Name: Injeção de células osteossarcoma intratibiais para gerar modelos de osteossarcoma ortotópico e metástase pulmonar (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 25 s
Description: Aprenda a gerar modelos de osteossarcoma ortotópico e metástase pulmonar em camundongos por injeção intratibial de células tumorais. Este método reproduz fielmente as características clínicas do desenvolvimento tumoral para estudos terapêuticos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este estudo foi apoiado por bolsas do (1) Programa Nacional de P&D da China (2018YFC1704300 e 2020YFE0201600), (2) National Nature Science Foundation (81973877 e 82174408).

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo comitê de bem-estar animal da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Xangai. Camundongos atrímicos balb/c machos de quatro semanas de idade foram aclimatados por uma semana antes da cirurgia para injeção ortotópica de células osteossarcoma. Os camundongos foram alojados em gaiolas de camundongos ventiladas individualmente com cinco ratos por gaiola em um ciclo claro/escuro de 12 horas com acesso ad libitum à alimentação spf e água estéril.
1. Preparação de células
<ol><li>No dia da injeção de célula osteossarcoma (143B-Luciferase), lave 80%-90% de células confluentes cultivadas em um prato de cultura celular de 10 cm duas vezes com PBS (pH 7.4) e trypsinize com 1,5 mL de trippsina de 0,25% para 3 min. Em seguida, adicione 6 mL de mídia mem contendo soro de 10% para saciar a trippsina e colete as células em um tubo de centrífuga de 15 mL. NOTA: A linha celular 143B-Luciferase é obtida a partir de transfeto de linha celular 143B com vetor pLV-luciferase23.</li>
	<li>Aspire 20 μL de suspensão celular na câmara da placa de contagem celular e calcule a concentração celular usando um contador automático de células (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Centrifugar as células a 800 x g por 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspire o supernaente com uma pipeta e resuspenme a pelota celular em uma matriz de membrana de porão de 8,5 mg/mL (ver Tabela de Materiais) a uma concentração final de 2 x 107 células/mL.</li>
	<li>Mantendo as células no gelo, leve-as para a sala de cirurgia. As células devem ser usadas dentro de 2 h. NOTA: Para evitar doses imprecisas de injeção (por exemplo, devido ao espaço morto nas seringas), uma suspensão celular extra é preparada (geralmente duas vezes o volume necessário de suspensão celular). A matriz de membrana do porão é mantida no gelo o tempo todo, uma vez que tem propriedade de coagulação acima da temperaturaambiente 24.</li>
</ol>2. Cirurgia para injeção ortotópica das células osteossarcoma
NOTA: As ferramentas de cirurgia são mostradas na Figura 1.
<ol><li>Os camundongos foram criados em condições específicas sem patógenos. Todos os procedimentos foram feitos em um armário asséptico com ferramentas estéreis.</li>
	<li>Anestesiar os camundongos expondo-os a 2% de isoflurane e 98% de oxigênio (taxa de fluxo de oxigênio, 2 L/min).</li>
	<li>Aplique uma pequena quantidade de pomada oftálmica nos olhos para evitar o ressecamento enquanto estiver sob anestesia. NOTA: Realize todo o procedimento em uma área bem ventilada. Antes da injeção de células osteossarcoma, certifique-se de que cada rato esteja sob anestesia profunda por uma pitada de dedo do dedo do dedo; se o mouse ainda tiver respostas, como contração ou empurrão, espere por um longo tempo até que as respostas acima desapareçam.</li>
	<li>Mantenha cada rato em uma posição supina. Segure o tornozelo do rato usando o polegar e o dedo indicador e desinfete o local de injeção da tíbia com um cotonete de 70% de etanol. NOTA: Para segurar firmemente o tornozelo do rato, tanto as pontas do polegar quanto do dedo indicador são de grande importância para os procedimentos subsequentes.</li>
	<li>Gire a articulação do tornozelo de cada rato para fora para mover a tíbia e a fíbula, e dobre a articulação do joelho para uma posição adequada até que o planalto da tíbia proximal (a parte superior da tíbia) seja claramente visível através da pele (Figura 2A).</li>
	<li>Coloque a agulha em uma seringa de 1 mL e aponte a ponta da agulha para o local da injeção. Certifique-se de que a agulha da seringa é paralela ao longo eixo da tíbia.<ol>
<li>Insira percutâneamente a agulha através ou adjacente ao ligamento patelar à medida que passa pela cápsula da pele/articulação; th0en, gire a seringa (1/2 a 3/4-círculo) para perfurar um orifício através da plataforma tíbia em direção à extremidade distal da tíbia (cavidade medular) para injeção de célula osteossarcoma com uma seringa de micro volume (Figura 2B,C). NOTA: A rotação simultânea da tíbia pode ser sentida durante a perfuração se a ponta da agulha estiver precisa. Certifique-se de que a necessidade se move para a frente com a rotação da seringa em vez de ser diretamente empurrada para a frente até que cerca de metade da agulha esteja na tíbia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verifique se a agulha da seringa fez um movimento proeminente no canal medular para garantir a perfuração bem sucedida. NOTA: Realize um exame de raio-X (ver Tabela de Materiais) para confirmar a posição adequada da agulha e coletar as imagens.</li>
	<li>Carregue a suspensão celular osteossarcoma 143B (a partir da etapa 1.5) em uma seringa de micro volume e substitua a seringa de 1 mL na tíbia com a seringa de micro volume carregada por células 143B (Figura 2D). Injete lentamente ~10 μL (ignore a solução pré-existente na agulha) de suspensão celular de 143B na tíbia de cada rato atrímico (cerca de 2 x 105 células) sem aplicar alta pressão.</li>
	<li>Pressione o local da injeção com um cotonete para 20-30 s quando a seringa de micro volume for removida.</li>
	<li>Coloque cada rato de volta em uma gaiola limpa e monitore de perto até que o rato esteja completamente recuperado da anestesia (cerca de 10 min).</li>
	<li>Monitore o crescimento do tumor in vivo usando um sistema de imagem de raios-X. Meça o diâmetro mais longo (a) e o diâmetro curto (b) da massa cancerígeno toda semana com uma pinça para cálculo de volume de tumor (V): V = 1/2 x a x b2. NOTA: Anestesiar os camundongos expondo-os a 2% de isoflurano e 98% de oxigênio. Os camundongos foram anestesiados para imagens de raio-x. A injeção intratibia de células osteossarcoma rotuladas por proteínas intratibia ou fluorescentes permite o rastreamento de lesões osteossarcoma primárias e metastáticas. NOTA: Os pontos finais humanos dos camundongos com osteossarcoma devido ao crescimento tumoral do joelho e da metástase pulmonar basearam-se nos seguintes critérios: (1) Escore da Condição Corporal, (2) limiar de perda de peso de 20%, (3) diâmetro máximo médio dos tumores de 2 cm, ou (4) comportamento animal severamente limitado.</li>
</ol>3. Exame patológico (coleta de amostras de osteossarcoma metastático primário e pulmonar para análise)
<ol><li>Seis semanas após a injeção de células de osteossarcoma, sacrifique os camundongos por luxação cervical depois de expô-los por inalação de CO2 .</li>
	<li>Mantenha o mouse em uma posição supina e estique os dois membros traseiros.</li>
	<li>Separe as pernas inteiras com osteossarcoma da área inguinal. NOTA: Certifique-se de que todas as pernas estão separadas do mesmo local anatômico.</li>
	<li>Prepare o espécime histológico das pernas com osteossarcoma removendo a pele, músculos e pés, e, em seguida, fixe o espécime de cada rato em um tubo de 50 mL com solução de formalina de 20 mL (10%) por 24 h, seguido de decalcificação em solução 10% EDTA por 14 dias com troca de tampão ocasional.</li>
	<li>Incorpore o espécime em parafina e prepare seções para exame histológico após o trabalho publicado anteriormente25.</li>
	<li>Separe suavemente os pulmões e coloque-os em um tubo de 50 mL cheio de solução de formalina de 20 mL (10%). Após 24 horas, transfira os pulmões de cada rato para um tubo de 15 mL com 70% de etanol. Incorpore os pulmões em parafina para hematoxylin e eosin (H&E) de coloração e ensaio imunohistoquímico25.</li>
</ol>

