Name: O ensaio baseado em microscopia para estudar e analisar os endossomos de reciclagem usando o tráfico de SNARE (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Aprenda a analisar endossomos de reciclagem em melanócitos de pele usando microscopia de imunofluorescência com GFP-STX13. Este método revela dinâmicas organelares cruciais para a biogênese de melanossomos e compreensão de distúrbios de pigmentação.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Biotecnologia (BT/PR32489/BRB/10/1786/2019 à SRGS); Conselho de Pesquisa em Ciência e Engenharia (CRG/2019/000281 à SRGS); DBT-NBACD (BT/HRD-NBA-NWB/38/2019-20 para SRGS) e programa de parceria IISc-DBT (para SRGS). A infraestrutura no departamento foi apoiada pelo DST-FIST, DBT e UGC. A AMB foi apoiada pelo DBT-JRF (DBT/2015/IISc/NJ-02).

O protocolo envolve a semeadura de melanócitos seguidos pela transfecção dos plasmídeos. Outras etapas incluem fixação, imunostaining, imagem e análise das células para medir o comprimento e o número de REs. A descrição detalhada do protocolo é dada abaixo.
1. Semeadura de melanócitos de rato em tampas pré-tratadas
<ol><li>Cubra as tampas de vidro em uma placa de Petri (ou seja, 4 - 5 em uma placa de 35 mm) com meio de matriz de membrana de porão (1:20 em meio RPMI completo: RPMI + 10% de calor inativado FBS + 1x Glutamina + 1x Mistura de antibiótico) e seque-o na capa de cultura tecidual por 15 min. Lave as tampas uma vez com 1x PBS antes de usar.</li>
	<li>Mantenha os melancias de camundongos do tipo selvagem (melan-Ink4a-Arf-1 de C57BL/6J, a/a, Ink4a-Arf-/- ratos, descritos em 20 e disponíveis no The Welcome Trust Functional Genomics Cell Bank) em uma placa de Petri (ou seja, 35 ou 60 mm de prato) complementada com meio RPMI completo.<ol>
<li>Lave as células duas vezes com 1x PBS e adicione 0,5 ou 1 mL de solução Trypsin-EDTA (0,25%) para células experimentadoras. Incubar as células a 37 °C por 2 - 5 min para o desprendimento da placa de Petri.</li>
		<li>Adicione 1 - 2 mL de meio RPMI completo, suspenda e transfira as células para um tubo de centrífuga.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugar a suspensão da célula a 4 °C, 376 x g por 5 min e, em seguida, resuspensar a pelota em 1x PBS.</li>
	<li>Repita a etapa de centrifugação e resuspense as células em 1 mL de meio RPMI completo.</li>
	<li>Semear as células na membrana do porão de coberturas de camadas médias revestidas a 50-60% de confluência (aproximadamente 6 x 105 células em um prato de cultura celular de 35 mm contendo 4 - 5 tampas). Adicione sempre 200 nM de PMA (adicione 5 μL de estoque de trabalho 40 μM phorbol 12-myristate 13-acetato) à suspensão de célula cravada em meio RPMI completo.</li>
	<li>Após a semeadura, incubar a placa a 37 °C por 12-24 h.</li>
</ol>2. Transfecção de células com os plasmídeos STX13
<ol><li>Use os seguintes reagentes: pEGFP-C1-STX13WT e pEGFP-C1-STX13Δ129 (descrito em 12). mCherry-Rab11, foi um gentil presente de Graça Raposo, Institut Curie, Paris (descrito em referência19). Anticorpo anti-TYRP1 da ATCC (TA99).</li>
	<li>Após 12 - 24 h de semeadura, transfete as células com plasmídeos usando um reagente de transfecção à base de lipídio. Para um prato de 35 mm, pegue 5 μL do reagente de transfecção em 250 μL de meio OPTI-MEM em um tubo de microcentrifusagem e tome aproximadamente 200 ng de cada plasmídeo em 250 μL de OPTI-MEM.</li>
	<li>Incubar os tubos contendo DNA e o reagente de transfecção por 5 minutos. Misture sem a pipetação repetida (o volume total será de cerca de 500 μL). Incubar por 30 minutos à temperatura ambiente. Faça toques manuais do tubo a cada 10 minutos por 30 min no RT.</li>
	<li>Durante a incubação, lave as células duas vezes com 1x PBS, uma vez com OPTI-MEM e, em seguida, adicione 1 mL de OPTI-MEM às células.</li>
	<li>Após 30 minutos de incubação, adicione a mistura reagente-DNA de transfecção às células de forma dropwise, cobrindo o prato.</li>
	<li>Incubar as células a 37 °C por 6 h. Aspire o meio OPTI-MEM com reagente de transfecção e adicione meio RPMI completo complementado com 200 nM de PMA.</li>
	<li>Incubar as células a 37 °C por 48 h.</li>
</ol>3. Fixação das células
NOTA: O procedimento a seguir é realizado fora da capa da cultura tecidual.
<ol><li>Após 48 h de transfecção, lave as células duas vezes com 1x PBS e, em seguida, fixe as células com 3% de formaldeído (recém-preparado em 1x PBS) por 30 minutos.</li>
	<li>Após a fixação, lave as células duas vezes com 1x PBS e armazene as tampas em 1x PBS até usar mais. Alternativamente, as células podem ser montadas em lâminas de vidro (veja abaixo) ou armazenadas a 4 °C.</li>
</ol>4. Imunostaining das células
<ol><li>Prepare uma câmara úmida: coloque peça cortada de filme de parafina em papel filtro úmido em uma placa de Petri, coberta com papel alumínio.</li>
