Name: Caenorhabditis elegans como um sistema modelo para descobrir compostos bioativos contra neurotoxicidade mediada por poliglutamina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Aprenda a usar Caenorhabditis elegans para avaliar compostos neuroprotetores contra agregação de poliglutamina e morte neuronal. Este método integra múltiplos fenótipos para análise quantitativa de proteção neural em modelos de doença de Huntington.

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Agradecemos aos ex-membros do Laboratório Huang que ajudaram a desenvolver e melhorar os protocolos usados neste artigo, particularmente, Hanrui Zhang, Lingyun Xiao e Yanxia Xiang. Este trabalho foi apoiado pelo Projeto 111 (número de subvenção B17018) e pela Fundação de Ciência Natural da Província de Hebei (número de subvenção H2020207002).

NOTA: Veja a Tabela 1 para as receitas de soluções utilizadas neste protocolo.
1. Preparação de materiais para o ensaio de Caenorhabditis elegans
<ol><li>Manutenção de cepas de C. elegans <ol>
<li>Obtenha cepas C. elegans (AM141 e HA759) e Escherichia coli (OP50 e NA22) (ver a Tabela de Materiais).</li>
		<li>Mantenha os nematoides na placa de crescimento do nematoide (NGM) semeada com E. coli OP50 a 20 °C para AM14121 ou 15 °C para HA75923.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação da cultura bacteriana E. coli OP50<ol>
<li>Escolha uma única colônia de E. coli OP50 de uma placa de raia Luria-Bertani (LB) e inocula-a em 50 mL de cultura lb líquida.</li>
		<li>Incubar as bactérias OP50 em um agitador a 37 °C e 200 rpm até uma densidade óptica de ~0,5 a 570 nm (OD570).</li>
		<li>Armazene a cultura bacteriana OP50 a 4 °C e use-a dentro de duas semanas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação de placas de NGM com bactérias OP50<ol>
<li>Adicione 20 g de ágar, 2,5 g de peptone, 3,0 g de NaCl e 975 mL de água deionizada a uma garrafa autoclavável de 1 L. Autoclave a 121 °C por 30 min.</li>
		<li>Coloque a garrafa de ágar NGM líquida no banco para esfriar a ~60 °C e, em seguida, adicione as seguintes soluções de estoque estéril: 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de colesterol 5 mg/mL e 25 mL de fosfato de potássio de 1 M (pH 6.0).</li>
		<li>Despeje 20 mL de NGM em uma placa de Petri estéril de 90 mm, e deixe as placas no banco para esfriar e solidificar. Mantenha as placas de cabeça para baixo e deixe-as secar no banco à temperatura ambiente por 2 dias.</li>
		<li>Dispense 200 μL da cultura bacteriana OP50 em cada placa NGM e espalhe uniformemente com uma haste de revestimento de vidro estéril. Feche as tampas e incuba as placas durante a noite a 37 °C.</li>
		<li>Armazene as placas NGM semeadas com OP50 em uma caixa de plástico com uma tampa à temperatura ambiente e use dentro de duas semanas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação da população de C. elegans sincronizada pela idade<ol>
<li>Colete nematoides adultos gravid em um tubo de microcentrifuge de 1,5 mL e centrífuga de 1000 × g por 1 min. Lave três vezes e resuspenja os nematoides no buffer M9.</li>
		<li>Adicione um volume igual de solução de alvejante e agitar suavemente por 3-5 min. Monitore o branqueamento a cada 15 s sob um microscópio dissecando. NOTA: A solução alvejante deve ser preparada recentemente antes do uso, misturando volumes iguais de NaOCl de 10% e 1 M NaOH (Tabela 1)20.</li>
		<li>Uma vez que a maioria dos nematoides são quebrados, pare a digestão diluindo com tampão M9. Centrifugar rapidamente para remover o supernasciente e resuspensar a pelota no tampão M9 para repetir a lavagem três vezes.</li>
		<li>Resuspense a pelota no meio S. Deixe os resíduos de nematoides se acalmarem pela gravidade por 2-3 minutos enquanto os ovos permanecem no sobrenante.</li>
		<li>Aspire o supernatante em um novo tubo de microcentrifuge estéril. Recolher os ovos por centrifugação a 1000 × g por 1 min.</li>
		<li>Descarte ~80% do supernaente e transfira os ovos para um frasco estéril contendo 20 mL de meio S. Coloque o frasco em um shaker e incubar os ovos durante a noite sem comida a 120 rpm para obter nematoides L1 sincronizados.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Ensaio de agregação de políq
<ol><li>Preparação de nematoides para o ensaio de agregação de polq<ol>
<li>Transfira 300-500 larvas L1 sincronizadas de AM141 para cada poço de uma placa de 48 poços com 500 μL de S médio contendo OP50 (OD570 de 0,7-0,8) e 5 mg/mL de astragalan, tipicamente um poço por tratamento para um ponto de tempo.</li>
		<li>Sele a placa com parafilm e incubar a 20 °C e 120 rpm para 24, 48, 72 e 96 h.</li>
		<li>Colher os nematoides em um tubo de microcentrifusidade de 1,5 mL e lavar com tampão M9 &gt;3 vezes por centrifugação (1000 × g por 1 min) para remover o OP50 restante. Resuspenque os nematoides AM141 no buffer M9 e mantenha-os prontos para aquisição de imagens.</li>
	</ol></li>
	<li>Aquisição de imagens fluorescentes e análise de dados NOTA: Os dados são analisados automaticamente com este sistema de imagem de alto conteúdo. Se um dispositivo de imagem automatizado não estiver disponível, um método convencional para preparar uma almofada agarose para aquisição de imagens pode ser usado para obter desempenho semelhante usando um microscópio fluorescente comum 7,15,17 (ver passos 3.2 e 3.3).<ol>
<li>Transfira 10-15 nematoides em cada poço em uma placa de 384 poços (volume final de 80 μL por poço). Coloque 10 poços de réplica para cada tratamento.</li>
		<li>Adicione 10 μL de 200 mM de azida de sódio a cada poço para paralisar os nematoides e permitir que eles se acomodem até o fundo (5-10 min).</li>
		<li>Coloque a placa em um sistema de imagem de alto teor para adquirir imagens fluorescentes (consulte a Tabela de Materiais para obter informações sobre dispositivos e software).</li>
		<li>Abra o software de aquisição de imagens e configure os seguintes parâmetros.<ol>
<li>Abra a janela de configuração de aquisição de placas e crie um novo conjunto de experimentos e nome.</li>
			<li>Selecione A ampliação como 2x, caixa de câmera como 1 e tipo placa como placa de 384 poços.</li>
			<li>Defina os poços e locais (local único) a serem visitados.</li>
			<li>Selecione o filtro isothiocianato fluoresceína (FITC) e habilite opções de foco baseadas em imagem.</li>
