Name: Imagem ao vivo do Estado De Glutathione Mitocondrial Redox em Neurônios Primários usando um Indicador Ratiométrico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Aprenda a avaliar o estado redox mitocondrial em neurônios primários usando microscopia confocal de imagem ao vivo. Este método permite monitorar alterações dinâmicas em tempo real e testar estratégias de proteção mitocondrial.

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Este trabalho foi apoiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (BA 3679/5-1; PARA 2289: BA 3679/4-2). A.K. é apoiada por uma bolsa ERASMUS+. Agradecemos a Iris Bünzli-Ehret, Rita Rosner e Andrea Schlicksupp pela preparação dos neurônios primários. Agradecemos ao Dr. Tobias Dick por fornecer pLPCX-mito-Grx1-roGFP2. Experimentos mostrados na Figura 4 foram realizados no Nikon Imaging Center, Universidade de Heidelberg. A Figura 2 foi preparada com BioRender.com.

<ol><li>Roede, J. R., Go, Y. M., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+equivalents+and+mitochondrial+bioenergetics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Redox equivalents and mitochondrial bioenergetics.</a> Methods in Molecular Biology. 810, 249-280 (2012).</li>
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<li>Kohrmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((convenient%2C+and+effective+method+to+transiently+transfect+primary+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons.</a> Journal of Neuroscience Research. 58 (6), 831-835 (1999).</li>
<li>Depp, C., Bas-Orth, C., Schroeder, L., Hellwig, A., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+activity+protects+neurons+against+calcium-mediated+oxidation+and+contraction+of+mitochondria+during+excitotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Synaptic activity protects neurons against calcium-mediated oxidation and contraction of mitochondria during excitotoxicity.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 29 (12), 1109-1124 (2018).</li>
<li>Hauck, B., Chen, L., Xiao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+chimeric+recombinant+AAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors.</a> Molecular Therapy. 7 (3), 419-425 (2003).</li>
<li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).</li>
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<li>Nietzel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox-mediated+kick-start+of+mitochondrial+energy+metabolism+drives+resource-efficient+seed+germination%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Redox-mediated kick-start of mitochondrial energy metabolism drives resource-efficient seed germination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 741-751 (2020).</li>
<li>Albrecht, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redesign+of+genetically+encoded+biosensors+for+monitoring+mitochondrial+redox+status+in+a+broad+range+of+model+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Redesign of genetically encoded biosensors for monitoring mitochondrial redox status in a broad range of model eukaryotes.</a> Journal of Biomolecular Screening. 19 (3), 379-386 (2014).</li>
<li>Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+mapping+of+hydrogen+peroxide+and+oxidized+glutathione+reveals+chemical+and+regional+specificity+of+redox+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis.</a> Cell Metabolism. 14 (6), 819-829 (2011).</li>
<li>Breckwoldt, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+optical+analysis+of+mitochondrial+redox+signals+during+neuronal+physiology+and+pathology+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo.</a> Nature Medicine. 20 (5), 555-560 (2014).</li>
<li>Ricke, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+combined+with+high+calcium+load+leads+to+impaired+antioxidant+defense+underlying+the+selective+loss+of+nigral+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction combined with high calcium load leads to impaired antioxidant defense underlying the selective loss of nigral dopaminergic neurons.</a> Journal of Neuroscience. 40 (9), 1975-1986 (2020).</li>
<li>Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insight+provided+by+glutaredoxin+within+a+fusion+to+redox-sensitive+yellow+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insight provided by glutaredoxin within a fusion to redox-sensitive yellow fluorescent protein.</a> Biochemistry. 45 (7), 2362-2371 (2006).</li>
<li>Shokhina, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+fluorescent+redox-sensitive+biosensor+Grx1-roCherry%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Red fluorescent redox-sensitive biosensor Grx1-roCherry.</a> Redox Biology. 21, 101071(2019).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm conflito de interesses.

Medições quantitativas e dinâmicas do estado mitocondrial redox fornecem informações importantes sobre fisiologia mitocondrial e celular. Várias sondas químicas fluorogênicas estão disponíveis que detectam espécies reativas de oxigênio, "estresse redox" ou "estresse oxidativo". No entanto, os últimos termos não são bem definidos e muitas vezes carecem de especificidade9,17,18. Em comparação com os corantes químicos, o Grx1-roGFP...