	<li>Prepare 25 μL de solução de anticorpos primários (0,2% saponina em 1x PBS, 0,1% BSA em 1x PBS e 0,02% azide de sódio em 1x PBS). Adicione anticorpos a uma diluição de 1:200. Adicione esta solução como uma gota em um filme de parafina na câmara úmida.</li>
	<li>Levante cuidadosamente o deslizamento com fórceps, inverta-o nesta gota de solução primária de coloração de anticorpos e, em seguida, cubra a tampa da câmara úmida. Incubar em temperatura ambiente por 30 minutos.</li>
	<li>Da mesma forma, prepare a solução de anticorpos secundários em uma diluição de 1:500 e coloque-a em filme de parafina ao lado do deslizamento de tampas na câmara úmida. Para coloração do núcleo, adicione DAPI (1:20.000 a 1:30.000) à solução.</li>
	<li>Usando fórceps, pegue cuidadosamente o deslizamento de tampas da solução de anticorpos primário e mergulhe-o três vezes em 1x PBS (em um copo de vidro).</li>
	<li>Toque na tampa no papel de tecido para remover o excesso de PBS na tampa. Coloque-o sobre a solução secundária de coloração de anticorpos na câmara úmida e não exponha à luz devido à presença de anticorpos fluorescentes marcados na solução.</li>
	<li>Incubar a tampa novamente por 30 minutos em temperatura ambiente. Por favor, sempre observe o lado do deslizamento que tem as células ao longo dessas etapas.</li>
	<li>Após a incubação, pegue cuidadosamente o deslizamento de tampas da solução de anticorpos secundários e, em seguida, mergulhe-o três vezes em 1x PBS. Além disso, toque a mancha de cobertura no papel de tecido para remover o excesso de PBS na tampa.</li>
	<li>Coloque 12 μL de reagente de montagem Fluoromount-G em um slide de vidro e coloque cuidadosamente o talo de coberturas manchadas (voltado para o vidro) no reagente de montagem. Inverta o deslizamento de vidro no papel de tecido e, em seguida, pressione suavemente.</li>
</ol>5. Microscopia de fluorescência das células
<ol><li>Imagem das células manchadas sob filtros de campo brilhante (BF) e fluorescência (IF) usando um microscópio de fluorescência invertido equipado com uma câmera CCD usando objetivo apocromático de 60x (óleo) ou qualquer outro microscópio com uma configuração semelhante.</li>
</ol>6. Quantificação da sobreposição entre as proteínas localizadas re e os melanomas:
NOTA: As seguintes etapas são seguidas para a quantificação do coeficiente de sobreposição de Mander entre as proteínas usando o software Fiji (livremente baixado do link: https://imagej.net/software/fiji/). Use a imagem TIFF com vários canais.
<ol><li>
Abra a imagem bruta. Vá para a opção Imagem, selecione Cores | Divida os canais e utilize os dois canais para análise.</li>
	<li>Abra o plugin JACoP na opção Plugin.</li>
	<li>Defina o limite para ambos os canais, de tal forma que todos os pontos brilhantes sejam selecionados e o plano de fundo seja eliminado.</li>
	<li>Vá para a opção Análise, selecione coeficientes M1 e M2 para obter o coeficiente de sobreposição de Mander.</li>
	<li>Pressione a opção Analisar no Plugin JACoP e veja o resultado que exibe o coeficiente de sobreposição de Mander.</li>
</ol>7. Quantificação do número e comprimento tubulares da reciclagem de endosomes:
NOTA: As seguintes etapas são seguidas para a quantificação do número e comprimento dos túbulos usando o software Fiji.
<ol><li>Abra a imagem bruta Vá para a imagem, selecione Cores | Divida os canais e utilize o canal desejado para análise.</li>
	<li>Vá para imagem novamente, selecione Tipo | Converta-se em imagem de 8 bits.</li>
	<li>Em seguida, vá para Plugins, selecione Analisar | Tubeness. Definir o valor sigma em 0,1075 . Pressione Ok.</li>
	<li>Vá para Imagem novamente, selecione Tipo | Converta-se em imagem de 8 bits.</li>
	<li>Vá para | de Imagem Ajuste | Limiar (Use os mesmos valores de limiar para todas as imagens. As imagens devem ter uma intensidade aproximadamente igual).</li>
	<li>Vá para Process | | binário Converta-se em máscara.</li>
	<li>Vá para Processar, selecione Binário e selecione Skeletonize.</li>
	<li>Vá para Analisar, selecione Esqueleto e escolha Analisar esqueleto. Em resultado e saída | selecionar ( a) Calcular o maior caminho mais curto | (b) mostrar informações detalhadas | (c) exibir o esqueleto rotulado. Pressione Ok. NOTA: O resultado será aberto no formato tabulado. A coluna de comprimento médio do ramo mostra o comprimento de todos os diferentes túbulos da célula selecionada (escala definida para obter valores em micrometos).</li>
	<li>Para obter o número de túbulos na célula, vá para Analisar e selecione Analisar a opção Analisar partículas . Pressione Ok. NOTA: Nos resultados obtidos, a coluna de contagem mostra o número de túbulos naquela célula específica.</li>
	<li>Salve os dados e analise.</li>
</ol>