			<li>Defina a Exposição como 300 ms. NOTA: As configurações acima podem ser testadas e ajustadas para otimizar os parâmetros de imagem.</li>
			<li>Salve as configurações de aquisição da Imagem e clique no botão Adquirir placa para executar.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Analise os dados da imagem usando o software de análise de imagens.<ol>
<li>Abra a janela Dados da placa de revisão e selecione a placa de teste para análise de imagem.</li>
			<li>Clique duas vezes em um poço de teste para exibir sua imagem.</li>
			<li>Selecione os Núcleos de Contagem como o método de análise e clique no botão Configurar Configurações para trazer uma janela para as seguintes configurações.</li>
			<li>Defina a imagem de origem do canal FITC e selecione o Algoritmo Padrão.</li>
			<li>Defina os parâmetros de análise de imagem da seguinte forma: largura mínima aproximada = 10 μm (= 2 pixels); largura máxima aproximada = 50 μm (= 12 pixels); intensidade acima do fundo local = 1.000-2.000 níveis cinzentos.</li>
			<li>Teste as configurações atuais para otimizar o método de análise.</li>
			<li>Salve as configurações e execute a análise em todos os poços. NOTA: Leva ~20 min para terminar a análise para uma placa de 384 poços.</li>
			<li>Exporte os Núcleos Totais como o número total de agregados q40::YFP em cada poço.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Conte o número de nematoides em cada poço.</li>
		<li>Calcule o número médio de agregados Q40::YFP por nematoide em cada grupo e aplique uma curva não linear adequada aos dados de cada ponto de tempo.</li>
		<li>Calcule o índice de inibição usando eq (1) abaixo: Índice de inibição = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63081/63081eq01.jpg"> (1) Onde ncontrole en amostra são o número médio de Q40::YFP agregados no controle e nos grupos de tratamento, respectivamente.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Ensaios de neurotoxicidade mediados por PolyQ
<ol><li>Tratamento de C. elegans com amostras de teste<ol>
<li>Para preparar nematoides para o ensaio de neurotoxicidade de POLQ, transferir 300-500 larvas L1 sincronizadas de HA759 para cada poço de uma placa de 48 poços com 500 μL de S médio contendo OP50 (OD570 de 0,7-0,8) e 5 mg/mL de astragalan, tipicamente três poços de réplica para cada tratamento.</li>
		<li>Sele a placa com parafilm e incubar a 15 °C e 120 rpm durante 3 dias23.</li>
		<li>Colete os nematoides por centrifugação e lave 3-5 vezes com tampão M9. Resuspenque os nematoides no tampão M9 para uso em ensaios de sobrevivência neuronal e evasão.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação de almofada de agarose<ol>
<li>Adicione 2 g de agarose a 100 mL de tampão M9 (2%, w/v) e aqueça a solução de agarose em um micro-ondas para quase ferver.</li>
		<li>Dispense 0,5 mL de agarose derretida no centro de um deslizamento de vidro microscópico de 1 mm de espessura colocado entre dois pedaços de placas de vidro de 2 mm de espessura. Cubra com outro slide verticalmente. Uma vez que a agarose esfrie e se solidificar, remova suavemente o slide superior.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ensaio de sobrevivência neuronal ASH<ol>
<li>Adicione uma gota de 20 mM de azida de sódio na almofada de agarose. Transfira 15-20 nematoides HA759 para a queda para imobilizá-los.</li>
		<li>Coloque uma mancha de cobertura suavemente sobre os nematoides. Mantenha o slide sob um microscópio de fluorescência equipado com uma câmera digital. Selecione uma lente objetiva de 40x e filtro FITC para detectar neurônios ASH positivos de GFP na região principal dos nematoides.</li>
		<li>Selecione mais de 50 nematoides em cada grupo aleatoriamente para contar o número de nematoides com neurônios ASH bilaterais rotulados por GFP em sua regiãode cabeça 7. Calcule a taxa de sobrevivência dos neurônios ASH usando eq (2) abaixo. Sobrevida neuronal (%) = <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63081/63081eq02.jpg"> (2) Onde nsobrevivência e Ntotal são o número de nematoides com neurônios ASH GFP positivos e o número total de nematoides testados em cada grupo, respectivamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ensaio de evasão osmótica<ol>
<li>Divida uma placa NGM livre de alimentos (9 cm) em zonas normais (N) e trap (T) por uma linha de 8 M glicerol (~30 μL) no meio. Espalhe uma linha de azida de sódio de 200 mM (~20 μL) a ~1 cm de distância da linha glicerol para paralisar os nematoides que atravessam a barreira do glicerol até a Zona T.</li>
		<li>Transfira ~200 nematoides cada um para a Zona N de três placas de réplica para cada grupo. Adicione uma gota de 1% de butanedione (~2 μL) na Zona T (1 cm da borda da placa) para atrair os nematoides. Cubra a tampa da placa de Petri imediatamente e incubar a 23 °C por 90 min.</li>
		<li>Marque o número de nematoides nas zonas N e T sob um microscópio. Calcule o índice de evasão utilizando eq (3)20. Índice de evasão = <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63081/63081eq03.jpg"> (3) Onde N e T são o número de nematoides nas zonas N e T, respectivamente. Os dados são apresentados como meios ± desvio padrão (SD) de três réplicas, representativas de experimentos independentes &gt;3.</li>
		<li>Realize um teste t não não verificado de duas caudas para comparar os dados dos grupos astragalanos e de controle.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Criando um gráfico de radar
<ol><li>Abra o software de grafagem e importe dados de diferentes ensaios em uma nova folha. Insira a coluna A(X) como os títulos dos eixos radiais, a coluna A(Y) como os dados do grupo controle e a coluna B(Y) como os dados do grupo de tratamento.</li>
	<li>Selecione os dados necessários e clique em Plot | Especializado: Botão radar no menu da barra de ferramentas para gerar um gráfico de radar.</li>
	<li>Clique duas vezes no eixo radial e ajuste as etiquetas Escala, Tick e Tick de cada eixo conforme necessário.</li>
	<li>Clique em Arquivar no menu e selecione Gráficos de Exportação para salvar a imagem como *.tiff. NOTA: Os sites de software na Tabela de Materiais fornecem documentos de ajuda detalhados e tutoriais de vídeo na criação de gráficos de radar.</li>
</ol>