<ol><li>Bielack, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+factors+in+high-grade+osteosarcoma+of+the+extremities+or+trunk%3A+an+analysis+of+1%2C702+patients+treated+on+neoadjuvant+cooperative+osteosarcoma+study+group+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Prognostic factors in high-grade osteosarcoma of the extremities or trunk: an analysis of 1,702 patients treated on neoadjuvant cooperative osteosarcoma study group protocols.</a> Journal of Clinical Oncology. 20 (3), 776-790 (2002).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+microenvironment+and+osteosarcoma+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Bone microenvironment and osteosarcoma metastasis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), (2020).</li>
<li>Mirabello, L., Troisi, R. J., Savage, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma+incidence+and+survival+rates+from+1973+to+2004%3A+data+from+the+Surveillance%2C+Epidemiology%2C+and+End+Results+Program%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma incidence and survival rates from 1973 to 2004: data from the Surveillance, Epidemiology, and End Results Program.</a> Cancer. 115 (7), 1531-1543 (2009).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficacy+and+safety+comparison+of+first-line+chemotherapeutic+agents+%28high-dose+methotrexate%2C+doxorubicin%2C+cisplatin%2C+and+ifosfamide%29+for+osteosarcoma%3A+a+network+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Surgery+and+Research%22%5BJournal%5D)">The efficacy and safety comparison of first-line chemotherapeutic agents (high-dose methotrexate, doxorubicin, cisplatin, and ifosfamide) for osteosarcoma: a network meta-analysis.</a> Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 15 (1), 51(2020).</li>
<li>Tsukamoto, S., Errani, C., Angelini, A., Mavrogenis, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+treatment+considerations+for+osteosarcoma+metastatic+at+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Orthopedics%22%5BJournal%5D)">Current treatment considerations for osteosarcoma metastatic at presentation.</a> Orthopedics. 43 (5), 345-358 (2020).</li>
<li>Aljubran, A. H., Griffin, A., Pintilie, M., Blackstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma+in+adolescents+and+adults%3A+survival+analysis+with+and+without+lung+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma in adolescents and adults: survival analysis with and without lung metastases.</a> Annals of Oncology. 20 (6), 1136-1141 (2009).</li>
<li>Ek, E. T., Dass, C. R., Choong, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commonly+used+mouse+models+of+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oncology%2FHematology%22%5BJournal%5D)">Commonly used mouse models of osteosarcoma.</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 60 (1), 1-8 (2006).</li>
<li>Castillo-Tandazo, W., Mutsaers, A. J., Walkley, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma+in+the+post+genome+era%3A+Preclinical+models+and+approaches+to+identify+tractable+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Osteoporosis+Reports%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma in the post genome era: Preclinical models and approaches to identify tractable therapeutic targets.</a> Current Osteoporosis Reports. 17 (5), 343-352 (2019).</li>
<li>Mason, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+immunology+and+immunotherapy+of+canine+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparative immunology and immunotherapy of canine osteosarcoma.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1258, 199-221 (2020).</li>
<li>Cobb, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+osteosarcoma+in+the+rat+as+a+model+for+osteosarcoma+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced osteosarcoma in the rat as a model for osteosarcoma in man.</a> British Journal of Cancer. 24 (2), 294-299 (1970).</li>
<li>Walkley, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+mouse+osteosarcoma%2C+dependent+on+p53+loss+and+potentiated+by+loss+of+Rb%2C+mimics+the+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Conditional mouse osteosarcoma, dependent on p53 loss and potentiated by loss of Rb, mimics the human disease.</a> Genes & Development. 22 (12), 1662-1676 (2008).</li>
<li>Entz-Werlé, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+apc%3Btwist+double-mutant+mice%3A+a+new+model+of+spontaneous+osteosarcoma+that+mimics+the+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Oncology%22%5BJournal%5D)">Targeted apc;twist double-mutant mice: a new model of spontaneous osteosarcoma that mimics the human disease.</a> Translational Oncology. 3 (6), 344-353 (2010).</li>
<li>Erstad, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+and+heterotopic+murine+models+of+pancreatic+cancer+and+their+different+responses+to+FOLFIRINOX+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy.</a> Disease Models & Mechanisms. 11 (7), (2018).</li>
<li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+for+osteosarcoma+in+the+mouse%3A+a+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs for osteosarcoma in the mouse: a meta-analysis.</a> Oncotarget. 7 (51), 85650-85674 (2016).</li>
<li>Maloney, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratibial+injection+causes+direct+pulmonary+seeding+of+osteosarcoma+cells+and+is+not+a+spontaneous+model+of+metastasis%3A+A+mouse+osteosarcoma+model%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Orthopaedics+and+Related+Research%22%5BJournal%5D)">Intratibial injection causes direct pulmonary seeding of osteosarcoma cells and is not a spontaneous model of metastasis: A mouse osteosarcoma model.</a> Clinical Orthopaedics and Related Research. 476 (7), 1514-1522 (2018).</li>
