Fluorescência interfásico in situ Hibridização de Manchas de Medula Óssea de Mieloma Múltiplo
15 de abril de 2022
Aqui, apresentamos um protocolo para melhorar o sucesso da fluorescência interfásico na detecção de hibridização in situ em manchas de medula óssea de múltiplos pacientes com mieloma.
A aplicação da Fluorescência In Situ Hibridização chamada FISH à estratificação de risco genético em mieloma múltiplo é essencial. A parte crítica dos relatórios fish não são todas as células nucleadas, mas as células plasmáticas clonais especificamente purificadas ou identificadas por triagem com contas magnéticas anti-CD138 ou marcação com kappa citoplasmica ou imunoglobulina da cadeia de luz Lambda com teste de PEIXE chamado cIg FISH. Peixe interfáltico após a triagem de células plasmáticas ou cIg FISH acaba por ser significativo no diagnóstico de mieloma múltiplo, devido à proporção relativamente menor de células plasmáticas na medula óssea.
No entanto, esses métodos têm algumas deficiências, incluindo processos complexos, altas demandas de espécimes e altos custos experimentais. As células plasmáticas podem ser rapidamente localizadas em uma mancha de medula óssea. Com base nisso, usamos peixes de difamação de medula óssea para a detecção de múltiplas células de mieloma.
Este estudo foi conduzido de acordo com os princípios da Declaração de Helsinque e aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Zhongnan da Universidade de Wuhan. Os espécimes foram coletados de um paciente de mieloma múltiplo no Departamento de Hematologia do Hospital Zhongnan da Universidade de Wuhan, na China. Coloque os primeiros 0,2 mililitros de solução de medula óssea em um deslizamento de vidro descartável limpo, espalhe as manchas de medula óssea para espessura uniforme e caudas afiadas, removendo rapidamente a medula óssea e depois seque-a naturalmente.
Cubra os filmes de medula óssea com um mililitro da solução Wright-Giemsa por aproximadamente 10 segundos em temperatura ambiente. Adicione um mililitro de tampão fosfato aos slides, foi necessário cuidado para evitar que a solução de corante secasse ou fluísse dos slides. Misture a solução de corante suavemente e mantenha-a por 15 minutos em temperatura ambiente.
Enxágüe os slides com água limpa e seque-a no ar à temperatura ambiente. Use microscopia de luz para a frente para detectar células plasmáticas malignas, as células plasmáticas devem estar bem dispersas. Agora o que vemos no campo são as células plasmáticas que estão bastante dispersas.
Esta é uma típica célula de plasma nuclear binuclear. Cubra a área hibridizada com solução fixativa por 10 minutos para descolorir e fixar células plasmáticas. Enxágüe o escorregador com água desionizada e seque-a no ar à temperatura ambiente.
Pré-aqueça um frasco contendo duas vezes o tampão SSC a 56 graus Celsius em um banho de água. Lave a mancha de medula óssea preparada no tampão pré-aquecido duas vezes SSC por 10 minutos seguido de mergulho em água deionizada à temperatura ambiente. Desidratar a mancha em um gradiente de etanol 70%85% e 100% etanol cada um por um minuto.
Seque a mancha no ar por 10 minutos. Primeiro adicione TP53 no centromere da mistura de sonda cromossomo 17 à área de hibridização e cubra-a com um deslizamento de tampa pressione suavemente as pinças pontiagudas finas para remover bolhas de ar por baixo. Sele todos os lados da tampa com cimento de borracha para garantir um bom aperto.
Após a solidificação do cimento de borracha, o slide foi colocado em uma máquina de peixe automática a desnaturação foi realizada a 78 graus Celsius por cinco minutos seguido de hibridização a 37 graus Celsius durante a noite. Pegue o slide da máquina FISH. Use uma pinça pontiaguda fina para remover o cimento de borracha suavemente.
Mergulhe o slide em duas vezes O SSC à temperatura ambiente por aproximadamente um ou dois minutos para lavar a tampa. Lave o slide em 68 graus Celsius antes do dia-a-dia em um banho de água por dois minutos. Lave os slides com duas vezes SSC em um banho de água de 37 graus Celsius por um minuto.