<ol><li>The Huntington's Disease Collaborative Research Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+gene+containing+a+trinucleotide+repeat+that+is+expanded+and+unstable+on+Huntington%27s+disease+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes.</a> Cell. 72 (6), 971-983 (1993).</li>
<li>Bauer, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+chaperone-mediated+autophagy+for+the+selective+degradation+of+mutant+huntingtin+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Harnessing chaperone-mediated autophagy for the selective degradation of mutant huntingtin protein.</a> Nature Biotechnology. 28 (3), 256-263 (2010).</li>
<li>Lieberman, A. P., Shakkottai, V. G., Albin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyglutamine+repeats+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Polyglutamine repeats in neurodegenerative diseases.</a> Annual Review of Pathology. 14, 1-27 (2019).</li>
<li>Sakahira, H., Breuer, P., Hayer-Hartl, M. K., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+chaperones+as+modulators+of+polyglutamine+protein+aggregation+and+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Molecular chaperones as modulators of polyglutamine protein aggregation and toxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, Suppl 4 16412-16418 (2002).</li>
<li>Bäuerlein, F., Fernández-Busnadiego, R., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+structure+of+neurotoxic+protein+aggregates+inside+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Investigating the structure of neurotoxic protein aggregates inside cells.</a> Trends in Cell Biology. 30 (12), 951-966 (2020).</li>
<li>Tu, Z., Yang, W., Yan, S., Guo, X., Li, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9%3A+a+powerful+genetic+engineering+tool+for+establishing+large+animal+models+of+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9: a powerful genetic engineering tool for establishing large animal models of neurodegenerative diseases.</a> Molecular Neurodegeneration. 10, 35(2015).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+polyglutamine-mediated+proteotoxicity+by+Astragalus+membranaceus+polysaccharide+through+the+DAF-16%2FFOXO+transcription+factor+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Inhibition of polyglutamine-mediated proteotoxicity by Astragalus membranaceus polysaccharide through the DAF-16/FOXO transcription factor in Caenorhabditis elegans.</a> Biochemical Journal. 441 (1), 417-424 (2012).</li>
<li>Koyuncu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+ligase+UBR5+suppresses+proteostasis+collapse+in+pluripotent+stem+cells+from+Huntington%27s+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin ligase UBR5 suppresses proteostasis collapse in pluripotent stem cells from Huntington's disease patients.</a> Nature Communications. 9 (1), 2886(2018).</li>
<li>Dimitriadi, M., Hart, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+disorders%3A+insights+from+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative disorders: insights from the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Neurobiology of Disease. 40 (1), 4-11 (2010).</li>
<li>Li, J., Le, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+neurodegenerative+diseases+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Modeling neurodegenerative diseases in Caenorhabditis elegans.</a> Experimental Neurology. 250, 94-103 (2013).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+in+Chinese+medicinal+studies%3A+making+the+case+for+aging+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Rejuvenation+Research%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans in Chinese medicinal studies: making the case for aging and neurodegeneration.</a> Rejuvenation Research. 17 (2), 205-208 (2014).</li>
<li>Hassan, W. M., Dostal, V., Huemann, B. N., Yerg, J. E., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+A%CE%B2-specific+pathogenic+mechanisms+using+a+nematode+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Identifying Aβ-specific pathogenic mechanisms using a nematode model of Alzheimer's disease.</a> Neurobiology of Aging. 36 (2), 857-866 (2015).</li>
<li>Faber, P. W., Alter, J. R., MacDonald, M. E., Hart, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyglutamine-mediated+dysfunction+and+apoptotic+death+of+a+Caenorhabditis+elegans+sensory+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Polyglutamine-mediated dysfunction and apoptotic death of a Caenorhabditis elegans sensory neuron.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (1), 179-184 (1999).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidant+and+neuroprotective+effects+of+Dictyophora+indusiata+polysaccharide+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ethnopharmacology%22%5BJournal%5D)">Antioxidant and neuroprotective effects of Dictyophora indusiata polysaccharide in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Ethnopharmacology. 192, 413-422 (2016).</li>
<li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epimedium+polysaccharide+alleviates+polyglutamine-induced+neurotoxicity+in+Caenorhabditis+elegans+by+reducing+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Rejuvenation+Research%22%5BJournal%5D)">Epimedium polysaccharide alleviates polyglutamine-induced neurotoxicity in Caenorhabditis elegans by reducing oxidative stress.</a> Rejuvenation Research. 20 (1), 32-41 (2017).</li>
<li>Zhong, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physicochemical+and+geroprotective+comparison+of+Nostoc+sphaeroides+polysaccharides+across+colony+growth+stages+and+with+derived+oligosaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Phycology%22%5BJournal%5D)">Physicochemical and geroprotective comparison of Nostoc sphaeroides polysaccharides across colony growth stages and with derived oligosaccharides.</a> Journal of Applied Phycology. 33 (2), 939-952 (2021).</li>
<li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salidroside+protects+Caenorhabditis+elegans+neurons+from+polyglutamine-mediated+toxicity+by+reducing+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Salidroside protects Caenorhabditis elegans neurons from polyglutamine-mediated toxicity by reducing oxidative stress.</a> Molecules. 19 (6), 7757-7769 (2014).</li>