<ol><li>Dell'Angelica, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+building+BLOC%28k%29s+of+lysosomes+and+related+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The building BLOC(k)s of lysosomes and related organelles.</a> Current Opinion in Cell Biology. 16 (4), 458-464 (2004).</li>
<li>Raposo, G., Marks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanosomes--dark+organelles+enlighten+endosomal+membrane+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Melanosomes--dark organelles enlighten endosomal membrane transport.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (10), 786-797 (2007).</li>
<li>Ohbayashi, N., Fukuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+understanding+the+molecular+basis+of+melanogenesis+in+melanocytes%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Recent advances in understanding the molecular basis of melanogenesis in melanocytes.</a> F1000Research. 9, F1000 Faculty Rev-608 (2020).</li>
<li>Theos, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+adaptor+protein+%28AP%29-3+and+AP-1+in+tyrosinase+sorting+from+endosomes+to+melanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Functions of adaptor protein (AP)-3 and AP-1 in tyrosinase sorting from endosomes to melanosomes.</a> Molecular Biology of the Cell. 16 (11), 5356-5372 (2005).</li>
<li>Di Pietro, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLOC-1+interacts+with+BLOC-2+and+the+AP-3+complex+to+facilitate+protein+trafficking+on+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">BLOC-1 interacts with BLOC-2 and the AP-3 complex to facilitate protein trafficking on endosomes.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (9), 4027-4038 (2006).</li>
<li>Setty, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLOC-1+is+required+for+cargo-specific+sorting+from+vacuolar+early+endosomes+toward+lysosome-related+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">BLOC-1 is required for cargo-specific sorting from vacuolar early endosomes toward lysosome-related organelles.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (3), 768-780 (2007).</li>
<li>Delevoye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AP-1+and+KIF13A+coordinate+endosomal+sorting+and+positioning+during+melanosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">AP-1 and KIF13A coordinate endosomal sorting and positioning during melanosome biogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 187 (2), 247-264 (2009).</li>
<li>Bultema, J. J., Ambrosio, A. L., Burek, C. L., Di Pietro, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLOC-2%2C+AP-3%2C+and+AP-1+proteins+function+in+concert+with+Rab38+and+Rab32+proteins+to+mediate+protein+trafficking+to+lysosome-related+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">BLOC-2, AP-3, and AP-1 proteins function in concert with Rab38 and Rab32 proteins to mediate protein trafficking to lysosome-related organelles.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (23), 19550-19563 (2012).</li>
<li>Sitaram, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+recognition+of+a+dileucine-based+sorting+signal+by+AP-1+and+AP-3+reveals+a+requirement+for+both+BLOC-1+and+AP-3+in+delivery+of+OCA2+to+melanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Differential recognition of a dileucine-based sorting signal by AP-1 and AP-3 reveals a requirement for both BLOC-1 and AP-3 in delivery of OCA2 to melanosomes.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3178-3192 (2012).</li>
<li>Nag, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab4A+organizes+endosomal+domains+for+sorting+cargo+to+lysosome-related+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Rab4A organizes endosomal domains for sorting cargo to lysosome-related organelles.</a> Journal of Cell Science. 131 (18), (2018).</li>
<li>Dennis, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLOC-2+targets+recycling+endosomal+tubules+to+melanosomes+for+cargo+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">BLOC-2 targets recycling endosomal tubules to melanosomes for cargo delivery.</a> Journal of Cell Biology. 209 (4), 563-577 (2015).</li>
<li>Jani, R. A., Purushothaman, L. K., Rani, S., Bergam, P., Setty, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STX13+regulates+cargo+delivery+from+recycling+endosomes+during+melanosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">STX13 regulates cargo delivery from recycling endosomes during melanosome biogenesis.</a> Journal Cell Science. 128 (17), 3263-3276 (2015).</li>
<li>Shakya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab22A+recruits+BLOC-1+and+BLOC-2+to+promote+the+biogenesis+of+recycling+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Rab22A recruits BLOC-1 and BLOC-2 to promote the biogenesis of recycling endosomes.</a> EMBO Reports. 19 (12), 45918(2018).</li>
<li>Bowman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+BLOC-1-AP-3+super-complex+sorts+a+cis-SNARE+complex+into+endosome-derived+tubular+transport+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A BLOC-1-AP-3 super-complex sorts a cis-SNARE complex into endosome-derived tubular transport carriers.</a> Journal of Cell Biology. 220 (7), 202005173(2021).</li>
