. 283 (5409), 1931-1934 (1999).</li>
<li>Neukirchen, D., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+linker+proteins+regulate+neuronal+polarization+through+microtubule+and+growth+cone+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic linker proteins regulate neuronal polarization through microtubule and growth cone dynamics.</a> Journal of Neuroscience. 31 (4), 1528-1538 (2011).</li>
<li>Witte, H., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+cytoskeleton+during+neuronal+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The role of the cytoskeleton during neuronal polarization.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18 (5), 479-487 (2008).</li>
<li>Witte, H., Neukirchen, D., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+stabilization+specifies+initial+neuronal+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule stabilization specifies initial neuronal polarization.</a> Journal of Cell Biology. 180 (3), 619-632 (2008).</li>
<li>Nichol, R. H., Catlett, T. S., Onesto, M. M., Hollender, D., Gomez, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+elasticity+regulates+cell-type+specific+RHOA+signaling+and+neuritogenesis+of+human+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Environmental elasticity regulates cell-type specific RHOA signaling and neuritogenesis of human neurons.</a> Stem Cell Reports. 13 (6), 1006-1021 (2019).</li>
<li>Santos, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+growth+of+CNS+neurons+in+three+dimensions+is+amoeboid+and+independent+of+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Axon growth of CNS neurons in three dimensions is amoeboid and independent of adhesions.</a> Cell Reports. 32 (3), 107907(2020).</li>
<li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+dynamics+and+nerve+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal dynamics and nerve growth.</a> Neuron. 1 (9), 761-772 (1988).</li>
<li>Lin, C. H., Thompson, C. A., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+reorganization+underlying+growth+cone+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal reorganization underlying growth cone motility.</a> Current Opinion in Neurobiology. 4 (5), 640-647 (1994).</li>
<li>Myers, J. P., Gomez, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+adhesion+kinase+promotes+integrin+adhesion+dynamics+necessary+for+chemotropic+turning+of+nerve+growth+cones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Focal adhesion kinase promotes integrin adhesion dynamics necessary for chemotropic turning of nerve growth cones.</a> Journal of Neuroscience. 31 (38), 13585-13595 (2011).</li>
<li>Turney, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+growth+factor+stimulates+axon+outgrowth+through+negative+regulation+of+growth+cone+actomyosin+restraint+of+microtubule+advance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Nerve growth factor stimulates axon outgrowth through negative regulation of growth cone actomyosin restraint of microtubule advance.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (3), 500-517 (2016).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+derived+from+radial+glial+cells+establish+radial+units+in+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex.</a> Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).</li>
<li>Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nature Neuroscience. 7 (2), 136-144 (2004).</li>
<li>Ferent, J., Zaidi, D., Francis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+control+of+radial+glia+proliferation+and+scaffolding+during+cortical+development+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular control of radial glia proliferation and scaffolding during cortical development and pathology.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 578341(2020).</li>
<li>Dent, E. W., Gupton, S. L., Gertler, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growth+cone+cytoskeleton+in+axon+outgrowth+and+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The growth cone cytoskeleton in axon outgrowth and guidance.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (3), (2011).</li>
<li>Dupraz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoA+controls+axon+extension+independent+of+specification+in+the+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">RhoA controls axon extension independent of specification in the developing brain.</a> Current Biology. 29 (22), 3874-3886 (2019).</li>
<li>Azzarelli, R., Oleari, R., Lettieri, A., Andre, V., Cariboni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro%2C+ex+vivo+and+in+vivo+techniques+to+study+neuronal+migration+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Sciences%22%5BJournal%5D)">In vitro, ex vivo and in vivo techniques to study neuronal migration in the developing cerebral cortex.</a> Brain Sciences. 7 (5), (2017).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Namba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pioneering+axons+regulate+neuronal+polarization+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pioneering axons regulate neuronal polarization in the developing cerebral cortex.</a> Neuron. 81 (4), 814-829 (2014).</li>
<li>Shah, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rap1+GTPases+are+master+regulators+of+neural+cell+polarity+in+the+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Rap1 GTPases are master regulators of neural cell polarity in the developing neocortex.</a> Cerebral Cortex. 27 (2), 1253-1269 (2017).</li>
<li>Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+confocal+imaging+of+migrating+neurons+in+organotypic+slice+culture+of+embryonic+mouse+brain+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Time-lapse confocal imaging of migrating neurons in organotypic slice culture of embryonic mouse brain using in utero electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), (2017).</li>
<li>de Anda, F. C., Meletis, K., Ge, X., Rei, D., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+motility+is+essential+for+initial+axon+formation+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Centrosome motility is essential for initial axon formation in the neocortex.</a> Journal of Neuroscience. 30 (31), 10391-10406 (2010).</li>
<li>Sakakibara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+centrosome+translocation+and+microtubule+organization+in+neocortical+neurons+during+distinct+modes+of+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Dynamics of centrosome translocation and microtubule organization in neocortical neurons during distinct modes of polarization.</a> Cerebral Cortex. 24 (5), 1301-1310 (2014).</li>
<li>Schatzle, P., Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+microtubule+dynamics+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Live imaging of microtubule dynamics in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Methods in Cell Biology. 131, 107-126 (2016).</li>
<li>Qu, X., Kumar, A., Bartolini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+microtubule+dynamics+at+excitatory+presynaptic+boutons+in+primary+hippocampal+neurons+and+acute+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Live imaging of microtubule dynamics at excitatory presynaptic boutons in primary hippocampal neurons and acute hippocampal slices.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100342(2021).</li>
<li>Tonnesen, J., Katona, G., Rozsa, B., Nagerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spine+neck+plasticity+regulates+compartmentalization+of+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spine neck plasticity regulates compartmentalization of synapses.</a> Nature Neuroscience. 17 (5), 678-685 (2014).</li>
<li>Buchsbaum, I. Y., Cappello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+migration+in+the+CNS+during+development+and+disease%3A+insights+from+in+vivo+and+in+vitro+models%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neuronal migration in the CNS during development and disease: insights from in vivo and in vitro models.</a> Development. 146 (1), (2019).</li>
<li>Rigby, M. J., Gomez, T. M., Puglielli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cell-axonal+growth+cone+interactions+in+neurodevelopment+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial cell-axonal growth cone interactions in neurodevelopment and regeneration.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 203(2020).</li>
<li>Barnes, A. P., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+axon-dendrite+polarity+in+developing+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons.</a> Annual Review of Neuroscience. 32, 347-381 (2009).</li>
<li>Multiphoton Microscope Leica TCS SP8 MP. Microsystems. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/">http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/</a> (2021).</li>