<li>Cordeiro, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rutin+protects+Huntington%27s+disease+through+the+insulin%2FIGF1+%28IIS%29+signaling+pathway+and+autophagy+activity%3A+Study+in+Caenorhabditis+elegans+model%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Rutin protects Huntington's disease through the insulin/IGF1 (IIS) signaling pathway and autophagy activity: Study in Caenorhabditis elegans model.</a> Food and Chemical Toxicology. 141, 111323(2020).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuroprotective+and+lifespan-extension+activities+of+Damnacanthus+officinarum+extracts+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ethnopharmacology%22%5BJournal%5D)">The neuroprotective and lifespan-extension activities of Damnacanthus officinarum extracts in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Ethnopharmacology. 141 (1), 41-47 (2012).</li>
<li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+traditional+formula+Kai-Xin-San+alleviates+polyglutamine-mediated+neurotoxicity+by+modulating+proteostasis+network+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Rejuvenation+Research%22%5BJournal%5D)">The traditional formula Kai-Xin-San alleviates polyglutamine-mediated neurotoxicity by modulating proteostasis network in Caenorhabditis elegans.</a> Rejuvenation Research. 23 (3), 207-216 (2020).</li>
<li>Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+threshold+for+polyglutamine-expansion+protein+aggregation+and+cellular+toxicity+is+dynamic+and+influenced+by+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).</li>
<li>Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+disruption+of+cellular+protein+folding+in+models+of+polyglutamine+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases.</a> Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).</li>
<li>Voisine, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+potential+therapeutic+drugs+for+huntington%27s+disease+using+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of potential therapeutic drugs for huntington's disease using Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 2 (6), 504(2007).</li>
<li>Faber, P. W., Voisine, C., King, D. C., Bates, E. A., Hart, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine%2Fproline-rich+PQE-1+proteins+protect+Caenorhabditis+elegans+neurons+from+huntingtin+polyglutamine+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Glutamine/proline-rich PQE-1 proteins protect Caenorhabditis elegans neurons from huntingtin polyglutamine neurotoxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 17131-17136 (2002).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Como a agregação de polq e a proteotoxicidade são características importantes dos distúrbios do polq, como a doençade Huntington 13, recomendamos o uso de múltiplos modelos e métodos para avaliar de forma abrangente a capacidade neuroprotetora dos compostos de teste, incluindo o ensaio de agregação de poliq na cepa AM141, o ensaio de sobrevivência neuronal ASH na cepa HA759 e o ensaio de prevenção de quimioensory na cepa HA759. Os protocolos aqui apresentados têm sido utilizados para avaliar as capacidades neuroprotetivas das amostras de teste contra a toxicidade do POLIQ, incluindo efeitos inibitórios tanto na agregação de poliq quanto na neurotoxicidade associada 7,14,15,16,17,19,20, demonstrando seu potencial na descoberta de medicamentos para HD e outras doenças de poliq.
Um sistema automatizado de imagem e análise é introduzido para a detecção e contagem de agregados de polq no ensaio de agregação de polq. Este método tem as vantagens de ser de alta produtividade e eficiência temporal e resulta em erros subjetivos significativamente reduzidos no processo de contagem trabalhoso. Para uma placa inteira de 384 poços, leva apenas <1h para terminar a aquisição e análise da imagem. No entanto, o método convencional de imagem microscópica também mostrou desempenho semelhante neste laboratório sem usar o dispositivo de imagem automatizado7. 
Um total de 100-150 nematoides por tratamento são recomendados em um ensaio típico de agregação de Q40::YFP para cada ponto de tempo, que pode ser realizado em poços de replicação contendo 10-15 nematoides cada. No entanto, deve-se notar que as larvas L1 podem ser mais sensíveis a alguns tratamentos ou concentrações mais altas. Portanto, doses mais altas de compostos de teste podem inibir seu crescimento, levando a resultados falso-positivos devido ao crescimento lento e, assim, à agregação de poliqu atrasada. Normalmente, um ensaio de liberação de alimentos pode ser realizado para resolver essa preocupação e garantir a faixa de concentração adequada dos compostos de teste23. 
Os nematoides transgênicos HA759 usados na neurotoxicidade de poliQ ensaios coexpress OSM-10::GFP e Htn-Q150, possibilitando identificar inequivocamente neurônios sensoriais ASH. Assim, a sobrevivência do neurônio ASH é avaliada pela presença ou ausência de expressão GFP; geralmente, ~40-75% dos neurônios ASH nos nematoides de controle estão mortos23,24. Curiosamente, o fundo mutante genético pqe-1 (policolamina-1) na cepa HA759 (pqe-1; Htn-Q150) acelera a toxicidade mediada pelo polq, levando à morte da maioria dos neurônios ASH dentro de três dias, mesmo a 15 °C, e portanto esta cepa é cultivada a 15 °C para o ensaio de sobrevivência neuronal, como relatado anteriormente23,24.
A perda funcional de neurônios ASH em nematoides HA759 pode ocorrer antes da detecção de morte celular e agregados proteicos13; portanto, o ensaio de comportamento de evasão osmótica é essencial para a avaliação da toxicidade mediada pelo POLQ. Para minimizar o impacto potencial de nematoides HA759 menos ativos a baixa temperatura em experimentos comportamentais, as placas de ensaio de evasão são incubadas em uma incubadora umidificada de 23 °C em vez de a 15 °C como no ensaio de sobrevivência neuronal usando esta cepa. Além disso, foi relatado que os nematoides transgênicos Htn-Q150/OSM-10::GFP são altamente sensíveis ao toque do nariz; portanto, uma detecção alternativa da função do neurônio ASH é o ensaio de toque do nariz13.