<li>Yu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+reproducible+osteosarcoma+rat+model+using+orthotopic+implantation+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">Establishment of reproducible osteosarcoma rat model using orthotopic implantation technique.</a> Oncology Reports. 21 (5), 1175-1180 (2009).</li>
<li>Fidler, I. J., Naito, S., Pathak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+implantation+is+essential+for+the+selection%2C+growth+and+metastasis+of+human+renal+cell+cancer+in+nude+mice+%5Bcorrected%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">Orthotopic implantation is essential for the selection, growth and metastasis of human renal cell cancer in nude mice [corrected].</a> Cancer Metastasis Reviews. 9 (2), 149-165 (1990).</li>
<li>Leacock, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zebrafish+transgenic+model+of+Ewing%27s+sarcoma+reveals+conserved+mediators+of+EWS-FLI1+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">A zebrafish transgenic model of Ewing's sarcoma reveals conserved mediators of EWS-FLI1 tumorigenesis.</a> Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 95-106 (2012).</li>
<li>Sharma, S., Boston, S. E., Riddle, D., Isakow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma+of+the+proximal+tibia+in+a+dog+6+years+after+tibial+tuberosity+advancement%5BTitle%5D)+AND+%22The+Canadian+Veterinary+Journal%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma of the proximal tibia in a dog 6 years after tibial tuberosity advancement.</a> The Canadian Veterinary Journal. 61 (9), 946-950 (2020).</li>
<li>Mohseny, A. B., Hogendoorn, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+for+human+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model for human osteosarcoma.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 804, 221-236 (2014).</li>
<li>Hu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cantharidin+inhibits+osteosarcoma+proliferation+and+metastasis+by+directly+targeting+miR-214-3p%2FDKK3+axis+to+inactivate+%CE%B2-catenin+nuclear+translocation+and+LEF1+translation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cantharidin inhibits osteosarcoma proliferation and metastasis by directly targeting miR-214-3p/DKK3 axis to inactivate β-catenin nuclear translocation and LEF1 translation.</a> International Journal of Biological Sciences. 17 (10), 2504-2522 (2021).</li>
<li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphyllin+I+suppresses+human+osteosarcoma+growth+by+inactivation+of+Wnt%2F%CE%B2-catenin+pathway+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Polyphyllin I suppresses human osteosarcoma growth by inactivation of Wnt/β-catenin pathway in vitro and in vivo.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7605(2017).</li>
<li>Lamar, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SRC+tyrosine+kinase+activates+the+YAP%2FTAZ+axis+and+thereby+drives+tumor+growth+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).</li>
<li>Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+from+discovery+and+ECM+mimicry+to+assays+and+models+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. , 3-18 (2014).</li>
<li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrine+inhibits+prostate+cancer+via+activation+of+the+unfolded+protein+response%2Fendoplasmic+reticulum+stress+signaling+and+reversal+of+epithelial+to+mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Matrine inhibits prostate cancer via activation of the unfolded protein response/endoplasmic reticulum stress signaling and reversal of epithelial to mesenchymal transition.</a> Molecular Medicine Reports. 18 (1), 945-957 (2018).</li>
<li>Fridman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+tumor+growth+of+both+primary+and+established+human+and+murine+tumor+cells+in+athymic+mice+after+coinjection+with+Matrigel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel.</a> Journal of the National Cancer Institute. 83 (11), 769-774 (1991).</li>
<li>Kocatürk, B., Versteeg, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+injection+of+breast+cancer+cells+into+the+mammary+fat+pad+of+mice+to+study+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), e51967(2015).</li>
<li>Paschall, A. V., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthotopic+mouse+model+of+spontaneous+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An orthotopic mouse model of spontaneous breast cancer metastasis.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), e54040(2016).</li>
<li>Hildreth, B. E., Palmer, C., Allen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+primary+bone+tumors+and+bone+metastasis+with+solid+tumor+graft+implantation+into+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Modeling primary bone tumors and bone metastasis with solid tumor graft implantation into bone.</a> Journal of Visualized Experiments. (163), e61313(2020).</li>
<li>Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+bone+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Models of bone metastasis.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e4260(2012).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A injeção ortotópica de células osteossarcoma é um modelo ideal para estudar a função e o mecanismo de fatores específicos na carcinogênese e desenvolvimento da osteossarcoma para avaliar a eficácia terapêutica. Para evitar diferenças no crescimento do tumor, a maioria das células de osteossarcoma ativas a 80%-90% confluentes com o mesmo número são cuidadosamente injetadas na tíbia de cada rato, e o tempo de experimentação celular é estritamente controlado sem afetar a viabilidade celular. Como as aglomerações celulares ...