<li>ZEISS Lattice Lightsheet 7. Zeiss. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.zeiss.com/microscopy/int/products/imaging-systems/lattice-lightsheet-7.html">http://www.zeiss.com/microscopy/int/products/imaging-systems/lattice-lightsheet-7.html</a> (2021).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Como os cones de crescimento sentem e reagem ao seu ambiente circundante para coordenar a extensão e orientação simultânea do axônio ainda é uma questão de debate 3,18. Estudos pioneiros em substratos 2D forneceram um vislumbre dos mecanismos moleculares fundamentais que geram as forças que impulsionam a dinâmica do cone de crescimento durante a formação do axônio, o crescimento e a navegação 2,10,11,12,19. Mais recentemente, estudos em matrizes 3D revelaram quanta influência uma terceira dimensão tem no comportamento do cone de crescimento e, consequentemente, no crescimento do axônio 8,9. No entanto, os mecanismos intrincados que instruem a dinâmica do cone de crescimento in vivo continuam a ser minuciosamente examinados.
A preparação de culturas de fatias organotipas de cérebros IUE ou EUE é amplamente utilizada e bem documentada. Tornou-se um padrão dourado que permite aos cientistas obter insights sobre o desenvolvimento e comportamento dos neurônios no tecido cerebral vivo 20,21. De fato, esta técnica tem sido utilizada com sucesso em combinação com várias técnicas de imagem de alta resolução para visualizar processos moleculares específicos e eventos morfológicos in situ. Tais estudos incluem, mas não se limitam à formação de axônio e extensão19,22, migração neuronal cortical 19,22,23,24, dinâmica centrosome25,26, dinâmica microtúbula27, bem como a dinâmica funcional dos compartimentos pré e postssináspicos28,29.
Este protocolo aborda uma lacuna na neurobiologia experimental, visualizando a dinâmica do cone de crescimento do desenvolvimento de neurônios corticais in situ, nas culturas de fatias cerebrais agudas ex vivo e nas ferramentas para analisar os dados obtidos.
Culturas agudas de fatias cerebrais foram utilizadas para estabelecer esse protocolo porque elas (1) com alguma prática, são fáceis de gerar; (2) apresentar um sistema acessível para estudar cones de crescimento incorporados em um ambiente quase totalmente fisiológico, mas transparente o suficiente para permitir imagens de células vivas de alta resolução; (3) pode ser expandido para seu uso com uma miríade de linhas de camundongos transgênicos; (4) combinado com iUE ou EUE, fornecem potencial praticamente ilimitado para fornecer ferramentas moleculares para avaliar o desempenho de cones de crescimento e axônios in vivo sob perda/ganho de regimes de função, juntamente com repórteres fluorescentes e sondas de citoesqueleto.
Essa metodologia foi descrita no contexto tanto da UEE quanto da IUE. Embora ainda seja um método altamente confiável, o EUE resultou em uma incidência crescente de fatias cerebrais mostrando uma rede RG desorganizada em comparação com aquelas obtidas com iUE como método de entrega (Figura 4C). Distúrbios na matriz RG afetam fortemente a migração neuronal e o padrão de alongamento do axônio 30,31. Estes são parâmetros-chave que predizem onde encontrar axônios para análise em um determinado momento e o tipo de ambiente que eles estão navegando. Fatias cerebrais com uma rede RG significativamente interrompida normalmente têm prejudicado a estratificação do neurônio cortical. Isso, por sua vez, produz axônios com trajetórias caóticas. Portanto, é fortemente recomendável controlar a integridade estrutural da rede RG. Curiosamente, a má integridade estrutural se correlaciona com o aumento da idade do cérebro embrionário. De fato, tais efeitos nos embriões E12.5-E13,5 mais jovens normalmente não foram observados19.
O presente protocolo é minucioso e simples. No entanto, existem algumas etapas críticas em que é preciso ter cuidado e atenção especiais para obter resultados ideais. Estes foram expressamente observados no protocolo e incluem (1) afinar a quantidade de DNA usada na eletroporação para obter rotulagem esparsa; (2) evitar danos durante a extração de cérebros; (3) controlar a temperatura da agarose durante o invólucro cerebral; (4) solução de problemas para a porcentagem ideal de agarose para cérebros de uma determinada idade; e (5) seleção de fluoroforos, a experiência da qual se segue. Durante a otimização do protocolo, foi testado o desempenho de vários fluoroforos em células vivas em imagens in situ. As variantes monoméricas GFP EGFP e NeonGreen para a preparação dos plasmídeos marcados por LifeAct e Lyn foram escolhidas para este protocolo (Figura 5A,B). Além disso, a variante MScarlet da variante RFP foi testada e encontrada altamente adequada para esta configuração (dados não mostrados). TRFP multimédico (dimer) e ZsGreen (tetramer) (Figura 5C e Vídeo Suplementar 1, à direita) também foram testados. Estes fluoroforos super brilhantes dobráveis são recomendados quando o método requer uma rápida geração de sinal fluorescente após a entrega do DNA.
Uma prática comum no uso de culturas de fatias é utilizar fatias de diferentes cérebros para testar o controle e condições experimentais. Isso representa uma fonte inerente de variabilidade indesejada. Aqui, utilizou-se um sistema de expressão que permite modificação independente dos neurônios vizinhos e a expressão dos repórteres para identificação. Note-se que nesta demonstração (Figura 5C), não houve diferenças entre os neurônios que expressam qualquer um dos fluoroforos. No entanto, como exemplo, tal mistura plasmida combinada com uma linha de rato transgênico que abriga um gene sensível à Cre rotulará com neurônios tRFP (sensíveis a Dre) que permaneceram como tipo selvagem. Em contraste, o ZsGreen (também sensível ao Cre) rotulará os neurônios recombinados. Assim, cones de crescimento dos dois genótipos diferentes, e provavelmente também fenótipos, poderiam ser estudados lado a lado simultaneamente na mesma fatia cerebral.
A localização de axônios e cones de crescimento para análise é uma consideração importante. Os neurônios corticais polarizam-se enquanto migram radialmente da zona ventricular (VZ) em direção à placa cortical (CP). Durante esse processo, os neurônios formam um processo de liderança (um dendrite futuro) e um processo de trailing que se tornará o axônio, eventualmente unindo axônios pioneiros na zona intermediária (IZ), estabelecendo os setores axônio32. Portanto, para capturar cones de crescimento axonal, a imagem foi feita em fibras axonanas no IZ, incluindo axônios saindo do CP e axônios gerados precocemente já associados a feixes axonais; ou eventualmente, em fibras que transversam o IZ e se estendem abaixo dela (Figura 7).
Este protocolo torna viável realizar imagens de super resolução de neurônios dentro de fatias organotipas. Historicamente, a dispersão de luz era um problema significativo enfrentado quando a imagem de espécimes espessos. Nas últimas duas décadas, amplos avanços em tecnologias ópticas tornaram possível a imagem de espécimes espessos. Aqui, um objetivo de longa distância de trabalho foi utilizado para visualizar melhor estruturas menores, como cones de crescimento. Inevitavelmente, este protocolo não captura eventos mais detalhados, como fluxo de actina retrógrada ou dinâmica de microtúbulos. O objetivo de longa distância de trabalho, que requer uma abertura numérica inferior (NA), preserva informações de fatias grossas. No entanto, também foi possível adaptar este protocolo para uso com objetivos de menor distância de trabalho. Isso exigiu uma transferência suave de fatias para um prato com fundo de vidro para preservar a integridade estrutural. No entanto, o uso deste método resultou em uma sobrevida mais curta - ~15 h - devido à perda de troca de gás (dados não mostrados). Ao contrário das culturas 2D, os cones de crescimento em 3D ocupam um volume maior e requerem compensação de artefatos de movimento no eixo z. Para aumentar a capacidade de imagem de eventos detalhados, a tecnologia confocal moderna deve ser utilizada. Portanto, recomenda-se usar um motor z-stack de varredura rápida, como o z-Galvo disponível em microscópios confocal altamente sensíveis33.
Note-se que este protocolo apresenta três limitações principais. Em primeiro lugar, muitas vezes é desafiador controlar níveis de expressão/número de células expressas de qualquer plasmídeo in vivo. Isso introduz a variabilidade entre todas as fatias, mesmo mantendo a mesma concentração plasmida. Portanto, a seleção dos elementos regulatórios na expressão vetores utilizados deve ser predeterminada com cuidado. Em segundo lugar, eventos detalhados de imagem usando pastilhas de membrana atualmente não são viáveis. Essa segunda limitação pode ser superada com as atualizações metodológicas propostas no parágrafo anterior. Por fim, os cones de crescimento são altamente fotosensíveis e podem rapidamente se tornar fotobleachados. Portanto, imagens frequentes dos cones de crescimento, por apenas 5 minutos usando microscópios de varredura a laser podem frequentemente colapsar os cones de crescimento. Nesse sentido, um novo avanço nos dispositivos gerados por microscopia de folha de luz pode ser adaptado para imagens de longo prazo das fatiascerebrais 34.
Protocolos desse tipo são imaginados para abrir novos caminhos de pesquisa, permitindo uma melhor compreensão do que é preciso para um cone de crescimento ler e reagir em direção a um ambiente in vivo complexo e, mais importante, desvendar a mecânica dessa sofisticada interação.