A neurodegeneração progressiva em HD envolve a caça mutante patogênica com um trecho anormal de poliqu codificado por trinucleotídeo CAG repete 1,2,3. Proteínas de huntingtin mutantes com mais de 37 repetições de glutamina são propensas a agregar e acumular no cérebro de pacientes com HD e modelos animais 4,5, o que acaba levando à neurodegeneração6. Apesar da falta de clareza sobre os papéis dos agregados de poliq na patologia da doença5, a inibição da agregação de polq e sua toxicidade associada é uma estratégia terapêutica útil para o HD e outras doenças do QI 4,7,8.
Devido à conservação em vias de sinalização neuronal e modelos de doenças transgênicas fáceis de construir, o Caenorhabditis elegans tem sido amplamente utilizado como um grande organismo modelo para a investigação de distúrbios neurológicos 9,10,11,12. Por exemplo, modelos transgênicos de C. elegans expressando expansões de polq propensas à agregação podem imitar objetivamente características semelhantes a HD, como perda celular neuronal seletiva, formação de agregado citoplasmica e defeitos comportamentais13. A investigação dos efeitos potenciais das amostras de teste para reverter esses fenótipos em modelos de nematode poliQ estabelecidos levou à identificação de uma variedade de candidatos terapêuticos promissores, por exemplo, polissacarídeos 7,14,15, oligossacarídeos16, moléculas pequenas naturais17,18, e extratos de ervas e fórmulas 19,20.
Descritos aqui estão dois modelos principais de polq C. elegans e protocolos relevantes para possíveis aplicações como exemplificado pelo estudo sobre astragalan, um polissacarídeo isolado da Astragalus membranaceus7. Para o ensaio de agregação de polq em C. elegans, o modelo utilizado é a cepa transgênica AM141, que mostra puncta fluorescente dispersa em seu músculo da parede corporal ao atingir a idade adulta devido à expressão da proteína de fusão Q40::YFP, um trato de polq de 40 resíduos (polyQ40) fundido à proteína fluorescente amarela (YFP)21,22 . A cepa HA759 foi usada para examinar o comportamento de sobrevivência neuronal e quimioavoidance, pois expressa tanto proteína fluorescente verde (GFP) quanto Htn-Q150 (um trato polq derivado de caça humana de 150 resíduos) fortemente em neurônios ASH, mas fracamente em outros neurônios, resultando em neurodegeneração progressiva e morte celular ash 7,13. Um resumo abrangente do potencial neuroprotetor dos candidatos terapêuticos é fornecido pela integração de resultados de diferentes ensaios.