Coloque-o bem no escuro para secar completamente por 10 minutos a 10 microliter de DAPI até a área hibridizada, cubra com um deslizamento de cobertura. Veja o slide hibridizado usando um conjunto de filtro adequado em um microscópio de fluorescência, use filtro óptico fluorophore azul monocromático para observar a intensidade da fluorescência do núcleo celular. Tire imagens do núcleo celular sob um conjunto de filtro DAPI.
O CEP17 foi rotulado com fluorescência verde. Use filtro óptico fluoróforo verde de espectro para observar a localização do CEP17. Pegue a imagem de sinais CEP17 em conjunto de filtro verde.
O gene TP53 foi rotulado com fluorescência laranja. Use filtro óptico fluoróforo laranja de espectro para observar TP53, pegue sinais TP53 sob o conjunto, mescle essas três imagens em uma totalidade e examine para anormalidades numéricas. Em uma célula interfásico normal, dois sinais laranja e dois verdes são observados dentro de um núcleo com fluorescência azul indicando um par de cromossomos normais 17.
Os resultados mostraram a morfologia e genética da medula óssea em um paciente com mieloma múltiplo. A Figura A mostrou que 15% das células plasmáticas em uma mancha de medula óssea foram encontradas com maiores e mais escuras e nucleares, juntamente com grandes quantidades de citoplasma do que o normal. A figura B mostrou uma imagem em escala cinza de representação por uma célula plasmática nucleada em uma mancha de medula óssea.
A Figura C mostrou quatro sinais laranja e quatro verdes em um núcleo interfásico de células plasmáticas sugerindo que quatro cópias do cromossomo 17 foram localizadas em um núcleo. A Figura D mostrou que o karyograma de cromossomo anormal deste paciente confirmou dois pares de cromossomos 17 em um núcleo. As manchas de medula óssea são muito mais fáceis de obter do que as amostras de medula óssea anticoagulantes porque a obtenção de medula óssea anticoagulada requer procedimentos complexos para obter o núcleo.
Assim, estabelecemos um método convincente para a detecção de múltiplas células de mieloma.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para aumentar a eficácia da detecção de hibridização fluorescente in situ (FISH) em interfase em esfregaços de medula óssea de pacientes com mieloma múltiplo. O estudo enfatiza a importância de identificar com precisão as células plasmáticas clonais para um diagnóstico eficaz.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Oncologia
- Genética
Contexto
- A hibridização fluorescente in situ (FISH) é fundamental para a estratificação do risco genético no mieloma múltiplo.
- As células plasmáticas clonais devem ser identificadas especificamente para um relatório preciso de FISH.
- Os métodos atuais apresentam limitações, incluindo complexidade e altos custos.
- Esfregaços de medula óssea podem facilitar a identificação mais rápida das células plasmáticas.
Objetivo do Estudo
- Para melhorar a detecção de células de mieloma múltiplo utilizando FISH em esfregaço de medula óssea.
- Para resolver as limitações dos métodos de FISH existentes.
- Para simplificar o processo de identificação de células plasmáticas clonais.
Métodos Utilizados
- Utilização de microesferas magnéticas anti-CD138 para o isolamento de células plasmáticas.
- Implementação da marcação de imunoglobulina de cadeia leve citoplasmática kappa ou lambda.
- Aplicação de FISH em interfase após o isolamento de células plasmáticas.
- Uso de FISH em esfregaço de medula óssea para detecção eficiente.
Resultados Principais
- A hibridização fluorescente in situ em esfregaço de medula óssea identifica efetivamente células de mieloma múltiplo.
- Maior precisão no diagnóstico de mieloma múltiplo por meio da detecção direcionada de células plasmáticas.
- Redução na demanda de espécimes e nos custos experimentais em comparação com métodos tradicionais.
- Protocolo aprimorado facilita diagnóstico mais rápido e planejamento do tratamento.
Conclusões
- O estudo apresenta uma alternativa viável para a detecção de células de mieloma múltiplo.
- A hibridização in situ por fluorescência em esfregaço de medula óssea pode superar as limitações das técnicas de FISH existentes.