O osteossarcoma é o câncer ósseo primário mais comum em crianças e adolescentes 1,2, que se infiltra principalmente no tecido circundante, e até mesmo metástase nos pulmões quando os pacientes são diagnosticados. A metástase pulmonar é o principal desafio para a terapia osteossarcoma, e a taxa de sobrevivência de cinco anos de pacientes com osteossarcoma com metástase pulmonar permanece tão baixa quanto 20%-30%3,4,5. No entanto, a taxa de sobrevivência de cinco anos de osteossarcoma primário foi aumentada para cerca de 70% desde a década de 1970 devido à introdução da quimioterapia6. Portanto, é urgentemente necessário entender o mecanismo fundamental da osteossarcoma carcinogênese e metástase pulmonar para desenvolver novas terapias. A aplicação de modelos de camundongos que melhor imitam a progressão do osteossarcoma em humanos é de grande significado7.
Os modelos animais osteossarcoma são gerados por engenharia genética espontânea e induzida, transplante e outras técnicas. O modelo de osteossarcoma espontâneo raramente é utilizado devido ao longo tempo de formação do tumor, taxa de ocorrência de tumor inconsistente, baixa morbidade e baixa estabilidade 8,9. Embora o modelo de osteossarcoma induzido seja mais acessível para obter do que o osteossarcoma espontâneo, a aplicação do modelo osteossarcoma induzido é limitada porque o fator indutor afetará o microambiente, a patogênese e características patológicas da osteossarcoma10. Modelos transgênicos estão ajudando a entender a patogênese dos cânceres, pois podem simular melhor os ambientes fisiológicos e patológicos humanos; no entanto, os modelos animais transgênicos também têm suas limitações devido à dificuldade, a longo prazo e alto custo de modificação transgênica. Além disso, mesmo nos modelos de animais transgênicos mais amplamente aceitos gerados pela modificação genética p53 e rb, apenas 13,6% do sarcoma ocorreu nos ossos de quatro membros11,12.
O transplante é um dos métodos de produção de câncer metastáticos primários e distantes mais utilizados nos últimos anos devido à sua manobra simples, taxa de formação de tumores estáveis e melhor homogeneidade13. O transplante inclui transplante heterotópico e transplante ortotópico de acordo com os locais de transplante. No transplante heterotópico osteossarcoma, as células osteossarcoma são injetadas fora dos sítios osteossarcoma primários (osso) dos animais, comumente sob a pele, subcutâneamente14. Embora o transplante heterotópico seja simples sem a necessidade de realizar cirurgia em animais, os locais onde as células osteossarcoma são injetadas não representam o microambiente osteossarcoma humano real. Transplante ortotópico osteossarcoma é quando as células osteossarcoma são injetadas nos ossos dos animais, como a tíbia15,16. Em comparação com os enxertos heterotópicos, os enxertos de osteossarcoma ortotópicos são caracterizados por um curto período de incubação, crescimento rápido e forte natureza erosiva; portanto, são modelos animais ideais para estudos relacionados ao osteossarcoma17.
Os animais mais usados são camundongos, cães e zebrafish18,19. O modelo espontâneo de osteossarcoma é geralmente usado em caninos porque o osteossarcoma é um dos tumores mais comuns em caninos. No entanto, a aplicação desse modelo é limitada devido ao longo tempo de formação do tumor, à baixa taxa de tumorigênese, à má homogeneidade e à estabilidade. Zebrafishes são frequentemente usados para construir modelos de tumor transgênicos ou nocaute por causa de sua reprodução rápida20. Mas os genes dos zebrafish são diferentes dos genes humanos, então suas aplicações são limitadas.
Este trabalho descreve os procedimentos detalhados, precauções e imagens representativas para a produção do osteossarcoma primário na tíbia com metástase pulmonar por injeção intratibia de células osteossarcoma em camundongos atrímicos. Este método foi aplicado para criar o osteossarcoma primário na tíbia do camundongo para avaliação da eficácia terapêutica, que apresentou alta reprodutibilidade21,22.