<li>Wei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hermansky-Pudlak+syndrome%3A+a+disease+of+protein+trafficking+and+organelle+function%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Hermansky-Pudlak syndrome: a disease of protein trafficking and organelle function.</a> Pigment Cell Research. 19 (1), 19-42 (2006).</li>
<li>Bowman, S. L., Bi-Karchin, J., Le, L., Marks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+road+to+lysosome-related+organelles%3A+Insights+from+Hermansky-Pudlak+syndrome+and+other+rare+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The road to lysosome-related organelles: Insights from Hermansky-Pudlak syndrome and other rare diseases.</a> Traffic. 20 (6), 404-435 (2019).</li>
<li>Prekeris, R., Klumperman, J., Chen, Y. A., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syntaxin+13+mediates+cycling+of+plasma+membrane+proteins+via+tubulovesicular+recycling+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Syntaxin 13 mediates cycling of plasma membrane proteins via tubulovesicular recycling endosomes.</a> Journal of Cell Biology. 143 (4), 957-971 (1998).</li>
<li>Mahanty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab9A+is+required+for+delivery+of+cargo+from+recycling+endosomes+to+melanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Melanoma+Research%22%5BJournal%5D)">Rab9A is required for delivery of cargo from recycling endosomes to melanosomes.</a> Pigment Cell Melanoma Research. 29 (1), 43-59 (2016).</li>
<li>Delevoye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recycling+endosome+tubule+morphogenesis+from+sorting+endosomes+requires+the+kinesin+motor+KIF13A%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Recycling endosome tubule morphogenesis from sorting endosomes requires the kinesin motor KIF13A.</a> Cell Reports. 6 (3), 445-454 (2014).</li>
<li>Ha, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARF+functions+as+a+melanoma+tumor+suppressor+by+inducing+p53-independent+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">ARF functions as a melanoma tumor suppressor by inducing p53-independent senescence.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 104 (26), 10968-10973 (2007).</li>
<li>Soldati, T., Schliwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Powering+membrane+traffic+in+endocytosis+and+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Powering membrane traffic in endocytosis and recycling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (12), 897-908 (2006).</li>
<li>Grant, B. D., Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+and+mechanisms+of+endocytic+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pathways and mechanisms of endocytic recycling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).</li>
<li>Hsu, V. W., Prekeris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+at+the+recycling+endosome%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Transport at the recycling endosome.</a> Current Opinion in Cell Biology. 22 (4), 528-534 (2010).</li>
<li>Taguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+recycling+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of recycling endosomes.</a> Journal of Biochemistry. 153 (6), 505-510 (2013).</li>
<li>Goldenring, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recycling+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Recycling endosomes.</a> Current Opinion in Cell Biology. 35, 117-122 (2015).</li>
<li>Delevoye, C., Marks, M. S., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosome-related+organelles+as+functional+adaptations+of+the+endolysosomal+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Lysosome-related organelles as functional adaptations of the endolysosomal system.</a> Current Opinion in Cell Biology. 59, 147-158 (2019).</li>
<li>Hsu, V. W., Bai, M., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+active%3A+protein+sorting+in+endocytic+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Getting active: protein sorting in endocytic recycling.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 13 (5), 323-328 (2012).</li>
<li>Desfougeres, Y., D'Agostino, M., Mayer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+tethering+complex+for+endosomal+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A modular tethering complex for endosomal recycling.</a> Nature Cell Biology. 17 (5), 540-541 (2015).</li>
<li>Le, L., Sires-Campos, J., Raposo, G., Delevoye, C., Marks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanosome+biogenesis+in+the+pigmentation+of+mammalian+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Integrated+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Melanosome biogenesis in the pigmentation of mammalian skin.</a> Integrated Computational Biology. 61 (4), 1517-1545 (2021).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm conflito de interesses.