Os neurônios são células altamente polarizadas que representam a unidade computacional básica no sistema nervoso. Eles recebem e emitem informações que dependem da compartimentação dos locais de entrada e saída: dendritos e axônios, respectivamente1. Durante o desenvolvimento, os axônios se estendem enquanto navegam em um ambiente complexo incrível para chegar ao seu destino. A navegação axon é guiada pelo cone de crescimento, uma estrutura sensorial localizada na ponta do axônio em desenvolvimento. O cone de crescimento é responsável por detectar pistas ambientais e traduzi-las na reorganização espacial dinâmica de seu citoesqueleto 2,3. As reações morfom mecânicas resultantes instruem o cone de crescimento a estender ou retrair-se da deixa de acionamento, levando a manobras específicas de axônio.
O entendimento atual da dinâmica da extensão do axônio e do cone de crescimento decorre de estudos que avaliam o crescimento do axônio em relação aos substratos bidimensionais (2D) 2,4,5,6,7. Esses estudos pioneiros identificaram uma interação sofisticada entre cones de crescimento e substratos de crescimento e revelaram diferenças marcantes dependentes de características de substrato, como adesivo e rigidez 8,9. Liderados por esses insights, as pistas ambientais extracelulares foram hipóteses para ditar o crescimento do axônio, com o citoesqueleto de cone de crescimento executando esse crescimento 2,10,11,12. Notavelmente, os neurônios podem estender axônios em substratos não adesivos (por exemplo, poli-lysina, poli-ornitina)13. Além disso, a rigidez do substrato pode influenciar a taxa de crescimento do axônio independente dos complexos adesivoscelulares 8. Assim, estudar a dinâmica do cone de crescimento em substratos 2D sozinhos não pode modelar com precisão o equilíbrio de forças que surgem da interação de cones de crescimento axonal com ambientes tridimensionais (3D) fisiologicamente relevantes, como os encontrados in vivo.
Para superar as limitações dos ensaios 2D, o crescimento do axônio e a dinâmica do cone de crescimento têm sido estudados em matrizes 3D 8,9. Essas matrizes representam um contexto mais fisiológico, mas permitem estudar mecanismos intrínsecos de crescimento de axônio. Permite o exame do cone de crescimento de forma unicelular em uma variedade de condições e tratamentos farmacológicos9. Em tais ambientes 3D, os axônios apresentaram dinâmicas citoesqueléticos distintas e cresceram mais rápido do que os observados nos neurônios 2Dcultivados 9. Esses estudos elegantes demonstraram a influência de uma dimensão extra na reorganização do citoesqueleto do cone de crescimento e, consequentemente, no seu comportamento.
Apesar das vantagens aparentes apresentadas pelas matrizes 3D sobre superfícies 2D no suporte ao desenvolvimento neuronal nativo e ao crescimento do axônio, elas continuam sendo um andaime sintético simplificado que não pode refletir a complexidade da dinâmica observada no tecido do sistema nervoso central (SNC). Aqui, a entrega de plasmídeos repórteres pelo ex utero e na eletroporação uteral foi combinada com a cultura de fatia organotípica cerebral e imagens de super-resolução ao vivo in situ para analisar a dinâmica do cone de crescimento dentro de um contexto fisiológico. Essa metodologia permite a visualização do desenvolvimento de axônios ao experimentar a tridimensionalidade dos ambientes in vivo e a complexidade de sua composição físico-química. Por fim, são descritos procedimentos fáceis de usar para medir a dinâmica do cone de crescimento e crescimento do axônio usando softwares comumente licenciados e disponíveis publicamente.