<table><tbody><tr><td>Contador automático de células</td><td>Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd</td><td>IC1000</td><td>Contando células</td></tr><tr><td>Máquina de anestesia</td><td>Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd</td><td>R500IP</td><td>O equipamento de camundongos</td></tr><tr><td>de anestesia BALB/c camundongos atímicos</td><td>Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd.</td><td>/</td><td>animal</td></tr><tr><td>Matriz de membrana basal</td><td>Shanghai Uning Bioscience Technology Co., Ltd</td><td>356234, BD, Matrigel</td><td>ressuspende células</td></tr><tr><td>Sistema de imagem de bioluminescência</td><td>Shanghai Baitai Technology Co., Ltd</td><td>Vieworks</td><td>rastreando o crescimento do tumor e metástase pulmonar, se a célula de injeção for marcada por luciferase</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga (15 mL)</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>&nbsp; 430790, Corning</td><td>Centrifuge as células</td></tr><tr><td>isoflurano</td><td>Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd</td><td>VETEASY</td><td>Anesthesia mice</td></tr><tr><td>MEM media</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>LM-E1141</td><td>Meio de cultura de células</td></tr><tr><td>Seringa de microvolume</td><td>Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd</td><td>0-50 &mu; L</td><td>Injete células precisas na tíbia</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>ST447</td><td>lave as células do osteossarcoma humano</td></tr><tr><td>Seringas de 1 ml</td><td>Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd</td><td>20200411</td><td>perfuração</td></tr><tr><td>da linha celular 143B</td><td>ATCC</td><td>CRL-8303</td><td>linha celular de osteossarcoma</td></tr><tr><td>Tripsina (0,25%)</td> <td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>25200056, tratamento</td><td>de tripsina Gibco de células</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>ST798</td><td>Células de coloração para avaliar o</td></tr><tr><td>vetor de atividade (pLV-luciferase)</td> <td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>VL3613</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Lipofectamine 2000</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>11668027, Thermo</td><td>fisher Plasmid transfecção reagente</td></tr><tr><td>de raios-X sistema</td><td>Brook (Beijing) Technology Co., Ltd</td><td>Imagens</td><td>de raios-X FX PRO foram obtidas para detectar o crescimento do tumor</td></tr></tbody></table>