Os endossóis de reciclagem são uma coorte de organelas endocíticas, e mediam a reciclagem de carga para a superfície celular em todos os tipos de células21,22,23,24,25. Em tipos de células especializadas, como os melanócitos, essas organelas desviam parcialmente sua rota de tráfico em direção aos melanomas para sua biogênese3,16,26.<sup...

A biossíntese de pigmentos de melanina ocorre em melanósias, uma organela lysosome específica de melanócito (LRO) que coexiste com lysososomes convencionais. O sistema endocítico desempenha um papel fundamental na biogênese dos melanomas, necessário para a cor da pele e fotoproteção contra radiação ionizante1,2,3. Durante esse processo, as enzimas sintetizadoras de melanina são classificadas em endosários precoces/de triagem e depois transportadas para melanomas prematuros através de endosários tubulares ou vesiculares chamados endosários de reciclagem (REs)4,5,6,7,8,9,10. O direcionamento e fusão dessas organelas regulam o amadurecimento de melanosomes pigmentados totalmente funcionais7,11,12,13,14. Defeitos na formação dessas organelas ou triagem de cargas para essas organelas causam albinismo oculocutâneo e outros fenótipos clínicos, observados na síndrome de Hermansky-Pudlak15,16.
Aqui descrevemos uma técnica simples baseada em microscopia para estudar e analisar os REs. Neste método, aproveitamos uma proteína transmembrana, a Rexexina Qa-SNARE (STX)13 que reside na reciclagem de endossolas17 e ciclos entre endossários de triagem e melanócitos12,18. Além disso, a exclusão do domínio regulatório não estruturado n-terminal (ou seja, SynN ou STX13Δ129) permite que o SNARE fique preso em melanomas, o que mede o caminho de tráfico para o melanosome12. Usamos um marcador endossomal de reciclagem conhecido Rab GTPase (Rab)11 em nossos estudos14,19. A imagem de fluorescência das proteínas GFP-STX13WT, GFP-STX13Δ129, mCherry-Rab11 e TYRP1 em melanócitos do tipo selvagem seguidos de quantificação de sua localização relativa fornecerá a natureza e a dinâmica das REs, além de sua segmentação para melanósimos. Assim, esta é uma técnica simples que pode ser usada para visualizar e medir a dinâmica dos REs em melanócitos.

<table><tbody><tr><td>anticorpo anti-TYRP1 (TA99)</td><td>ATCC</td><td>HB-8704</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11668-500</td><td></td></tr><tr><td>Matriz Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>022600-050</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12- miristato 13-acetato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Médio 1640</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31800-022</td><td></td></tr></tbody></table>

o ensaio baseado em microscopia para estudar e analisar os endossomos de reciclagem usando o tráfico de snare

The Microscopy-Based Assay to Study and Analyze the Recycling Endosomes using SNARE Trafficking

Endosomos de reciclagem (REs) são organelas tubulares-vesiculares geradas a partir de endossóis precoces/de triagem em todos os tipos de células. Essas organelas desempenham um papel fundamental na biogênese dos melanósimos, uma organela relacionada ao lysosome produzida por melanócitos. Os REs fornecem a carga específica de melanócitos para melanomas prematuros durante sua formação. O bloqueio na geração de REs, observado em vários mutantes da síndrome de Hermansky-Pudlak, resulta em hipopigmentação da pele, cabelo e olho. Portanto, estudar a dinâmica (referem-se ao número e comprimento) das REs é útil para entender a função dessas organelas em condições normais e da doença. Neste estudo, pretendemos medir a dinâmica RE utilizando um SNARE STX13 residente.

Quantificação da localização mutante STX13Δ129 para os melanomas A microscopia de imunofluorescência de STX13 em melanócitos do tipo selvagem do rato mostrou GFP-STX13WT localizado como estruturas vesiculares e tubulares e GFP-STX13Δ129 localizado como estruturas semelhantes a anéis, além da superfície celular (Figura 1A). Além disso, o anel intracelular GFP-STX13Δ129 mostrou colocalização com a proteína ...