<table><tbody><tr><td>C. elegans cepas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AM141 rmIs133 [unc-54p::Q40::YFP]</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>https://cgc.umn.edu/strain/AM141</td></tr><tr><td>HA759 rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)]</td><td>Caenorhabditis Centro de Genética (CGC)</td><td></td><td>https://cgc.umn.edu/strain/HA759</td></tr><tr><td>E. coli cepas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NA22</td><td>Caenorhabditis Centro de Genética (CGC)</td><td></td><td>https://cgc.umn.edu/strain/NA22</td></tr><tr><td>OP50</td><td>Caenorhabditis Centro de Genética (CGC)</td><td></td><td>https://cgc.umn.edu/strain/OP50</td></tr><tr><td>Reagent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Shanghai EKEAR Bio-Technology Co., Ltd.</td><td>EQ1001-500G</td><td>https://www.ekear.com</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biowest</td><td>111860</td><td></td></tr><tr><td>Butanediona</td><td>Sinopharm Reagente Químico Co., Ltd.</td><td>80042427</td><td>https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/d027c00e64c9404d9aa41391fbb59 5d0</td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td>https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/product/sigma/c8667?context=product</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Aladdin Co., Ltd.</td><td>G116203</td><td>https://www.aladdin-e.com/zh_cn/g116203.html</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Guangdong HuanKai Microbial Science and Technology Co., Ltd.</td><td>050170B</td><td>https://www.huankai.com/show/21074.html</td></tr><tr><td>Reagente químico Co. de Sinopharm</td> da<td>azida do sódio</td>, Ltd.<td>80115560</td><td>https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551e96ff5f07cd</td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td>10019718</td><td>https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/450dfdb1132a4d8a817 d3d8c68ec25e6</td></tr><tr><td>Solução de hipoclorito de sódio</td><td>Fábrica de reagentes químicos de Guangzhou</td><td>7681-52-9</td><td>http://www.chemicalreagent.com/product/DetailProduct.aspx?id=125</td></tr><tr><td>Oxóide de triptona</td><td>Ltd.</td><td>LP0042B</td><td>https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0042B#/LP0042B</td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Oxoid Ltd.</td><td>LP0021B</td><td>https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0021B#/LP0021B</td></tr> <tr><td>< forte> equipamento< / forte></td> placa de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cultura de células de 384 poços</td><td>Nest Biotechnology Co., Ltd.</td><td>761001</td><td>https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85</td></tr><tr><td>placa de cultura de células de 48 poços</td><td>Nest Biotechnology Co., Ltd.</td><td>748001</td><td>https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85</td></tr><tr><td>placa de Petri de 90 mm</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>F611003</td><td>https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F611003</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Panasonic</td><td>MLS-3781L-PC</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>ChongQing Optical Co., Ltd.</td><td>ZSA0745</td><td>microscópio de</td></tr><tr><td>fluorescência</td> http://www.coicuop.com/plus/view.php?aid=64 <td>Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd.</td><td>Mshot MF31-LED</td><td>https://www.mshot.com/article/442.html</td></tr><tr><td>Sistema de imagem de alto conteúdo</td><td>Molecular Devices</td><td>ImageXpress</td><td>https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems#High-Content-Imaging</td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>GeneCompany</td><td>GENESPEED X1</td><td></td></tr><tr><td>https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html Microscópio câmera digital</td><td>Fornecedor verificado - Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd.</td><td>MS60</td><td>https://www.mshot.com/article/677.html</td></tr><tr><td>Microondas</td><td>Midea Corp.</td><td>&nbsp; M1-211A</td><td>https://www.midea.cn/10000/10000000001 00511264425.html</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td>https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Zhicheng Inc.</td><td>ZWY-2102C</td><td>http://www.zhicheng.net/Product/0865291356.html</td></tr><tr><td>SoftwareSoftware de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>aquisição e análise de imagens</td><td>Molecular Devices</td><td>MetaXpress</td><td>https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metaxpress</td></tr><tr><td>OriginPro</td><td>OriginLab Corp.</td><td>Versão 9.8.5.204</td><td>1. Introdução ao software: https://www.originlab.com/index.aspx?go=Products/Origin 2. Instruções para criação de um gráfico de radar: https://www.originlab.com/doc/Origin-Help/RadarChart-Graph 3. Tutorial em vídeo para criar um gráfico de radar: https://www.originlab.com/videos/details.aspx?pid=1813</td></tr></tbody></table>