<table><tbody><tr><td>Adson Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21202</td><td>Cabra Anti-Rato</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21236</td><td>Cabra Anti-Rato</td></tr><tr><td>Anti-Vimentina anticorpo</td><td>sigma-Aldrich</td><td>V2258-.2ML</td><td>Camundongo monoclonal, clone LN-6, ascite fluido</td></tr><tr><td>B27 suplemento</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td>17504044</tr><tr><td>Betadine</td><td>B. Braun</td><td>3864154</td><td></td></tr><tr><td>Biozym Sieve GP Agarose</td><td>Biozyme</td><td>850080</td><td></td></tr><tr><td>Braunol, Spr&uuml; hflasche</td><td>B. Braun</td><td>3864073</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina (Temgesic)</td> <td>GEHE Pharma</td><td>345928</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DMZ extrator de eletrodo unevirsal</td><td>Zeitz</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Barbeador elétrico</td><td>Andes</td><td>NA</td><td>ProClip UltraEdge Super 2-Speed modelo</td></tr><tr><td>Enrofloxacina (Baytril)</td> <td>Bayer</td><td>3543238</td><td>2,5% (peso/vol)</td></tr><tr><td>Pontas de pipeta de microcarregador Eppendorf</td><td>FischerScientific</td><td>10289651</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252-5G</td><td>Conteúdo de corante &ge; 85</td></tr>% <tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Fiji 2.1.0</td><td>NIH</td><td>NA</td><td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td></tr><tr><td>Tesouras Finas</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>14058-09</td><td>ToughCut/Straight/9cm</td></tr><tr><td>FluoroDish Placa de Cultura de Células</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD5040-100</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount Meio de Montagem Aquosa</td><td>sigma-Aldrich</td><td>F4680-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>MedPex</td><td>3705391</td><td>5%</td></tr><tr><td>GlutaMAX Suplemento</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14025092</td><td>cálcio, magnésio, sem fenol vermelho</td></tr><tr><td>Soro de cavalo</td><td>Pan-Biotech</td><td>P30-0711</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 9.7.2</td><td>Bitplane</td><td>NA</td><td>https://imaris.oxinst.com/products/imaris-for-neuroscientists</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Virbac</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina isotônica solução</td><td>B. Braun</td><td>8609261</td><td>0,90%</td></tr> <tr><td>Leica VT1200 S vibratomo</td><td>Leica</td><td>14048142066</td><td></td></tr><tr><td>LSM 880 com Airyscan</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Metacam</td><td>Venusberg Apotheke</td><td>8890217</td><td>5 mg / ml</td></tr><tr><td>Ratos</td><td>Janvier Labs</td><td>NA</td><td>C57BL / 6JRj</td></tr><tr><td>Micro-Adson Fórceps</td><td>Ferramentas de Ciências Finas</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Jarra de Armazenamento de Micropipetas</td><td>World Precision Instruments</td><td>E210</td><td>&nbsp; 16.16.27</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>NA</td><td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/excel/cfq7ttc0k7dx?activetab=pivot:overviewtab</td></tr><tr><td>Inserção de Cultura de Células Millicell</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td>30&nbsp; mm, PTFE hidrofílico, 0,4&nbsp; &micro; m</td></tr><tr><td>Moria Colheres Perfuradas</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-18</td><td></td></tr><tr><td>Moria Spoon</td><td>Fine Science Tools</td><td>10321-08</td><td></td></tr><tr><td>Meio Neurobasal, menos fenol vermelho</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12348017</td><td></td></tr><tr><td>Neuropan-2 suplemento</td><td>Pan-Biotech</td><td>P07-11010</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra normal</td><td>Abcam</td><td>ab138478</td><td></td></tr><tr><td>Porta-agulhas Olsen-Hegar com Tesoura</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>p-Tub-alpha-1-Dre</td><td>Addgene</td><td>133925</td><td></td></tr><tr><td>p-Tub-alpha-1-iCre</td><td>Addgene</td><td>133924</td><td></td></tr><tr><td>p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP</td><td>Addgene</td><td>175437</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen</td><td>Addgene</td><td>175438</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen</td><td>Addgene</td><td>175257</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PicoNozzle Kit v2</td><td>World Precision Instruments</td><td>5430-ALL</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Tweezertrodes</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0487</td><td>1 mm / 3 mm</td></tr><tr><td>QIAGEN Maxi kit</td><td>QIAGEN</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>Clipe de fechamento de ferida reflexo World</td><td>Precision Instruments</td><td>500344-10</td><td>7 mm</td></tr><tr><td>Sekundenkleber Pattex Mini Trio</td><td>Lyreco</td><td>4722659</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de eletroporação de onda quadrada ECM830</td><td>Harvard Aparelho</td><td>W3 45-0052</td><td></td></tr><tr><td>Gaze estéril</td><td>Braun Askina</td><td>9031216</td><td></td></tr><tr><td>Lubrificante estéril pomada para os olhos</td><td>Bayer Vital</td><td>PZN1578675</td><td></td></tr><tr><td>Luvas cirúrgicas estéreis</td><td>Sempermed</td><td>14C0451</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Roth</td><td>4621.2</td><td></td></tr><tr><td>Suturas cirúrgicas de seda Supramid 5-0</td><td>B. Braun</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidro de parede fina</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100-4</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Vannas tesoura de mola</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Slide 8 Poço Fundo de Vidro</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ visualização da dinâmica do cone de crescimento e crescimento do axon em culturas agudas de fatias de cérebro embrionário ex vivo