Os endosários de reciclagem fazem parte da rede tubular endosomal. Aqui apresentamos um método para quantificar a dinâmica da reciclagem de endósmos usando GFP-STX13 como marcador de organela.

O ensaio baseado em microscopia para estudar e analisar os endossomos de reciclagem usando o tráfico de SNARE

Recycling endosomes (REs) are tubular-vesicular organelles generated from early/sorting endosomes in all cell types. These organelles play a key role in ...

O ensaio baseado em microscopia para estudar e analisar os endossomos de reciclagem utilizando o tráfico snare. São melanócitos de pele. As organelas de cor negra que você vê dentro das células são chamadas de melanomas.Os melanomas são conhecidos como uma classe de organelas chamadas organelas relacionadas ao lysozome ou LRO. Endosósias de reciclagem são organelas vesiculares tubulares de endossoes precoces ou de triagem em todos os tipos de células. Essas organelas desempenham um papel fundamental na biogênese dos melanósimos, uma organela relacionada ao lysozome produzida por melanócitos.Os endosários de reciclagem fornecem a carga específica de melanócitos para melanomas prematuros durante sua formação. a geração de endossóis de reciclagem observados em várias síndromes são células na hiperpigmentação da pele, cabelo e olho. Portanto, estudar a dinâmica da reciclagem de endósmosos é útil para entender a função dessas organelas em condições normais e de doenças.Este estudo tem como objetivo medir a dinâmica dos endósmosos de reciclagem utilizando a sintaxe SNARE-13. O primeiro passo é a semeadura de melanócitos de rato em tampas pré-tratadas. Cubra as tampas de vidro na placa de Petri no meio da matriz de membrana do porão.E seque-o na capa da cultura tecidual por 15 minutos. Lave as tampas uma vez com 1X PBS antes de usar. Semear as células da membrana do porão com coberturas revestidas médias de 50 a 60%.Adicione sempre 200 nanomolars de PMA à suspensão de células banhadas em mídia RPMI completa. Após semear as células, incubar o prato contendo células na incubadora de CO2 por 12 a 24 horas. O segundo passo é a transfecção de células com plasmídeos de sintaxin-13.Incubar as pontas contendo DNA e reagente de transfecção, misture por cinco minutos e misture sem a pipetação repetida. Toque o tubo com a cada dez minutos por 30 minutos em temperatura ambiente. Durante a incubação, lave as células duas vezes com 1X PBS, uma vez com OPTI-MEM, e depois adicione 1 mil de OPTI-MEM às células.Após 30 minutos de incubação, adicione a mistura de DNA do reagente transfecção às células de forma em gota, cobrindo o prato. Incubar as células a 37 graus Celsius por seis horas. Aspire o meio OPTI-MEM com reagente de transfecção e adicione meio RPMI completo complementado com 200 nanomolars de PMA.Incubar as células a 37 graus Celsius por 48 horas. O terceiro passo é a fixação das células. Por favor, note que o procedimento a seguir é realizado fora da capa da cultura tecidual.Após 48 horas de transfecção, lave as células duas vezes com 1X PBS e, em seguida, fixe as células com 3% de formaldeído por 30 minutos. Após a fixação, lave as células duas vezes com 1X PBS e armazene as tampas em 1X PBS até usar mais. Alternativamente, as células podem ser montadas em placas de vidro ou armazenadas a quatro graus Celsius.O quarto passo é a imunostenção das células. Prepare uma câmara úmida. Coloque o pedaço de corte de parafilm em um papel filtro de mouse em uma placa de Petri.Cubra com papel alumínio. Prepare 25 microliters de solução primária de anticorpos. Adicione anticorpos a uma diluição de 1 a 200.Adicione esta solução como uma gota no parafilme na câmara úmida. Levante cuidadosamente a mancha de cobertura com fórceps. Inverta-o na gota da solução primária de coloração de anticorpos e cubra a tampa da câmara úmida.Incubar em temperatura ambiente por 30 minutos. Da mesma forma, prepare a solução de anticorpos secundários em uma diluição de 1 a 500 e coloque-a no parafilme ao lado do deslizamento de tampas na câmara úmida. Para colorir o núcleo, adicione DAPI em uma diluição de 120.000 a 130.000 à solução.Usando fórceps, pegue cuidadosamente o deslizamento de tampas da solução de anticorpos primário e mergulhe-o duas vezes em 1X PBS. Toque na tampa no papel de tecido para remover o excesso de PBS na tampa. Coloque-a sobre a solução secundária de coloração de anticorpos na câmara úmida e não exponha à luz, devido à presença de anticorpos fluorescentes tingidos na solução.Após a incubação, pegue