caenorhabditis elegans como um sistema modelo para descobrir compostos bioativos contra neurotoxicidade mediada por poliglutamina

Caenorhabditis elegans as a Model System for Discovering Bioactive Compounds Against Polyglutamine-Mediated Neurotoxicity

Os erros relacionados à idade e a agregação de proteínas patogênicas são responsáveis por várias doenças neurodegenerativas. Por exemplo, a doença de Huntington (HD) é impulsionada principalmente por uma repetição de nucleotídeos CAG que codifica um tratado expandido de glutamina na proteína huntingtin. Assim, a inibição da agregação de poliglutamina (polyQ) e, em particular, neurotoxicidade associada à agregação é uma estratégia útil para a prevenção do HD e outras condições associadas ao POLYQ. Este artigo introduz protocolos experimentais generalizados para avaliar a capacidade neuroprotetora dos compostos de teste contra o HD usando modelos de caenorhabditis transgênicas estabelecidas . A cepa AM141 é escolhida para o ensaio de agregação de polq como um fenótipo associado à idade de agregados fluorescentes discretos pode ser facilmente observado em sua parede corporal no estágio adulto devido à expressão muscular específica de proteínas de fusão de polq::YFP. Em contraste, o modelo HA759 com forte expressão de tratos expandidos de poliq em neurônios ASH é usado para examinar a morte neuronal e o comportamento de quimioavoidance. Para avaliar de forma abrangente a capacidade neuroprotetora dos compostos-alvo, os resultados acima dos testes são apresentados como um gráfico de radar com perfil de vários fenótipos de forma de comparação direta e visualização direta.

A cepa de poliq transgênico AM141 expressa fortemente proteínas de fusão Q40::YFP em suas células musculares da parede corporal 7,21. Como mostrado na Figura 1A, o discreto fenótipo agregado desta cepa pode ser identificado pelo protocolo automatizado de imagem e análise descrito neste artigo. A quantidade de agregados Q40::YFP em nematoides AM141 aumentou significativamente após 48 h da etapa L1. No entanto, essa tendência ao aumento foi inibida pelo tratamento astragalano (Figura 1B), demonstrando o potencial protetor do astragalano contra a agregação de polq. Normalmente, 72 h ou 96 h podem ser convenientemente usados como pontos de tempo para contar os agregados do Q40::YFP para avaliar o efeito anti-agregação de amostras de teste. Neste protocolo, os agregados fluorescentes do nematode AM141 foram capturados por um sistema automatizado de imagem, embora microscópios de fluorescência também possam ser usados para este fim7.
A cepa C. elegans HA759 expressa tanto o marcador GFP quanto o Htn-Q150 em seus neurônios ASH sensoriais, levando à perda progressiva e disfunção desses neurônios11,13. Os nematoides foram montados em 2% de almofadas agarose para determinar a viabilidade neuronal ASH (Figura 2A) e visualizados microscopicamente para detectar os neurônios ASH. A perda da fluorescência GFP em neurônios ash bilaterais nas regiões da cabeça dos nematoides indica a morte neuronal ash (Figura 2B). A taxa de sobrevivência dos neurônios ASH em nematoides HA759 é de &lt;40% no grupo controle após a incubação a 15 °C durante 3 dias 7,20, indicando neurotoxicidade mediada por polq. Assim, este ensaio de sobrevivência neuronal ASH pode ser usado para avaliar visualmente os efeitos de compostos de teste em neurônios C. elegans, por exemplo, o efeito neuroprotetor do astragalano, mas não poria glycan (Figura 2C).
Como a disfunção comportamental é um dos principais sintomas clínicos em doenças de polq, o ensaio de prevenção de quimioensory (Figura 3A) utilizando um grande número de nematoides HA759 é projetado como um teste simplificado para examinar o efeito de amostras de teste sobre a perda funcional de neurônios ASH mediados pela agregação de polq. Como mostrado na Figura 3B, o índice de evasão de nematoides HA759 no grupo de controle não tratado foi de ~0,5, semelhante ao que foi relatado anteriormente14. Curiosamente, o índice de evasão aumentou para &gt;0,6 nos nematoides tratados com astragalano a 15 °C durante 3 dias (Figura 3B), demonstrando um efeito neuroprotetor do polissacarídeo contra prejuízos comportamentais.
Para avaliar a capacidade neuroprotetora geral dos compostos de teste, os dados dos ensaios individuais acima podem ser integrados e apresentados como um gráfico de radar para vários fenótipos, tornando-se uma característica unificadora de fenótipos de poliq adequados para comparação direta e visualização direta. Como mostrado na Figura 4, a área do triângulo no grupo de tratamento astragalano é maior do que a do grupo controle, indicando os efeitos anti-polícqes do polissacarídeo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63081/63081fig01.jpg"> Figura 1: Efeito de astragalano na agregação de polq40. (A) Imagens representativas de nematoides AM141 após o tratamento com ou sem astragalan por 96 h a 20 °C. As imagens fluorescentes (painéis esquerdos) foram adquiridas a partir de placas de 384 poços usando um sistema de imagem e análise de alto teor de conteúdo, e os agregados Q40::YFP (painéis direito) foram automaticamente identificados pelo sistema. Insets são as visões ampliadas das imagens de nematoide mostrando os agregados de polq. Barras de escala = 500 μm. (B) Quantificação de agregados Q40::YFP. O número de agregados Q40::YFP em nematoides AM141 foi monitorado utilizando o sistema de imagem de alto conteúdo a cada 24 h durante 4 dias após o tratamento com ou sem astragalan a 20 °C. Aproximadamente 100-150 nematoides em cada grupo foram marcados para agregados em cada ponto de tempo. Os resultados são mostrados como curvas equipadas com base no número médio de agregados por nematoide. Abreviaturas: polyQ = poliglutamina; YFP = proteína fluorescente amarela; FITC = isocitonato de fluoresceína. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63081/63081fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63081/63081fig02.jpg"> Figura 2: Efeito de astragalan em Htn-Q150-mediado ash morte neuronal. (A) diagrama esquemático da preparação do slide de agarose. (B) Micrografos representativos de nematoides HA759 com sobrevivência neuronal ash e morte usando ampliação de 400x. Barras de escala = 20 μm. Os nematoides HA759 foram fotografados usando um microscópio de fluorescência após o tratamento com ou sem astragalano a 15 °C por 3 dias a partir de L1. (C) Efeito protetor do astragalano contra a morte neuronal ash mediada por polq. Poria glycan, um polissacarídeo de Poria cocos, foi usado como controle. Os dados são apresentados como meios ± SD de três réplicas, representante de mais de três experimentos independentes. A análise estatística foi realizada utilizando-se um teste t não realizado de duas caudas para comparar dados do grupo controle com os dos grupos glicanos astragalanos e poriais . *p &lt; 0,05; ns = não significativo. Abreviação: GFP = proteína fluorescente verde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63081/63081fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63081/63081fig03.jpg"> Figura 3: Efeito de astragalan em disfunção comportamental mediada por Htn-Q150. (A) Diagrama esquemático da placa de ensaio de evasão. (B) Resultados representativos do ensaio de evasão. O índice de evasão foi definido como a razão de nematoides na zona N para o número total de nematoides na placa. Os resultados são apresentados como meios ± SD de três réplicas, representante de três experimentos independentes. A análise estatística do índice de evasão foi realizada utilizando-se um teste t não não realizado de duas caudas. **p &lt; 0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63081/63081fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63081/63081fig04.jpg"> Figura 4: Capacidade neuroprotetora global de astragalano. Dados de três ensaios diferentes são importados para o software OriginPro para um gráfico de radar de criação, que é apresentado para traçar o perfil do efeito geral do astragalan em vários fenótipos mediados pelo polyQ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63081/63081fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Mesa 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63081/Table%201%20Solution%20Recipes%20(1).xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta Tabela.</a>