- Pesquisas futuras podem focar na otimização adicional deste método para uso clínico.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método aborda um gargalo fundamental no diagnóstico do mieloma múltiplo ao permitir a análise por FISH em esfregaços de medula óssea facilmente disponíveis, reduzindo a dependência de aspirados frescos heparinizados. Ele possibilita uma estratificação genética de risco mais rápida e acessível nos fluxos de trabalho de oncologia hematológica, especialmente quando a obtenção de amostras é desafiadora. A abordagem melhora a continuidade translacional ao aumentar a viabilidade dos espécimes sem comprometer a especificidade das células plasmáticas clonais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biofármacos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de anormalidades cromossômicas em células plasmáticas clonais diretamente em esfregaços, apoiando a desvinculação mecanicista de alvos genômicos.
- Valor Operacional: Reduz a complexidade do processamento de espécimes ao eliminar a necessidade de separação celular ou enriquecimento prévio à FISH.
Desenvolvimento de Ensaios e Triagem
- Valor Científico: Fornece uma plataforma padronizada baseada em esfregaços para FISH em interfase, melhorando a prontidão do ensaio em amostras com baixo rendimento ou de difícil obtenção.
- Valor Operacional: Aumenta a reprodutibilidade ao minimizar variáveis pré-analíticas associadas ao manuseio e processamento de aspirados frescos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Apoia estudos alinhados a biomarcadores ao preservar o contexto espacial de células plasmáticas em esfregaços, permitindo a correlação entre morfologia e alterações genéticas.
- Valor Operacional: Facilita o monitoramento longitudinal em modelos pré-clínicos onde a aspiração repetida de medula óssea é inviável.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se na continuidade de descoberta a translacional ao fornecer um fluxo de trabalho viável de FISH quando as amostras primárias são limitadas, permitindo análises genéticas subsequentes sem atrasar a identificação de compostos promissores ou a validação pré-clínica.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre alterações genômicas clonais ao permitir a hibridização fluorescente in situ (FISH) em esfregaços de medula óssea arquivados ou de difícil processamento.
- Triagem: Aprimora a padronização dos ensaios ao utilizar esfregaços como substrato consistente para hibridização e detecção de sinais.
- Análises: Permite a avaliação quantitativa de alterações no número de cópias cromossômicas (por exemplo, TP53, CEP17) em núcleos em intérfase, contribuindo para a estratificação de risco.
- Pesquisa Translacional: Mantém a continuidade do estágio de descoberta até a validação pré-clínica, permitindo amostragens repetidas por meio de esfregaços em estudos longitudinais.
- Reutilização Corporativa: Estabelece um protocolo reutilizável de esfregaços prontos para FISH, aplicável a diversos modelos de mieloma múltiplo e tipos de amostras.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Melhora a confiança preditiva na avaliação de risco genômico ao permitir a hibridização fluorescente in situ (FISH) em amostras que de outra forma seriam inadequadas para análise.
- Valor Operacional: Aumenta a produtividade laboratorial e reduz o tempo de resposta ao simplificar o preparo dos espécimes.
- Valor Estratégico: Reduz riscos biológicos e técnicos nas decisões iniciais ao ampliar o acesso a dados citogenéticos essenciais.
- Impacto no Portfólio: Apoia o avanço com ajuste de risco ao tornar viável a estratificação baseada em FISH em ambientes com recursos limitados ou em contextos clínicos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência no design de sondas FISH, hibridização e microscopia de fluorescência para interpretação precisa do sinal.
- Depende do acesso a equipamentos FISH padrão, incluindo câmaras de hibridização, tampões de lavagem e conjuntos de filtros para DAPI, verde espectro e laranja espectro.
- Necessita padronização dos protocolos de preparação e coloração de esfregaços para garantir morfologia e retenção consistentes das células plasmáticas.
- Deve levar em conta a variabilidade na densidade de células plasmáticas entre esfregaços ao determinar a profundidade da amostragem e os limiares de quantificação do sinal.
- Limitado à análise em intérfase; não permite cariótipo em metáfase ou detecção de rearranjos estruturais sem métodos adicionais.