injeção de células osteossarcoma intratibiais para gerar modelos de osteossarcoma ortotópico e metástase pulmonar

Intratibial Osteosarcoma Cell Injection to Generate Orthotopic Osteosarcoma and Lung Metastasis Mouse Models

O osteossarcoma é o câncer ósseo primário mais comum em crianças e adolescentes, sendo os pulmões o local metastático mais comum. A taxa de sobrevivência de cinco anos de pacientes com osteossarcoma com metástase pulmonar é inferior a 30%. Portanto, a utilização de modelos de camundongos imitando o desenvolvimento do osteossarcoma em humanos é de grande importância para a compreensão do mecanismo fundamental da osteossarcoma carcinogênese e metástase pulmonar para desenvolver novas terapêuticas. Aqui, procedimentos detalhados são relatados para gerar os modelos primários de osteossarcoma e metástase pulmonar através da injeção de intratibia de células osteossarcoma. Combinados com o sistema de bioluminescência ou imagem viva de raios-X, esses modelos de camundongos vivos são utilizados para monitorar e quantificar o crescimento e a metástase do osteossarcoma. Para estabelecer esse modelo, uma matriz de membrana de porão contendo células osteossarcoma foi carregada em uma seringa de micro volume e injetada em uma tíbia de cada rato atímico após ser anestesiada. Os camundongos foram sacrificados quando o osteossarcoma primário atingiu a limitação de tamanho no protocolo aprovado pela IACUC. As pernas com osteossarcoma e os pulmões com lesões de metástase foram separados. Esses modelos são caracterizados por um curto período de incubação, crescimento rápido, lesões graves e sensibilidade no monitoramento do desenvolvimento de lesões metastáticas primárias e pulmonares. Portanto, estes são modelos ideais para explorar as funções e mecanismos de fatores específicos na carcinogênese osteossarcoma e metástase pulmonar, o microambiente tumoral e avaliar a eficácia terapêutica in vivo.

Modelos pulmonares ortotópicos (primários) bem sucedidos (primários) e metastáticos dependem da injeção ortotópica precisa das células osteossarcoma. Aqui, um modelo ortotópico (primário) de osteossarcoma através da injeção de célula osteossarcoma intratibial foi desenvolvido com sucesso. A Figura 3A mostra um rolamento ortotópico representativo (primário) osteossarcoma, e a Figura 3B mostra um representante isolado ortotópico (primário) osteossarcoma. ...