cuidadosamente o deslizamento de tampas da solução de anticorpos secundários e, em seguida, mergulhe-o duas vezes em 1X PBS. Além disso, toque a mancha de cobertura no papel de tecido para remover o excesso de PBS na tampa. Coloque 12 microliters de reagente de imagem em um slide de vidro e coloque cuidadosamente o deslizamento de tampas manchadas no reagente de montagem.Inverta o deslizamento de vidro no papel do tecido e, em seguida, pressione suavemente. Em seguida, imagem o deslizamento de tampa usando um microscópio de fluorescência e analisar as imagens usando ImageJ. O sexto passo é a quantificação da sobreposição entre a reciclagem de proteínas localizadas e melanomas.Quantificação da sintaxe-13 delta-129 colocalização com os melanomas. A microscopia de imunofluorescência de sintaxe-13 em melanócitos do tipo selvagem do rato mostrou GFP-syntaxina-13 tipo selvagem localizado como estruturas vesiculares e tubulares. E a GFP-sintaxe-13 delta-129 localiza estruturas semelhantes a anéis, além da superfície celular.Além disso, o anel intracelular GFP-syntaxina-13 delta-129 mostrou colocalização com a proteína melanósia TYRP1 em melanosomes com imagem de campo brilhante. Como mostrado anteriormente, uma coorte de GFP-sintaxe superexpressa-tipo selvagem é observada em melanomas. Para medir a localização relativa do tipo selvagem GFP-sintaxin-13 e GFP-syntaxina-13 delta-129 para melanomas, o software Fiji foi utilizado e a análise foi feita com plugin JACOP.O coeficiente de sobreposição de Mander medido, que é MOC, entre gfp-sintaxe-13 delta-129 com TYRP1 é aproximadamente 1,5 dobras maior em comparação com gfp-sintaxe-13 tipo selvagem com TYRP1. Curiosamente, o TYRP1 mostrou 2,9 dobras mais altas de valores MOC com gfp-sintaxe-13 delta-129 em comparação com gfp-sintaxe-13 tipo selvagem. Esses dados indicam que a localização de melanósias delta-129 delta-129 de GFP é relativamente maior em comparação com o tipo selvagem GFP-syntaxin-13 em um estado estável.Quantificação da sintaxe-13 localização do tipo selvagem dos endosses reciclados. A microscopia de imunofluorescência do tipo selvagem GFP-sintaxe-13 mostrou colocalização com a conhecida proteína endossomal de reciclagem Rab11. O MOC entre gfp-sintaxe-13 tipo selvagem com mCherry-Rab11 é aproximadamente 1,4 dobras maior em comparação com mCherry-Rab11 com GFP-sintaxe-13 tipo selvagem.Para medir o número e o comprimento dos túbulos endosomais positivos do tipo selvagem GFP-sintaxe-13, o software Fiji foi usado como descrito na seção de protocolo. MCherry-Rab11 é usado um controle positivo nos experimentos. Os melanócitos transfectados com gfp-sintaxe-13 tipo selvagem mostraram um maior número de túbulos por célula em comparação com células expressando mCherry-Rab11.No entanto, os túbulos são reduzidos após a coexpressão tanto do tipo selvagem GFP-sintaxe-13 quanto do mCherry-Rab11 nas células. O sétimo passo é a quantificação do número e comprimento tubulares de reciclagem de endossóis. Os túbulos são reduzidos após a coexpressão tanto do tipo selvagem GFP-sintaxe-13 quanto do mCherry-Rab11 nas células.Curiosamente, o comprimento médio do túbulo tanto do tipo selvagem GFP-syntaxina-13 quanto do mCherry-Rab11 é comparável entre si em células expressas individualmente ou juntas. Juntos, esses dados sugerem que o tipo selvagem GFP-sintaxe-13 localiza-se para a reciclagem de endósmos como semelhante ao Rab11. Este estudo mostrou que a entrega do N-terminal de sintaxe-13 mutante, que é GFP-syntaxin-13 delta-129, localiza-se a melanósias GFP-sintaxe-13 delta-129 pode possivelmente ser usada como repórter para o tráfico vesicular da reciclagem de endosários para a superfície celular e LRO.Em contraste, o tipo selvagem GFP-sintaxin-13 localiza-se para a reciclagem de endossóis semelhantes ao Rab11. Este estudo ilustrou que o tipo selvagem GFP-sintaxe-13 também poderia ser usado para marcar endossários de reciclagem em melanócitos. GFP-sintaxe-13 tipo selvagem pode ser um melhor marcador endosomal de reciclagem do que Rab11, uma vez que Rab11 altera a dinâmica endossomal.Ao todo, o tipo selvagem GFP-sintaxe-13 atua como um marcador endosomal de reciclagem potencial para estudar a dinâmica em condições de estado constantes.

the-microscopy-based-assay-to-study-analyze-recycling-endosomes-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nós desenvolvemos um ensaio de fusão de células que quantifica SNARE mediadas por eventos de fusão da membrana por expressão activada de β-galactosidase.