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

Durante o desenvolvimento neuronal, os axônios navegam pelo ambiente cortical para chegar aos seus destinos finais e estabelecer conexões sinápticas. Cones de crescimento - as estruturas sensoriais localizadas nas pontas distais do desenvolvimento de axônios - executam esse processo. Estudar a estrutura e a dinâmica do cone de crescimento é crucial para entender o desenvolvimento axonal e as interações com o sistema nervoso central circundante (SNC) que lhe permitem formar circuitos neurais. Isso é essencial ao elaborar métodos para reintegrar axônios em circuitos neurais após lesões em pesquisas fundamentais e contextos pré-clínicos. Até agora, a compreensão geral da dinâmica do cone de crescimento é baseada principalmente em estudos de neurônios cultivados em duas dimensões (2D). Embora, sem dúvida, fundamental para o conhecimento atual da dinâmica estrutural do cone de crescimento e da resposta a estímulos, estudos 2D deturpam o ambiente fisiológico tridimensional (3D) encontrado por cones de crescimento neuronal no tecido CNS intacto. Mais recentemente, os géis de colágeno foram empregados para superar algumas dessas limitações, permitindo a investigação do desenvolvimento neuronal em 3D. No entanto, tanto os ambientes sintéticos 2D quanto os 3D carecem de sinalização dentro do tecido CNS, que direcionam a extensão e o pathfinding de axônios em desenvolvimento. Este protocolo fornece um método para estudar axônios e cones de crescimento usando fatias cerebrais organotípicas, onde os axônios em desenvolvimento encontram pistas físicas e químicas fisiologicamente relevantes. Ao combinar afinação na eletroporação uterópica e ex utero para entregar repórteres fluorescentes e pouco, juntamente com microscopia de super resolução, este protocolo apresenta um pipeline metodológico para a visualização da dinâmica do axônio e do cone de crescimento in situ. Além disso, uma descrição detalhada do kit de ferramentas da análise de dados de imagem de células vivas e de longo prazo está incluída.