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar as atividades neuroprotetoras de compostos de teste em Caenorhabditis elegans, incluindo agregação de poliglutamina, morte neuronal e comportamento de quimioavoidance, bem como uma integração exemplar de fenômenos múltiplos.

Caenorhabditis elegans como um sistema modelo para descobrir compostos bioativos contra neurotoxicidade mediada por poliglutamina

Age-related misfolding and aggregation of pathogenic proteins are responsible for several neurodegenerative diseases. For example, Huntington&#39;s ...

Como um poderoso modelo animal em estudos neurodegenerativos e comportamentais, os C.elegans podem ser usados para rastrear e avaliar eficientemente compostos tóxicos contra a neurotoxicidade da poliglutamina usando modelos semelhantes à doença de Huntington. A principal vantagem dessa técnica é o perfil e a integração de vários fenótipos em diferentes modelos de C.elegans. Também na verdade, como modelos C.elegans são usados neste método.Ele fornece tamanho para a triagem e a investigação de candidatos terapêuticos para outros atrasos neurodegenerativos e, de fato, outros atrasos. Preste atenção às temperaturas utilizadas no crescimento de C.elegans e realize o teste nos estágios certos do desenvolvimento namínico. Demonstrando o procedimento estarão Jiang Yiyi, Xioa Yue e Wang Qiangqiang, três estudantes de pós-graduação.Comece transferindo 300 a 500 larvas L1 sincronizadas de nematoides AM141 para cada poço de uma placa de 48 poços com 500 microliters de S médio contendo cepa OP50 de E.coli e cinco miligramas por mililitro de astragalano. Sele a placa com parafilm e incubar a 20 graus Celsius e 120 rotações por minuto para intervalos de tempo desejados. Transfira os nematoides em um tubo de microcentrífugo de 1,5 mililitro e lave com tampão M9 três vezes por centrifugação para remover as células OP50 restantes.Em seguida, resuspenque os nematoides AM141 no buffer M9. Agora, transfira de 10 a 15 nematoides em cada poço em uma placa de 384 poços, estabelecendo 10 poços de réplica para cada tratamento e adicione 10 microliters de 200 milimoslar de azida de sódio a cada poço para paralisar os nematoides, permitindo que eles se acomodem até o fundo. Coloque a placa em um sistema de imagem de alto teor para adquirir imagens fluorescentes.Abra o software de aquisição de imagens e configure os parâmetros mencionados no manuscrito do texto. Analise os dados da imagem abrindo a janela de dados da placa de revisão e selecionando a placa de teste para análise de imagens. Clique duas vezes em um teste bem para exibir sua imagem.Em seguida, selecione os núcleos de contagem como o método de análise e clique no botão configurar configurações. Defina a imagem de origem do canal FITC e selecione o algoritmo padrão. Defina os parâmetros de análise de imagem conforme descrito no manuscrito do texto e teste-os para otimizar o método de análise.Salve as configurações e execute a análise em todos os poços. Exporte os núcleos totais como o número total de agregados q40:YFP em cada poço. Conte o número de nematoides em cada poço e calcule o número médio de agregados Q40:YFP por nematoide em cada grupo.Então, calcule o índice de inibição. Para preparar nematoides para o ensaio de neurotoxicidade de polq, transfira 300 a 500 larvas L1 sincronizadas de nematoides HA759 para cada poço de uma placa de 48 poços com 500 microlitradores de S médio contendo cepa OP50 de E.coli e cinco miligramas por mililitro de astragalano. Após selar as placas, incubar, colher e resuspendar os nematoides no tampão M9, como demonstrado anteriormente.Agora, prepare-se em agarose pad adicionando dois gramas de agarose a 100 mililitros de tampão M9 e aqueça a solução em um micro-ondas para quase ferver. Dispense 0,5 mililitros de agarose derretido no centro de um deslizamento de vidro de microscopia de um milímetro de espessura colocado entre dois pedaços de placas de vidro de dois milímetros de espessura, cobrindo com outro slide verticalmente. Remova suavemente o slide superior quando a agarose esfriar e se solidificar.Inicie o ensaio de sobrevivência neuronal ASH adicionando uma gota de 20 milimônios de azida de sódio na almofada agros e, em seguida, transferindo 15 a 20 nematoides HA759 para a queda para imobilizá-los. Coloque um deslizamento de cobertura suavemente sobre os nematoides. Agora, mantenha o slide sob um microscópio de fluorescência equipado com uma câmera digital.Selecione uma lente objetiva de 40x e filtro FITC para detectar neurônios ASH positivos GFP na região principal dos nematoides. Selecione mais de 50 nematoides em cada grupo aleatoriamente para contar o número de nematoides com neurônios ASH bilaterais rotulados por GFP em sua região principal e, em seguida, calcular a taxa de sobrevivência dos neurônios ASH. Para o ensaio de prevenção osmótica, divida uma placa NGM livre de alimentos em zonas normais e de armadilha, criando uma linha de glicerol molar no meio.Em seguida, espalhe uma linha de azida de sódio de 200 milialar a cerca de um centímetro de distância da linha do glicerol para paralisar os nematoides que atravessam a barreira do glicerol até a zona de armadilha. Transfira cerca de 200 nematoides cada um para a zona normal de três placas de réplica para cada grupo. Em seguida, adicione uma queda de 1% butanedione na zona de armadilha para atrair os nematoides.Cubra a tampa da placa de Petri imediatamente e incubar a 23 graus Celsius por 90 minutos. Marque o número de nematoides em ambas as zonas sob um microscópio e calcule o índice de evasão. A cepa de poliq transgênico AM141 expressa fortemente proteínas de fusão Q40:YFP em suas células musculares da parede corporal, identificadas por este protocolo automatizado de imagem e análise, cuja quantidade crescente foi inibida pelo tratamento astragalano demonstrando seu potencial protetor.A perda de fluorescência GFP e neurônios ash bilaterais nas regiões da cabeça de nematoides indica a morte neuronal ash. Este ensaio de sobrevivência neuronal ASH pode ser usado para avaliar visualmente o efeito neuroprotetor de compostos de teste em neurônios de elegância de Caenorhabditis. O ensaio de evasão de quimioensory foi usado para examinar as amostras de teste eficazes sobre a perda funcional de neurônios ASH mediados pela agregação de polq.O índice de evasão de nematoides HA759 tratados com astragalano a 15 graus Celsius por três dias aumentou para mais de 0,6, demonstrando um efeito neuroprotetor do polissacarídeo contra prejuízos comportamentais. Para avaliar a capacidade neuroprotetora geral dos compostos de teste, os dados dos ensaios individuais foram integrados e apresentados como um gráfico de radar mostrando a área do triângulo no grupo de tratamento astragalano maior que a do grupo controle, indicando os efeitos anti-polícnico do polissacarídeo. Por favor, tenha em mente que comida, temperatura e umidade podem afetar seu comportamento de C.elegans.

caenorhabditis-elegans-as-model-system-for-discovering-bioactive

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Assaying Toxicidade β-amilóide utilizando um transgênico C. elegans Modelo

Este vídeo descreve um método in vivo para rastrear o potencial protetor de compostos de teste neuroprotetores na redução da agregação poliQ em células musculares da parede corporal de nematóides e na melhoria da proteotoxicidade associada à agregação.

Ensaio de agregação PolyQ para identificar o efeito neuroprotetor de um composto em vermes

Neste vídeo, descrevemos um método para avaliar o efeito neuroprotetor de um composto de teste, o astragalano, na sobrevivência neuronal em Caenorhabditis elegans da neurotoxicidade mediada por poliQ. O ensaio usa Caenorhabditis elegans expressando as repetições poliQ anormalmente expandidas fundidas à GFP em seus neurônios ASH para medir a sobrevivência neuronal após o tratamento com o composto de teste.

Um ensaio para estudar o efeito do composto de teste contra a neurotoxicidade mediada por PolyQ em vermes

Este vídeo descreve um ensaio de evitação osmótica para examinar o comportamento de quimioevitação em um modelo de verme transgênico. O comportamento de evitação é testado em uma placa na presença de uma barreira osmótica alta e quimioatraente. Os vermes com perda funcional de neurônios são atraídos pelo quimioatraente, atravessam a barreira osmótica alta e ficam paralisados na zona de armadilha por causa da solução anestésica.

Examine o comportamento de prevenção de quimioterapia em vermes transgênicos usando o ensaio de prevenção osmótica

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A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Sistema Modelo para Estudo Amylopathy

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Monitorando Cinética de Agregação de Proteínas In Vivo usando Contagem Automatizada de Inclusão em Elegans Caenorhabditis

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Aprenda a usar Caenorhabditis elegans para avaliar compostos neuroprotetores contra agregação de poliglutamina e morte neuronal. Este método integra múltiplos fenótipos para análise quantitativa de proteção neural em modelos de doença de Huntington.

Caenorhabditis elegans como um sistema modelo para descobrir compostos bioativos contra neurotoxicidade mediada por poliglutamina (Vídeo) | JoVE Journal

Caenorhabditis elegans como um sistema modelo para descobrir compostos bioativos contra neurotoxicidade mediada por poliglutamina

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