Várias enzimas mitocondriais importantes e moléculas de sinalização estão sujeitas à regulação de thiol redox1. Além disso, as mitocôndrias são uma grande fonte celular de espécies reativas de oxigênio e são seletivamente vulneráveis a danos oxidativos2. Assim, o potencial mitocondrial redox afeta diretamente bioenergésicos, sinalização celular, função mitocondrial e, finalmente, viabilidade celular3,4. A matriz mitocondrial contém altas quantidades (1-15 mM) da glutationa tampão de tampo de tiol-dissulfeto (GSH) para manter a homeostase redox e montar defesas antioxidantes5,6. O GSH pode ser covalentemente ligado a proteínas-alvo (S-glutathionylation) para controlar seu status e atividade redox e é usado por uma gama de enzimas desintoxificantes que reduzem proteínas oxidadas. Portanto, o potencial mitocondrial glutathione redox é um parâmetro altamente informativo ao estudar a função mitocondrial e a fisiopatologia.
roGFP2 é uma variante de GFP que foi tornada sensível ao redox pela adição de dois cisteínas expostas à superfície que formam um par de dithiol-dissulfeto artificial7,8. Tem um único pico de emissão em ~510 nm e dois picos de excitação em ~400 nm e 490 nm. É importante ressaltar que as amplitudes relativas dos dois picos de excitação dependem do estado redox do roGFP2 (Figura 1), tornando esta proteína um sensor ratiométrico. No sensor Grx1-roGFP2, a glutaredoxina humana-1 (Grx1) foi fundida ao N-terminus de roGFP29,10. O acessório covalent da enzima Grx1 ao roGFP2 proporciona duas grandes melhorias do sensor: torna a resposta do sensor específica para o par de glutationa redox GSH/GSSG (Figura 1), e acelera o equilíbrio entre GSSG e roGFP2 por um fator de pelo menos 100.0009. Portanto, o Grx1-roGFP2 permite imagens específicas e dinâmicas do potencial de glutationa celular redox.
As imagens grx1-roGFP2 podem ser realizadas em uma ampla gama de microscópios, incluindo microscópios de fluorescência de campo largo, microscópios confocal de disco giratório e microscópios confocal de varredura a laser. A expressão do sensor nos neurônios primários pode ser alcançada por vários métodos que incluem lipofecção11, coprecipitação de DNA/cálcio-fosfato12, transferência genética mediada por vírus ou uso de animais transgênicos como fonte celular (Figura 2). Vírus adeno associados a adeninantes pseudotipados (rAAV) contendo uma razão de 1:1 de proteínas capsidas AAV1 e AAV2 13,14 foram utilizados para os experimentos neste artigo. Com este vetor, a expressão do sensor máximo é tipicamente atingida de 4 a 5 dias após a infecção e permanece estável por pelo menos duas semanas. Usamos com sucesso Grx1-roGFP2 em neurônios hipocampais e corticais primários de ratos e ratos.
Neste artigo, a expressão mediada por rAAV de Grx1-roGFP2 com metas de mitocôndrias em neurônios hipocampais e corticais de ratos primários é usada para avaliar o estado de glutationa mitocondrial basal e sua perturbação aguda. Um protocolo é fornecido para imagens ao vivo confocal com instruções detalhadas sobre como (i) otimizar as configurações do microscópio confocal de varredura a laser, (ii) executar um experimento de imagem ao vivo e (iii) analisar dados com FIJI.

<table><tbody><tr><td><forte>reagentes</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio (CaCl2&middot; 2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>Diamida (DA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3648</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6908.1</td><td></td></tr><tr><td>Glicose (solução estoque 2,5 M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>neoFroxx GmbH</td><td>LC-4522.2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (solução estoque de 1 M)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio (MgCl2&middot; 6H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>442611-M</td><td></td></tr><tr><td>N-metil-D-aspartato (NMDA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3262</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>neoFroxx GmbH</td><td>LC-5932.1</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio (solução estoque 0,1 M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8574</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>Perclorato de éster etílico de tetrametilrodamina (TMRE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>87917</td><td></td></tr><tr><td>equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>câmara imagem</td><td>Life Imaging Services (Basel, Suíça)</td><td>10920</td><td>Ludin Chamber Type 3 para & Oslash; Microscópio confocal de varredura a laser de lamínulas de 12 mm</td></tr><tr><td>, microscópio</td><td>Leica</td><td>DMI6000</td><td></td></tr><tr><td>microscópio confocal de varredura a laser, unidade de varredura</td><td>Bomba</td> peristáltica Leica <td>SP8</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>PP1080 181-4001</td><td></td></tr><tr><td>microscópio confocal de disco giratório, câmera</td><td>Hamamatsu</td><td>C9100-02 EMCCD</td><td></td></tr><tr><td>microscópio confocal de disco giratório, sistema de incubação</td><td>TokaiHit</td><td>INU-ZILCF-F1</td><td></td></tr><tr><td>microscópio confocal de disco giratório, microscópio</td><td>microscópio Nikon</td><td>Ti microscópio</td><td></td></tr><tr><td>confocal de disco giratório, unidade de varredura</td><td>Yokagawa</td><td>CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td>https://fiji.sc</td><td></td></tr><tr><td>StackReg plugin</td><td></td><td></td><td></td>https://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java</tr><tr><td>https://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java</td><td></td> <td>do plugin</td><td></td> TurboReg</tr></tbody></table>