O presente protocolo descreve a injeção de célula de osteossarcoma intratibia para gerar modelos de camundongos com osteossarcoma ortotópico e lesões de metástase pulmonar.

Injeção de células osteossarcoma intratibiais para gerar modelos de osteossarcoma ortotópico e metástase pulmonar

Osteosarcoma is the most common primary bone cancer in children and adolescents, with lungs as the most common metastatic site. The five-year survival ...

Este protocolo descreve a técnica para gerar modelos de camundongos com osteossarcoma primário e lesões de metástase pulmonar. Por injeção intratibiana de células osteossarcoma, este modelo imita melhor as características de desenvolvimento clínico do tumor osteossarcoma. Números precisos de células osteossarcoma são injetados diretamente na tíbia usando uma seringa de microvolume, permitindo taxas idênticas de formação de tumores e volumes tumorais.No dia da injeção de células de osteossarcoma, lave as células duas vezes com PBS. Trypsinize as células com 1,5 mililitros de 0,25% de trippsina por três minutos. Em seguida, adicione seis mililitros de mídia MEM contendo 10% de soro.Colete as células em um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Aspire 20 microliters de suspensão celular na câmara da placa de contagem celular, e calcule a concentração celular usando um contador automático de células. Centrifugar as células a 800 vezes g por cinco minutos à temperatura ambiente.Aspire o supernasce com uma pipeta, resuspenda a pelota celular em uma matriz de membrana de porão de 8,5 miligramas por mililitro, e coloque-as no gelo. Coloque o mouse na posição supina. Segure o tornozelo do rato usando o polegar e o dedo indicador, e desinfete o local de injeção da tíbia com um cotonete de 70% de etanol.Gire a articulação do tornozelo de cada rato para fora para mover a tíbia e a fíbula, e dobre a articulação do joelho para uma posição adequada até que o platô da tíbia proximal seja visível através da pele. Conecte a agulha a uma seringa de um mililitro e aponte a ponta da agulha em direção ao local da injeção, paralelamente ao eixo da tíbia. Insira percutâneamente a agulha para fazer um furo através da plataforma da tíbia em direção à extremidade distal da tíbia.Carregue a suspensão da célula osteossarcoma previamente colocada no gelo em uma seringa de microvolume, e substitua a seringa de um mililitro na tíbia com a seringa microvolume carregada por célula de osteossarcoma. Injete lentamente aproximadamente 10 microliters de suspensão celular osteossarcoma na tíbia de cada camundongo atrímico sem aplicar muita pressão. Em seguida, remova a seringa de microvolume do local da injeção e pressione o local com o cotonete por cerca de 30 segundos.Coloque o mouse de volta em uma gaiola limpa e observe sua recuperação por 10 minutos. Esta figura retrata o modelo do camundongo com osteossarcoma ortotópico desenvolvido a partir da injeção de célula osteossarcoma intratibial e sua forma isolada. Um aumento gradual no volume do tumor é observado a cada semana.As imagens de raio-X obtidas da primeira à sexta semana após a injeção de células osteossarcoma rotuladas por luciferase mostraram um aumento gradual no volume. Além disso, a imagem obtida após a injeção na tíbia do camundongo mostrou crescimento ortotópico de osteossarcoma in vivo. A metástase pulmonar causada pela injeção intratibial das células osteossarcoma foi rastreada in vivo com sucesso usando um sistema de imagem ao vivo bioluminescência.A observação sob um estereótipo revelou colônias metastáticas nos tecidos pulmonares isolados. A coloração em tecidos pulmonares embutidos na parafina mostrou lesões metastáticas. A agulha deve ser inserida percutâneamente na cápsula articular através do ligamento patelar para perfurar um buraco através da plataforma da tíbia em direção à tíbia digital girando a seringa.

intratibial-osteosarcoma-cell-injection-to-generate-orthotopic

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

O protocolo romance relatado no presente estudo permite a detecção seletiva de metástases pulmonares em resolução única célula em camundongos...

Visualização melhorada de metástases pulmonares em Resolução única célula em Ratos por Combinado<em&gt; In-situ</em&gt; Perfusão do tecido pulmonar e X-Gal coloração de<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged Células Tumorais

O vídeo demonstra a técnica de inoculação ortotópica do câncer de mama em um modelo de camundongo. Esta técnica produz uma alta taxa de tumorigênese com menos variabilidade no tamanho e forma do tumor em comparação com a injeção subcutânea ou não cirúrgica.