Os resultados representativos obtidos com o fluxo de trabalho do método descrito são mostrados. Os camundongos E15.5 foram usados na presente demonstração, embora este protocolo seja facilmente adaptável a praticamente todas as idades embrionárias que variam de E11 ao E17 tardio. Neste protocolo, seja ex eletroporação do útero (EUE; Figura 2A, 2C-I) ou em eletroporação uterórica (IUE; As figuras 2B,C e 2J-Q) foram utilizadas para entregar plasmídeos nos neurônios progenitores que revestem os ventrículos laterais. Esses progenitores são a fonte de futuros neurônios de projeção cortical (CPN)15,16. As misturas plasmóides foram preparadas para conduzir a expressão esparsa específica dos neurônios de ambos os membros da membrana (Lyn)-mNeonGreen (Figura 1A) ou do LifeAct (E)GFP (Figura 1B) para avaliar o comportamento geral e a dinâmica da actina em cones de crescimento, respectivamente. Além disso, foi incluído um mix de plasmídeos destinado a rotular neurônios individuais com proteína fluorescente verde (ZsGreen) (Figura 1C) turbo(t)-RFP ou zoanthus sp. (Zs) (Figura 1C). Isso facilita o monitoramento do comportamento do cone de crescimento a partir de neurônios vizinhos independentes.
A dissecção cerebral de embriões eletroporados é um passo crucial que precisa ser cuidadosamente realizado para obter fatias de alta qualidade, preservando a estrutura cerebral nativa. Os instrumentos de dissecção e vibratome foram preparados de antemão e cuidadosamente esterilizados por etanol (Figura 3A,B). Em seguida, as cabeças dos embriões eletroporados foram cuidadosamente dissecadas e os cérebros foram extraídos. Aqui, são mostradas dissecção representativa dos cérebros dos embriões submetidos ao EUE em E15 (Figura 3C-F) e E12,5 (Figura 3G-J). Os cérebros são imediatamente envoltos em uma matriz de agarose, fatiado e colocado em pastilhas de membrana PTFE dentro de uma placa de vidro inferior para incubação (Figura 3K-M).
O estado de saúde das fatias cerebrais é um ponto significativo para o controle para garantir resultados confiáveis. Uma inspeção visual para qualquer contaminação foi realizada diariamente. Além disso, uma vez que a cultura foi finalizada, as fatias cerebrais são fixas e submetidas à imunohistoquímica. Aqui, 4′,6-diamidino-2-fenildole (DAPI) foi usado para controlar a organização celular global e a coloração de vimentina para revelar a organização gliana; particularmente, andaime radial glia (RG). Normalmente, fatias cerebrais cultivadas com sucesso derivadas da IUE ou eue mostram distribuição celular normal, como revelado pelo DAPI e uma matriz um tanto organizada de RG com processos de contato de pial afeticamente orientados17 (Figura 4A,B, respectivamente). Ocasionalmente, são observadas perturbações acentuadas nos andaimes RG em fatias cerebrais cultivadas, especialmente naqueles derivados da eletroporação eue (Figura 4C). As fatias cerebrais com andaime RG extremamente desorganizado mostram migração neuronal prejudicada e crescimento de axônio defeituoso (não mostrado). Portanto, controlar o andaime RG é um método fácil pós-cultura para classificar os dados obtidos a partir de fatias cerebrais confiáveis.
As fatias cerebrais derivadas da IUE ou da EUE com a mistura plasmida expressa lyn-mNeonGreen resultam em rotulagem de neurônios esparsos semelhantes. Um CPN piramidário representativo expressando Lyn-mNeonGreen e o comportamento dinâmico de seu cone de crescimento é mostrado como um exemplo (Figura 5A e Vídeo Suplementar 1, superior esquerdo). Além disso, os neurônios foram rotulados usando um plasmid expressando uma sonda actina para analisar a dinâmica actina de cones de crescimento axonal in situ (Figura 5B e Vídeo Suplementar 1, inferior esquerdo). Os experimentos in situ também foram realizados com um design plasmídeo expresso de fluoróforo dual-Cre/Dre (Figura 1C e Vídeo Suplementar 1, à direita). fluoroforos tRFP ou ZsGreen neste plasmídeo podem ser especificamente e individualmente ativados por recombinases dre ou cre, respectivamente, em neurônios vizinhos (Figura 5C). Esta formação experimental permite a análise lado a lado dos cones de crescimento de neurônios de controle com neurônios modificados vizinhos (qualquer perda ou ganho de função). Isso contorna a variabilidade decorrente do uso de diferentes fatias para testar o controle e as condições experimentais.
Foram analisados os kymógrafos gerados a partir do filme gravado, dos quais parâmetros dinâmicos de crescimento, como atividade strusiva ao longo do tempo e comprimento de crescimento, podem ser facilmente obtidos (Figura 6A). Observe que um simples ajuste na resolução temporal do lapso de tempo permite a medição da velocidade de alongamento do axônio por 2 h (Figura 6A). Além disso, a variação do volume de cone de crescimento ao longo do tempo - uma medida da atividade dinâmica do cone de crescimento geral - pode ser facilmente obtida, neste caso com software licenciado (Figura 6B e Figura 6E,F). Isso pode ser usado para avaliar a velocidade da esteira actin e o equilíbrio de filopodia/lamellipodia durante a atividade de exploração do cone de crescimento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig01.jpg"> Figura 1: Esquemas dos plasmídeos usados no protocolo. (A) pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen. (B) p-Tub-alfa-1-LifeAct-GFP. (C) pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-pA-lox-ZsGreen-pA. Informações relevantes sobre componentes plasmídeos e a origem do fluoróforo são encontradas nas caixas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig02.jpg"> Figura 2: Fluxo de trabalho de ex utero e em eletroporação utericana de camundongos E15,5. (A) Montar a estação de cirurgia para eletroporação ex utero. (B) Configuração da estação de cirurgia para eletroporação uteral. (C) Chifres uterinos puxados para fora da cavidade abdominal do rato anestesiado. (D) Extração de um embrião do saco uterino. (E) Sacrifício embrionário por transeção completa da medula espinhal por meio de incisão diagonal; note que a decapitação foi evitada. (F) Colocação de embrião no suporte e injetada com DNA/mistura verde rápida no ventrículo lateral esquerdo. (G,H) Posicione a cabeça do embrião entre eletrodos de pinça de platina com o cátodo (seta vermelha) sobre o córtex em um ângulo de 60°. (I) Colocação dos braços do embrião (setas pretas) fora do suporte para evitar o deslizamento do embrião durante o procedimento. (J) Rotação do embrião dentro do saco uterino para expor a cabeça. (K,L) Injeção de DNA/mistura verde rápida nos ventrículos laterais do embrião através da parede uterina. (M) Posicione a cabeça do embrião entre eletrodos de pinça de platina com um cátodo (seta vermelha) sobre o córtex em um ângulo de 60°. (N) Incisão muscular suturada através da sutura de travamento de funcionamento. (O) Incisão de pele suturada através de uma sutura interrompida. (P) Fixação da ferida usando clipes cirúrgicos de ferida e desinfecção usando betadina. (Q) Colocação do mouse na gaiola de recuperação com luz de aquecimento infravermelho distante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig03.jpg"> Figura 3: Extração de cérebros E15.5 e E12,5 e procedimento de cultura de fatia organotípica. (A) Ferramentas utilizadas para o procedimento de extração cerebral. (B) Criada na estação de cultura organotípica. (C-F) Extração do cérebro E15.5. (G-J) Extração do cérebro E12.5. Linhas pontilhadas destacam a localização das incisões. Flechas vermelhas estão apontando a direção de puxar por fórceps. (K) Incorporar o cérebro em uma antena de 3 cm contendo 3% de baixa agarose de derretimento, deixando uma lacuna de espaçamento de 1-2 mm de agarose sob o cérebro. (L) Coleção de fatia cerebral de 150 μm. (M) Colocação de fatias cerebrais em pastilhas de membrana PTFE imobilizadas em um prato de 35 mm usando filme de parafina (seta azul). A marcação da estrela vermelha indica uma determinada coleção de fatias cerebrais do vibratome (L) e sua transferência para a membrana PTFE (M). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig04.jpg"> Figura 4: Estrutura de células gliais radiais conservadas em fatias organotípicas saudáveis. Imagens confocal de fatias cerebrais E17.5 revelando matriz RG (vimentina; verde) e organização celular global (DAPI; magenta) seguindo IUE (A) e EUE (B,C). Observe os fortes distúrbios na matriz RG que podem ocasionalmente resultar de EUE (C). As ampliações correspondem aos quadros pontilhados vermelhos na figura principal: barras de escala, 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig04large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig05.jpg"> Figura 5: Visualização in situ da dinâmica do cone de crescimento em fatias organotipópicas agudas. (A,B) Neurônios e seus cones de crescimento correspondentes rotulados com Lyn-mNeonGreen e LifeAct-GFP, respectivamente. Estrela vermelha marcando o cone de crescimento de Lyn-mNeonGreen expressando neurônio. Asterisco azul marcando cone de crescimento do lifeact-GFP expressando neurônio. (C) Neurônios vizinhos rotulados com o sistema plasmídeo duplo contendo tRFP (magenta) e ZsGreen (verde) e seus cones de crescimento correspondentes. Cones de crescimento imageados (à direita) estavam fora do quadro capturado (esquerda), obtidos logo após a aquisição do lapso de tempo do cone de crescimento; barras de escala, 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig05large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig6v2.jpg"> Figura 6: Análise da velocidade de crescimento do axônio e do volume do cone de crescimento. (A) Traçado de Axon em um neurônio expressando Lyn-mNeonGreen (topo) e seu kymograph correspondente (abaixo) gerados usando ImageJ. (B) Reconstrução do vídeo z-stack de cone de crescimento usando o software de análise de imagem (topo) e o mesmo cone de crescimento destacado usando a ferramenta de medição de superfícies (abaixo). (C) Gráficos que mostram mudanças na velocidade de crescimento ao longo do tempo para vários axônios. (D) A velocidade média de crescimento dos axônios é quantificada em (C). (E) Gráfico mostrando as alterações no volume do cone de crescimento ao longo do tempo. (F) O volume médio de cones de crescimento é quantificado em (E); barra de escala, 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig6v2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig07.jpg"> Figura 7: Migração radial e polarização neuronal de neurônios cortical piramimais. Diagrama ilustrando o desenvolvimento de neurônios cortical piramifecionais (rosa) migrando radialmente da zona ventricular germinal (VZ) em direção à superfície pia. Guiados por processos radiais de glia (cinza), neurônios polarizados migratórios estabelecem um processo de liderança, dendrito futuro e processo de trailing, futuro axônio, que continuam a se estender para baixo em direção à zona intermediária (IZ). As caixas vermelhas tracejadas representam as áreas corticais onde os cones de crescimento foram imageados. Especificamente no IZ, zona subventricular (SVZ) ou juntando pacotes de axônio (verde). A ilustração foi criada com uma ferramenta baseada na Web, BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Plasmídeo</td>
			<td>Concentração (μg/μL)</td>
			<td>Uso pretendido</td>
		</tr>
<tr>
<td>pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen</td>
			<td>0.25</td>
			<td rowspan="3">Rotulagem de proteína direcionada à membrana (Lyn)</td>
		</tr>
<tr>
<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Tub-alfa-1-iCre</td>
			<td>0.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Tub-alfa-1-LifeAct-GFP</td>
			<td>0.125</td>
			<td>Rotulagem de fisomostos (F-actin) em cones de crescimento</td>
		</tr>
<tr>
<td>pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen</td>
			<td>1</td>
			<td rowspan="5">Rotulagem independente de duas populações de neurônios vizinhos</td>
		</tr>
<tr>
<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Tub-alfa-1-iCre</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Tub-alfa-1-Dre</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Lista de plasmídeos usados no Protocolo. Nome, concentração e uso pretendido de cada plasmídeo utilizado.
Vídeo suplementar 1: Visualização in situ da dinâmica do cone de crescimento em fatias organotipópicas agudas. Dinâmica dos cones de crescimento rotulados com Lyn-mNeonGreen (canto superior esquerdo) e LifeAct-GFP (inferior esquerdo). Os cones de crescimento vizinhos são rotulados diferencialmente com o sistema plasmídeo duplo contendo tRFP (magenta; superior direito) e ZsGreen (verde; inferior direito). Intervalo de imagem, 2,5 s. Barras de escala, 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/Supplementary_Video_1.mp4" target="_blank">Por favor, clique aqui para baixar este Arquivo.</a>