imagem ao vivo do estado de glutathione mitocondrial redox em neurônios primários usando um indicador ratiométrico

Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator

A homeostase mitocondrial redox é importante para a viabilidade e a função neuronais. Embora as mitocôndrias contenham vários sistemas redox, a glutothione tampão de tiool-dissulfeto altamente abundante é considerada um jogador central em defesas antioxidantes. Portanto, medir o potencial mitocondrial glutatione redox fornece informações úteis sobre o status de redox mitocondrial e estresse oxidativo. Glutaredoxin1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) é um indicador proporção de proporção geneticamente codificado e verde (GFP) do potencial de glutathione redox que tem dois picos de excitação sensíveis ao estado-redox a 400 nm e 490 nm com um único pico de emissão de 510 nm. Este artigo descreve como realizar microscopia ao vivo confocal de Grx1-roGFP2 com destino a mitocôndrias em neurônios hipocampais e corticais primários. Descreve como avaliar o potencial de glutationo mitocondrial de estado estável (por exemplo, comparar estados da doença ou tratamentos de longo prazo) e como medir as alterações de redox em tratamentos agudos (usando a droga excitotóxica N-metil-D-aspartate (NMDA) como exemplo). Além disso, o artigo apresenta co-imagem de Grx1-roGFP2 e o indicador potencial da membrana mitocondrial, tetrametilrhodamina, éster etílico (TMRE), para demonstrar como o Grx1-roGPF2 pode ser multiplexado com indicadores adicionais para análises multiparamétricas. Este protocolo fornece uma descrição detalhada de como (i) otimizar as configurações do microscópio de varredura a laser confocal, (ii) aplicar medicamentos para estimulação seguido de calibração de sensores com diamide e dithiothreitol, e (iii) analisar dados com ImageJ/FIJI.

Quantificação das diferenças no estado vermelho mitocondrial de estado estável após a retirada do fator de crescimento Para demonstrar a quantificação das diferenças de estado estável no estado redox mitocondrial, os neurônios primários cultivados no meio padrão foram comparados aos neurônios cultivados sem fatores de crescimento por 48 horas antes da imagem. A retirada do fator de crescimento resulta em morte celular neuronal apoptóltica após 72 h16. As células foram imagens a...

Este artigo descreve um protocolo para determinar diferenças no estado basal redox e respostas redox a perturbações agudas em neurônios hipocampais primários e corticais usando microscopia viva confocal. O protocolo pode ser aplicado a outros tipos de células e microscópios com modificações mínimas.

Imagem ao vivo do Estado De Glutathione Mitocondrial Redox em Neurônios Primários usando um Indicador Ratiométrico

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant ...