Injeção ortotópica: implante de células cancerígenas específicas do tecido em um camundongo adulto

O cancro é uma doença complexa que é influenciada pelo tecido circundante do tumor, bem como pro- local e anti-inflamatórias mediadores. Portanto, os modelos de injeção ortotrópicas, ao invés de modelos subcutâneos pode ser útil para estudar a progressão do câncer de uma forma que melhor mimetiza patologia humana.

Injeção Orthotopic de células cancerosas da mama na mamária Fat Pad de Ratos para o Estudo de crescimento tumoral.

Este manuscrito fornece o procedimento detalhado de injeção de artéria intra-ilíaca (IIA), uma técnica para entregar células cancerígenas especificamente aos tecidos dos membros posteriores, incluindo ossos, para estabelecer metástases ósseas experimentais. Embora inicialmente estabelecido com modelos de tumor de mama, esse protocolo pode ser facilmente estendido a outros tipos de câncer.

Injeção Artéria Intra-ilíaca para eficiente e seletiva Modelagem de microscópico metástase óssea

O objetivo deste artigo é fornecer uma descrição detalhada do protocolo para o ensaio de metástase pulmonar (PuMA). Este modelo permite aos pesquisadores estudar o crescimento de células metastáticas osteossarcoma (OS) no tecido pulmonar, usando um widefield fluorescência ou microscópio confocal de varredura a laser.

Considerações práticas em estudar a colonização de pulmão metastático em osteossarcoma usando o ensaio de metástase pulmonar

Aqui, apresentamos um protocolo para a geração de pluripotentes induzidas (iPSCs) as células-tronco do paciente fibroblastos derivada de síndrome de Li-Fraumeni (LFS), diferenciação de iPSCs através de células-tronco mesenquimais (MSCs) de osteoblastos e modelagem em vivo tumorigênese usando osteoblastos paciente-derivado do LFS.

Modelagem de osteossarcoma usando síndrome de Li-Fraumeni paciente-derivado induzido Pluripotent Stem Cells

Aqui, apresentamos um protocolo para implante de células de câncer de mama para a almofada de gordura mamária de forma simples, menos invasiva e fácil de manusear de maneira, e este modelo de câncer de mama ortotópico rato com um ambiente adequado do tecido mamário pode ser usado para investigar vários aspectos da câncer.

Ortotópico injeção de células de câncer de mama para a almofada de gordura mamária de ratos

Os modelos de metástases ósseas não desenvolvem metástases uniformemente ou com 100% de incidência. A injeção direta intraóssea de células tumorais pode resultar em embolização do pulmão. Apresentamos nossa técnica de modelagem de tumores ósseos primários e metástases ósseas usando o implante de enxerto de tumor sólido no osso, levando a enxertia e crescimento reprodutíveis.

Modelagem de Tumores Ósseos Primários e Metástases Ósseas com Implante de Enxerto Sólido de Tumor em Osso

Aqui, uma implantação ortotópica sinténica seguida de um procedimento de amputação do osteossarcoma com metástase pulmonar espontânea que pode ser usada para investigação pré-inlinética da biologia da metástase e desenvolvimento de novas terapêuticas é descrita.

Um modelo de rato de osteossarcoma ortotópico sintérico sprague dawley com amputação para controlar a taxa de metástase

O manuscrito descreve uma metodologia para o estabelecimento, bem como o monitoramento longitudinal do crescimento de metástases pulmonares espontâneas de tumores de mama injetados ortotopicamente, passíveis de intervenção em todos os estágios da cascata metastática.

In vivo Imagem para medir metástase pulmonar espontânea de células tumorais de mama injetadas ortotopicamente

O presente protocolo descreve o método para estabelecer um modelo de camundongo xenoenxerto derivado do paciente (PDX) usando tecido de osteossarcoma humano.

Estabelecimento de modelo de camundongo xenoenxerto derivado de pacientes com tecidos de osteossarcoma humano

Aprenda a gerar modelos de osteossarcoma ortotópico e metástase pulmonar em camundongos por injeção intratibial de células tumorais. Este método reproduz fielmente as características clínicas do desenvolvimento tumoral para estudos terapêuticos.

Injeção de células osteossarcoma intratibiais para gerar modelos de osteossarcoma ortotópico e metástase pulmonar

Explorar mais vídeos