Este protocolo demonstra um método simples e robusto para estudar na dinâmica do cone de crescimento e crescimento do axônio. Ele descreve como preparar ex vivo fisiologicamente relevantes fatias cerebrais agudas e fornece um pipeline de análise amigável.

In situ Visualização da Dinâmica do Cone de Crescimento e Crescimento do Axon em Culturas agudas de fatias de cérebro embrionário ex vivo

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...

Como os axônios navegam na complexa matriz do sistema nervoso central é uma questão fundamental na neurobiologia. Este protocolo permite o estudo da dinâmica do cone de crescimento e crescimento do axônio no ambiente fisiológico com imagem de alta resolução. Este protocolo descreve um pipeline fácil de usar de ponta a ponta para a entrega de DNA no cérebro embrionário do rato, preparações para fatias organotiplicas de alta qualidade e um guia passo a passo para aquisição e análise de imagens.Embora originalmente projetado para estudar a dinâmica do axônio no sistema nervoso central embrionário, este protocolo poderia ser ajustado para permitir a cultura organotípica e a visualização da plasticidade do axônio após condições traumáticas ou patológicas. O protocolo em si é relativamente simples. No entanto, alcançar sua primeira rotulagem e preservação de estruturas cerebrais são pontos críticos.Portanto, as etapas de eletroporação, dissecção cerebral e corte de medidas requerem cuidados extras. Demonstrar que o procedimento será útil, e o doutorando é do laboratório de Bracket. Depois de anestesiar uma fêmea grávida, faça uma incisão para retirar ambos os chifres uterinos usando um broto de algodão encharcado em soro fisiológico quente ou fórceps, cuidadosamente agarrando os espaços entre os embriões.Em seguida, coloque os embriões em gaze molhada. Depois de cortar o saco uterino, remova cada embrião. Coloque os embriões em um prato de 10 centímetros contendo HBSS suplementado com glicose no gelo.Para eletroporação ex utero, pegue um embrião e coloque-o no suporte. Em seguida, insira cuidadosamente o capilar de vidro contendo o DNA rápida mistura verde através do crânio do embrião no ventrículo lateral, e injete dois a três microliters da mistura plasmida de DNA em cada ventrículo. Em seguida, segure a cabeça do embrião entre eletrodos de pinça de platina no ângulo apropriado para atingir a área cerebral desejada, com o cátodo voltado para a área onde a transferência de DNA é pretendida.Pois na eletroporação uterina, depois de retirar os chifres uterinos e colocar os embriões em uma gaze molhada como demonstrado anteriormente, use as pontas dos dedos para girar suavemente o embrião dentro do útero até que as suturas lambdoidal e saggital estejam localizadas. Em seguida, insira cuidadosamente o capilar de vidro contendo a mistura verde rápida do DNA através da parede uterina e crânio de embrião no ventrículo lateral, e injete dois a três microlitradores da mistura plasmida de DNA em um ou ambos os ventrículos como desejado com um máximo de dois microliters por ventrículo. Após a injeção, segure a cabeça do embrião entre eletrodos de pinça de platina no ângulo apropriado para atingir a área cerebral desejada com o cátodo voltado para a área onde a transferência de DNA é pretendida.Uma vez que todos os embriões necessários tenham sido eletroporados, use um broto de algodão salino encharcado para colocar suavemente os chifres uterinos de volta dentro da cavidade abdominal. Suturar as incisões musculares e cutâneas usando material de sutura 5-0, em seguida, fixar a ferida usando clipes de sutura, e desinfetar a ferida pulverizando-a com betadina. Coloque o mouse de volta na gaiola de recuperação e mantenha o calor usando uma luz de aquecimento infravermelha distante por pelo menos 20 minutos pós-procedimento.Conserte a cabeça do embrião sob um microscópio de dissecção. Em seguida, remova a pele do crânio cortando ao longo da linha média começando da base da cabeça em direção ao nariz. Descasque a pele no crânio lateralmente fazendo uma grande lacuna suficiente para o cérebro ser extirpado.Em seguida, para remover o cérebro insira a ponta fechada da tesoura de dissecção estéril começando sob a lâmpada olfativa e movendo-se em direção ao tronco cerebral. Em seguida, corte o tronco cerebral e corte muitos pedaços soltos de meninges ao redor do cérebro. Usando uma colher perfurada, pegue o cérebro e remova o excesso de líquido, esfregando o fundo da colher contra papel de tecido seco.Em seguida, coloque o cérebro em um prato de agarose no gelo. Em seguida, usando uma colher menor misture a agarose por 10 segundos para mesmo resfriamento, em seguida, manobrar o cérebro para o meio do prato colocando-o horizontalmente com o lado dorsal para cima e garantindo que ele está completamente coberto com agarose de todas as direções. Pegue suavemente o bloco de agarose da estação de trabalho Vibratome e seque o fundo, esfregando contra papel de tecido.Em seguida, coloque o bloco na área colada do suporte do espécime com o lado rostral do cérebro voltado para cima, e coloque o suporte do espécime no gelo. Deixe a cola secar por um minuto. Corte o cérebro em fatias coronais em um ângulo de 15 graus.Em seguida, usando espátulas limpas, colete as fatias cerebrais e coloque-as em uma membrana PTFE imobilizada em uma antena de fundo de vidro de 35 milímetros usando Parrafin. Colete até cinco fatias cerebrais por membrana. Em seguida, usando uma pipeta de 200 microliteres remova o excesso de solução de glicose HBSS ao redor das fatias na membrana deixando as fatias semi-secas, em seguida, adicione 500 microliters de mídia de fatia pré-war diretamente ao espaço sob a membrana e incubar as fatias a 35 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.Para o crescimento do axônio por imagem, localize uma região do córtex com densidade celular baixa a média. Enquanto para a dinâmica do cone de crescimento de imagens, localize um cone de crescimento na zona imediata do córtex ou zona subventricular. Em seguida, defina um tamanho de pilha Z.Para o crescimento do axônio em uma grande pilha Z, defina um tamanho de passo de dois micrômetros e para cones de crescimento em uma pilha Z menor, defina um tamanho de passo de um micrômetro. Para análise de dados, abra o arquivo de imagem em Fiji clicando no arquivo e, em seguida, abra e selecione a imagem. Obtenha a projeção de intensidade máxima do lapso de tempo clicando na imagem, seguido de pilhas, projeção Z e projeção de intensidade máxima.Passe pelo lapso de tempo e localize um axônio em crescimento. Uma vez localizado, desenhe uma linha através do axônio em crescimento, começando pela ponta do axônio no primeiro quadro e seguindo o axônio durante todo o lapso de tempo. Em seguida, canta o plugin kymo re-slice wide.Defina a escala do kymograph indo para a imagem, em seguida, propriedades. Depois de definir a distância em micrômetros, largura de pixel e o tempo em segundos ou minutos, e altura do pixel, vá analisar e clicar em medida. Para medir o volume do cone de crescimento, abra o arquivo de imagem no software de análise de imagens clicando em arquivo, aberto e selecionando o arquivo de interesse.Em seguida, selecione o assistente de adicionar novas superfícies na etapa um, em configurações de algoritmo, selecione segmento apenas uma região de interesse, e na segunda etapa, corte o quadro para se encaixar em todo o cone de crescimento em todos os quadros. Em seguida, no passo três, mantenha o limiar em intensidade absoluta e, no passo quatro, garanta que toda a região do cone de crescimento seja limiar. Em seguida, na etapa cinco, no tipo de filtro selecione o número de voxels LMG para um.Selecione o botão executar para executar todas as etapas de criação e finalizá-lo adicionando novo assistente de superfícies. Finalmente, na guia estatísticas na parte superior da janela do assistente, selecione valores e volumes específicos sob a guia detalhada. Tipicamente, fatias cerebrais cultivadas com sucesso derivadas de eletroporação utericante ou ex utero mostram distribuição celular normal e uma matriz organizada de glia radial com processos de pilo-contato a apicamente orientados.Ocasionalmente, uma ex eletroporação uteróvia marcou distúrbios nos andaimes gliais radiais e fatias cerebrais cultivadas são observadas tornando este controle de coloração recomendável. Um neurônio cortical piramimático representativo expressando Lyn-mNeonGreen e o comportamento dinâmico de seu cone de crescimento é mostrado aqui. Além disso, os neurônios foram rotulados usando uma sonda de actina expressando plasmida para analisar a dinâmica actina de cones de crescimento axonal in situ.Experimentos in situ também foram realizados com um duplo cre dre fluorophore expressando design plasmídeo, onde fluoroforos tRFP ou ZsGreen poderiam ser especificamente e individualmente ativados por dre ou cre recombinases, respectivamente em neurônios vizinhos. A partir de kymographs, parâmetros dinâmicos de crescimento, como velocidade de crescimento para vários axônios e volume de cone de crescimento ao longo do tempo são facilmente obtidos. Isso pode ser usado para avaliar a velocidade da esteira actin e o equilíbrio entre filopodia e lamellapodia durante a atividade de exploração do cone de crescimento.É importante manter a estrutura cerebral e ajustar as concentrações plasmidas para alcançar rotulagem esparsa. Isso é crucial para uma visualização precisa de axônios e cones de crescimento no córtex. Dependendo dos plasmas selecionados e do fundo genético, este protocolo permite que os usuários modifiquem neurônios ou o ambiente em que crescem, permitindo uma ampla gama de estudos.Ao permitir o acesso de alta resolução aos neurônios in situ, essa técnica permite que os neurocientistas interroguem a interação dinâmica entre cones de crescimento e métricas do sistema nervoso central, tanto em níveis morfológicos quanto moleculares.