Análise de SNARE mediada por fusão de membrana usando um ensaio de fusão celular enzimática

O tráfego de membrana envolve o transporte de proteínas da membrana plasmática para o interior da célula (ou seja, endocitose) seguido de tráfego para lisossomos para degradação ou para a membrana plasmática para reciclagem. Os métodos descritos neste artigo são projetados para estudar endocitose e reciclagem de proteínas da membrana plasmática.

Os ensaios de proteção de L-glutationa baseados em células para estudar endocitose e reciclagem de proteínas da membrana plasmática

Tráfico receptor modula a sinalização celular e a capacidade de resposta a ligandos e é, em si, que respondem a condições de células, incluindo a sinalização induzida por ligando. Aqui, descrevemos uma técnica poderosa e flexível para avaliar quantitativamente o tráfico receptor induzida por drogas utilizando imunomarcação ea análise colocalizational.

Rastreando alterações induzidas pela droga em Receptor de Pós-internalização Tráfico de Análise Colocalizational

A investigação do tráfico de membranas é crucial para a compreensão das funções neuronais. Aqui, introduzimos um método para quantificar a motilidade vesicular nos neurónios. Este é um método conveniente que pode ser adaptado para a quantificação do tráfico de membrana no sistema nervoso.

Quantificação de Endosome e Moosidades de Lisosoma em Neurônios Cultivados Usando Sondas Fluorescentes

Endocitose da vesícula sináptica é detectada pela microscopia de luz de pHluorin fundido com proteínas de vesículas sinápticas e por microscopia eletrônica de absorção da vesícula.

Medindo a endocitose da vesícula sináptica nos neurônios Hippocampal culturas

Este protocolo descreve um método novo, permitindo a visualização quantitativa da formação do complexo de proteínas SNARE, baseado na transferência de energia de ressonância de Förster e vida de fluorescência, microscopia de imagem.

Visualizando intracelular SNARE tráfico pela vida de fluorescência, microscopia de imagem

Descrevemos um ensaio óptico para vesícula sináptica (SV) reciclagem em neurônios cultivados. Combinar este protocolo com duplo transfeccao de expressar uma proteína de interesse e o marcador pré-sináptica nos permite localizar sites pré-sináptica, sua vesícula sináptica, capacidade de reciclagem e determinar o papel da proteína de interesse.

Um ensaio óptico para vesícula sináptica reciclagem nos neurônios cultivados superexpressão de proteínas pré-sináptica

Efferocytosis, a remoção fagocitária das células apoptóticas, é necessário para manter a homeostase e é facilitado por receptores e vias de sinalização que permitem o reconhecimento, a duração e internalização de pilhas apoptotic. Neste documento, apresentamos um protocolo de microscopia de fluorescência para a quantificação dos efferocytosis e a atividade das vias de sinalização de efferocytic.

Quantificação de Efferocytosis por microscopia de fluorescência de célula única

Excitabilidade neuronal pode ser modulada através de um processo dinâmico de endo e exocitose de geleificação excitatório glutamato receptores. Aqui descrito é um ensaio acessível, alto teor para quantificação de receptores de superfície e interno população piscinas.

Um ensaio de alto teor para monitoramento Leandro tráfico de Receptor

O transporte endocítico e retrógrado de proteínas da membrana plasmática para a rede trans-Golgi é essencial para manter a homeostase da membrana e regular a sinalização. Aqui, descrevemos um método para obter imagens e quantificar o transporte endocítico de proteínas de carga transmembrana por microscopia de células vivas usando nanocorpos anti-GFP derivatizados em células HeLa.

Imagem de células vivas do transporte endocítico usando nanocorpos funcionalizados em células cultivadas

Aprenda a analisar endossomos de reciclagem em melanócitos de pele usando microscopia de imunofluorescência com GFP-STX13. Este método revela dinâmicas organelares cruciais para a biogênese de melanossomos e compreensão de distúrbios de pigmentação.

O ensaio baseado em microscopia para estudar e analisar os endossomos de reciclagem usando o tráfico de SNARE

Explorar mais vídeos