Este método permite investigar como o estado mitocondrial redox é afetado em condições fisiopatológicas. Também pode ser usado para avaliar a eficácia de estratégias de tratamento que visam proteger mitocôndrias. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite um órgão e uma avaliação específica das mudanças dinâmicas e de rastreamento no estado mitocôndria redox em tempo real.Este método pode ser combinado com indicadores adicionais para registrar simultaneamente, por exemplo, potencial de membrana mitocondrial ou concentrações de cálcio, além do estado de redox. Este protocolo pode ser aplicado a células culturais, explanações teciduais e culturas de fatias. Comece otimizando as configurações do microscópio confocal de digitalização.Para isso, ajuste o detector em 12 bits ou 16 bits, ative o modo de varredura sequencial e adicione uma segunda sequência/faixa. Para ambos os canais, selecione uma tabela de pesquisa de cores pseudo que indique pixels acima e subexpostos e, em seguida, selecione um objetivo adequado para o objeto de interesse. Monte uma mancha com células na câmara de imagem.Adicione um mililitro de tampão de imagem e coloque a câmara no microscópio. Use a ocular e a luz transmitida para concentrar as células. Grave imagens com diferentes formatos de pixels e tamanhos de pinhole.Em seguida, registos com diferentes intensidades de laser e ajuste o ganho e o limiar do detector. Finalmente, grave imagens com diferentes velocidades de varredura e diferentes números de médias de quadros. Para imagens ao vivo, defina o intervalo timelapse para 30 segundos e duração para 25 minutos.Em seguida, monte as células, coloque a câmara no microscópio e concentre as células como demonstrado anteriormente. Mude para o modo de digitalização e use o canal de 488 nanômetros na visão ao vivo para se concentrar e localizar as células para imagens. Opcionalmente, para aumentar o número de células gravadas por execução, use a função de vários pontos para visualizar de dois a três campos de exibição por deslizamento de cobertura.Inicie a aquisição do timelapse e grave cinco imagens como uma gravação de linha de base de dois minutos. Adicione 500 microliters de solução 3X NMDA à câmara para alcançar a concentração final de 30 micromolares e registrar 20 imagens adicionais como uma resposta NMDA de 10 minutos. Em seguida, adicione 500 microliters de solução 4X DA à câmara e grave mais seis imagens.Aspire o buffer da câmara de imagem e substitua-o por um mililitro de solução DTT. Depois de gravar mais 10 imagens, termine a gravação e salve a série de imagens. Para importar os dados no software de análise de imagens, clique em plugins, selecione formatos bio e, em seguida, importador de bioformitos.Na caixa de diálogo, escolha hiperstack na pilha de visualizações com, defina o modo de cor como padrão e selecione escala automática. Altere o formato da imagem para 32 bits clicando na imagem, selecionando tipo e, em seguida, a partir das opções, escolha 32 bits. Para dividir os canais de cores em janelas separadas, clique na imagem, vá para a cor e selecione canais divididos.Ajuste o limiar para selecionar as mitocôndrias para análise clicando na imagem, selecionando ajuste e limiar. Na caixa de diálogo, selecione o fundo escuro vermelho padrão e empilhe histograma. Quando os pixels selecionados aparecerem vermelhos, clique em aplicar.Em seguida, selecione definir pixels de fundo para processo NAN todas as imagens e execute o mesmo procedimento para o canal dois. Para visualizar a proporção de 405 a 488 nanômetros, crie uma imagem de proporção clicando no processo e na calculadora de imagens. Na caixa de diálogo, selecione o canal um na imagem uma divisão no canal de operação dois na imagem dois.Em seguida, selecione criar nova janela e processar todas as imagens. Altere a tabela de procuração da imagem de proporção para pseudocoloração clicando na imagem, selecionando tabelas de procuração e, em seguida, disparar. Para analisar a imagem, desenhe ROIs em torno de células individuais ou mitocôndrias na imagem de razão.Para adicionar os ROIs ao gerenciador de ROI, vá analisar, clique nas ferramentas, selecione gerenciador de ROI, clique em adicionar e selecione mostrar tudo. Para medir as proporções de 405 a 488 nanômetros de células individuais, clique no gerenciador de ROI, selecione todos os ROIs pressionando o Controle A, vá para mais e selecione multi-medidas. Na caixa de diálogo, selecione medir todas as fatias e uma linha por fatia.Depois de exportar as medições para o software de planilha, selecione a imagem de 405 nanômetros, meça as intensidades de todos os ROIs e exporte novamente as medições para o software de planilha. Da mesma forma, meça as intensidades do ROI da imagem de 488 nanômetros. Para salvar os ROIs para referência futura, selecione todos os ROIs pressionando o Controle A, vá para mais e selecione salvar.Estes instantâneos representativos de uma gravação timelapse mostram imagens de razão de neurônios antes e depois do tratamento NMDA e após a calibração max/min com DA e DTT. Tratamento dos neurônios com 30 micromolar de NMDA induzidos de oxidação mitocôndrias em poucos minutos. A análise dos canais individuais de fluorescência revelou que a acidose mitocondrial induzida pelo NMDA causou uma queda da fluorescência GFP tanto na excitação de 405 quanto 488 nanômetros.Em um experimento de controle, o tratamento com da da impediu qualquer oxidação de mitocôndrias adicional pela NMDA. E, portanto, a proporção de 405 a 488 não mudou, apesar de uma considerável saciamento da intensidade de fluorescência GFP2 sensível ao redox. Este experimento confirmou que a razão de 405 a 488 nanômetros não é afetada por alterações de pH.Em um experimento separado, o potencial da membrana mitocondrial, o estado redox e a morfologia foram avaliados em paralelo. O tratamento dos neurônios com 60 MMDA micromolar resultou na perda de tetrametilemi ou sinal TMRE e um aumento na razão de 405 a 488 nanômetros rho GFP seguido por algum arredondamento atrasado de mitocôndrias. Quando você começa a usar este método, é muito importante ter tempo para otimizar cuidadosamente as configurações microscópicas.Isso ajudará a manter os neurônios saudáveis durante seus experimentos. Também é muito importante respeitar sempre as regras de segurança a laser. Certifique-se de não ser exposto à radiação laser quando estiver adicionando drogas para adulterar durante gravações ao vivo.