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Neurociência

Nós apresentamos um método para preparar fatias organotípicas de embriões meados de gestação do rato para a imagem de cultivo e de lapso de tempo de crescimento dos nervos periféricos.

Cultura Slice organotípicas de GFP-expressando embriões de camundongos para imagens em tempo real de crescimento dos nervos periféricos

Este protocolo descreve um ensaio fatia organotípicas otimizado para o cérebro pós-natal e imagens de alta resolução de lapso de tempo de migração neuroblastos no fluxo migratório rostral.

Um Ensaio Slice organotípicas para High-Resolution Imaging Time Lapse de migração neuronal no cérebro pós-natal

Este vídeo demonstra a cultura ex vivo e a imagem de fatias oculomotoras de embriões de camundongos transgênicos. Os embriões são isolados e incluídos em agarose. Usando um vibratome, são obtidas fatias contendo os núcleos oculomotores e os olhos. As fatias são mantidas em cultura e fotografadas usando um microscópio de fluorescência.

Cultura ex vivo e imagem de fatias oculomotoras de embriões de camundongos transgênicos

Source:&lt;a style='text-decoration:none;' href='https://dx.doi.org/10.3791/55886-v'&gt; Wiegreffe, C., et. al.,  Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (2017) Este vídeo demonstra a microscopia confocal de lapso de tempo para observar a migração radial do neurônio cortical da zona subventricular para a placa cortical por meio de andaimes gliais radiais em fatias de cérebro embrionário de...

Imagem de lapso de tempo da migração radial de neurônios corticais em fatias de cérebro embrionário de camundongo transduzidas

Migração neuroblastos é um evento fundamental para a neurogênese pós-natal. Nós descrevemos um protocolo para a rotulagem eficiente de neuroblastos por eletroporação in vivo pós-natal e visualização posterior de sua migração utilizando time-lapse de imagens de fatias cerebrais agudas. Nós incluímos uma descrição para a análise quantitativa da dinâmica neuroblastos por rastreamento de vídeo.

In vivo Eletroporação pós-natal e tempo-lapso de neuroblasto Migração na aguda fatias do cérebro do rato

Neural mitose de células progenitoras é um parâmetro crítico da neurogénese. Muito do nosso entendimento da mitose progenitor neural é baseado na análise de tecido fixo. Imagens ao vivo em fatias de cérebro de embriões é uma técnica versátil para avaliar a mitose com resolução temporal e espacial de alta em um ambiente controlado.

Imagens ao vivo da mitose no desenvolvimento Cortex embrionárias de camundongos

Este protocolo fornece instruções para a observação direta de neurônios corticais que migram radialmente. A eletroporação in utero , a cultura de fatia organotípica e a imagem confocal de lapso de tempo são combinadas para estudar de forma direta e dinâmica os efeitos da sobre-expressão ou downregulation de genes de interesse em neurônios migratórios e analisar sua diferenciação durante o desenvolvimento.

Imaginação confocal de lapso de tempo de neurônios migratórios na cultura de fatias organotípicas do cérebro de mouse embrionário Usando<em&gt; Em Utero</em&gt; Electroporação

Aqui, nós fornecemos um método confiável e de baixo custo para gerar electroporated culturas do cérebro organotypic fatia de embriões do rato apropriados para microscopia confocal e técnicas de geração de imagens ao vivo.

Ex Utero Eletroporação e culturas Organotypic fatia do cérebro embrionário Mouse para imagens ao vivo de migração gabaérgica interneurônios

Aqui, descrevemos um protocolo para a visualização de projeção dos neurônios motores e arborização do axônio em embriões de rato transgénicos Hb9::GFP . Depois de imunocoloração para os neurônios motores, usamos a microscopia de fluorescência folha de luz aos embriões de imagem para posterior análise quantitativa. Este protocolo é aplicável a outros processos de navegação do neurônio no sistema nervoso central.

Visualização do axônio Motor navegação e quantificação do axônio arborização em embriões de rato usando microscopia de fluorescência folha de luz

Um ensaio ex vivo da fatia permite que o conseqüência do nervo oculomotor seja imaged no tempo real. As fatias são geradas incorporando E 10.5 ISLMN: embriões de GFP no agarose, cortando em um vibratome, e crescendo em uma incubadora do estágio-parte superior. O papel das vias de orientação do AXON é avaliado pela adição de inibidores aos meios de cultura.

Cultura ex vivo oculomotor Slice de camundongos que expressam GFP embrionário para a imagem de lapso temporal do crescimento do nervo oculomotor

Durante o desenvolvimento do córtex cerebral, os neurônios e as células gliais se originam na zona ventricular que reveste o ventrículo e migram em direção à superfície do cérebro. Muitos genes estão envolvidos neste processo. Este protocolo apresenta a técnica para a imagem de lapso de tempo de neurônios migratórios e progenitores gliais.

Imagem de lapso de tempo de neurônios migratórios e progenitores gliais em fatias de cérebro de camundongo embrionário

Aprenda a visualizar dinâmica de cones de crescimento e crescimento axonal em fatias agudas de cérebro embrionário de camundongo ex vivo. Este método permite imagem de alta resolução para estudar plasticidade neural in situ.

In situ Visualização da Dinâmica do Cone de Crescimento e Crescimento do Axon em Culturas agudas de fatias de cérebro embrionário ex vivo (Vídeo) | JoVE Journal

In situ Visualização da Dinâmica do Cone de Crescimento e Crescimento do Axon em Culturas agudas de fatias de cérebro embrionário ex vivo

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