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Neuroscience

Neurociência

Nós descrevemos um protocolo que permite imagens de mitocôndrias na vida neurônios através de microscopia de fluorescência durante muito tempo. Imagem por longos períodos é realizado através de lentivírus mediada expressão de uma proteína fluorescente mitochondrially alvo e uso de uma infra-top estágio incubadora que foi projetada e construída em nosso laboratório.

Neuromodulação e Transportes mitocondrial: Imagens ao vivo em neurônios do hipocampo durante muito tempo

Nós demonstramos a aplicação do indicador de fluorescência, TMRM, em neurônios corticais para determinar a alterações relativas na intensidade de fluorescência TMRM antes e após a aplicação de um estímulo específico. Mostramos também a aplicação da sonda de fluorescência...

Determinação de Membrana Mitocondrial Espécies de Oxigênio Reativas Potencial e em neurônios de rato vivo Cortical

Fonte: Katsalifis, A., et al. Imagem ao vivo do estado redox de glutationa mitocondrial em neurônios primários usando um indicador raciométrico. J. Vis. Exp. (2021)Este vídeo demonstra a imagem do estado redox mitocondrial em neurônios primários usando um indicador fluorescente raciométrico. Ao aplicar dois comprimentos de onda de excitação sob um microscópio de fluorescência, a taxa de intensidade de fluorescência é medida para avaliar a oxidação mitocondrial. O protocolo inclui estimulação de...

Imagem do estado redox mitocondrial em neurônios primários usando um indicador raciométrico

Descreve-se a utilização de dois raciométrica, biossensores codificados geneticamente, que são baseados em GFP, para monitorar estado redox mitocondrial e os níveis de ATP na resolução subcelular em células vivas.

Biossensores raciométrica que medem estado redox mitocondrial e ATP em células vivas de levedura

Microscopia confocal é aplicada para imagens individuais em eventos mitocondriais coração perfundido ou músculos esqueléticos em animal vivo. Monitoramento em tempo real de processos mitocondriais único, como superóxido flashes e membrana possíveis flutuações permite a avaliação da função mitocondrial em um contexto fisiologicamente relevante e durante perturbações patológicas.

Imagem confocal de Solteiro mitocondriais superóxido Pisca em coração intacto ou In Vivo

Transporte mitocondrial prejudicado e morfologia estão envolvidos em várias doenças neurodegenerativas. O protocolo apresentado usa neurônios cerebrais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas para avaliar o transporte mitocondrial e a morfologia em paraplegia espástica hereditária. Este protocolo permite a caracterização do tráfico mitocondrial ao longo de axônios e análise de sua morfologia, o que facilitará o estudo de doenças neurodegenerativas.

Analisando o Transporte Mitocondrial e a Morfologia em neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos em Paraplegia Espástica Hereditária

Este proctocol tem como objetivo fornecer um método para imagens in vitro e in vivo mitocondrial Ca2+ em astrócitos e neurônios.

Imagem Mitocondrial Ca2+ Absorção em Astrócitos e Neurônios usando Indicadores Ca2+ Codificados Geneticamente (GECIs)

Este artigo descreve o método de imagem mitocondrial time-lapse de culturas de astrócito equipadas com biosensor MitoTimer e a análise multiparamétrica resultante da dinâmica mitocondrial, mobilidade, morfologia, biogênese, estado redox e rotatividade.

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Esta técnica descreve um fluxo de trabalho eficaz para visualizar e medir quantitativamente o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de superóxido dentro de células HeLa usando imagens ao vivo baseadas em fluorescência.

Quantificação Baseada em Fluorescência do Potencial de Membrana Mitocondrial e Níveis de Superóxido Usando Imagem Viva em Células HeLa

Neste vídeo, demonstramos a visualização da translocação da PKC em células vivas usando PKCs fluorescente etiquetado.

Live-imagem de translocação da PKC em células Sf9 e em neurônios sensoriais Aplysia

Aprenda a avaliar o estado redox mitocondrial em neurônios primários usando microscopia confocal de imagem ao vivo. Este método permite monitorar alterações dinâmicas em tempo real e testar estratégias de proteção mitocondrial.

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