Ensaios de imunocitoquímica de células 3D vivas de glioma difuso da linha média pediátrica

O glioma difuso da linha média é um tumor cerebral altamente invasivo. Este método ajuda a estudar em tempo real como as células DMG migram e invadem em um contexto 3D com insights específicos sobre o papel potencial de uma molécula chave de adesão. Usando um reagente de marcação e um anticorpo específico anti-CD44, podemos estudar por imagem de células vivas a expressão de CD44 na membrana plasmática nas células DMG também na migração e invasão 3D.

A aplicação desta técnica evidenciou o potencial papel do CD44 na motilidade dessas células, sugerindo que poderia representar um alvo molecular valioso e invasivo. Para começar, reidrateie o ALR adicionando 100 microlitros de água estéril e misture a solução por pipetagem. Misture o anticorpo com o ALR no meio TSM em uma placa de fundo redondo de vários poços ou em um tubo âmbar e proteja-o da luz.

Preparar quantidade suficiente do meio para dispensar 25 microlitros por poço a três vezes a concentração final do ensaio e, em seguida, incubar à temperatura ambiente por 15 minutos. Diluir a BSR no meio TSM na concentração de 1,5 milimolar para obter uma concentração final de 0,5 milimolar no final do ensaio. Em seguida, remova suave e lentamente 75 microlitros do meio de cada poço, evitando tocar o fundo do poço onde o SN se encontra e verificando visualmente a presença do SN.

Adicione suavemente 25 microlitros do complexo de anticorpos BSR e ALR a cada poço e deixe o complexo de anticorpos ALR misturar-se com o meio durante dois a três minutos. Usando um microscópio invertido, certifique-se de que cada NS esteja localizado centralmente na parte inferior do poço. Evite a formação de bolhas, removendo-as usando uma agulha.

Coloque a placa no gelo por cinco minutos para deixar o fundo da placa esfriar. Dispensar 75 microlitros de BMM por poço colocando uma ponta P200 pré-resfriada na parede interna do poço, evitando a formação de bolhas e tocando o fundo do poço. Deixe o prato no gelo por cinco minutos para deixar o BMM misturar com o meio.

Usando um microscópio invertido, verifique a localização da SN. E se não estiver presente centralmente, centrifugar a placa a quatro graus Celsius a 180 vezes G por cinco minutos. Em seguida, transfira a placa no instrumento de análise de células vivas colocado dentro da incubadora ajustada a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 95% de umidade. Uma vez que os poços são revestidos com BMM, corte uma ponta P200.

Pegue 50 microlitros do meio celular e NS de cada poço selecionado e transfira-o para um poço de fundo plano revestido. Verifique visualmente a presença e a posição do SN em cada poço. Adicione suavemente 50 microlitros do anticorpo BSR e ALR diluídos a cada poço, aguardando dois a três minutos para deixar os reagentes se misturarem.

E usando um microscópio invertido, certifique-se de que a maioria dos NS replicados estejam localizados centralmente no poço. Depois de garantir a ausência de qualquer bolha, transfira suavemente a placa no instrumento de análise de células vivas, conforme demonstrado anteriormente. No software de instrumento de análise de células vivas, selecione a opção agendamento para aquisição, clique na guia de adição e selecione digitalizar no cronograma para digitalizar as placas com intervalos conforme mencionado no manuscrito do texto.

Na janela do software, crie ou restaure o vaso e clique na opção Novo. Selecione o tipo de varredura esferoide, fase mais campo brilhante, canais de imagem verde para o ensaio de invasão e objetivo 4X. Selecione varredura de clonagem de diluição, tipo objetivo 4X e fase e verde para o ensaio de migração.

Selecione o tipo de placa e defina os poços a serem escaneados, destacando-os no mapa da placa e, em seguida, configure a frequência de varredura. Clique em Adicionar à programação e inicie a verificação. Selecione a guia Criar Nova Definição de Análise.

Em seguida, selecione invasão esferoide ou aplicativo analisador básico para invasão e migração, respectivamente, na guia. Selecione os canais de invasão e migração apropriados no canal de imagem. Selecione algumas imagens representativas de três a quatro poços para visualizar e refinar a configuração de análise.

Para o ensaio de invasão, na aba definição da análise, ajuste as configurações da aplicação nos canais de campo claro e verde com as configurações mencionadas no manuscrito do texto para gerar uma segmentação precisa entre as células esferoides e invasoras. Para o ensaio de migração, ajuste as configurações da aplicação conforme mencionado no texto manuscrito na fase e canais verdes para gerar uma segmentação precisa entre a confluência e as células verdes. Verifique se as configurações de análise estão corretas para o SN clicando aleatoriamente em vários poços.

Selecione os poços e os pontos de tempo a serem analisados. Salve a definição da análise e clique em Concluir. As imagens confocais de imunofluorescência representativas da expressão de CD44 em células primárias derivadas de pacientes com DMG demonstraram o papel do CD44 na migração e invasão celular.

A imunoquímica de células 3D ao vivo permite visualizar a expressão de CD44. Os quadros representativos do lapso de tempo tanto para migração quanto para invasão mostram a presença e ausência do sinal verde fluorescente na mesma célula observado ao longo do tempo, sugerindo que a expressão de CD44 está ligada e desligada enquanto as células estão migrando e invadindo. Os processos de migração e invasão são acompanhados ao longo de 96 horas, mostrando células QCTB-R059 com alto nível de CD44.

A quantificação da expressão de CD44 e seu aumento ao longo do tempo foi medida pelo sinal de fluorescência verde global associado à ALR tanto para migração quanto para invasão. Quando o anticorpo anti-CD44 é usado em células vivas, afeta a morfologia celular, induzindo uma transição da invasão mesenquimal para ameboide e uma redução da capacidade invasiva e migratória dessas células. A etapa mais crítica do método é a mistura do reagente de marcação com um anticorpo, a adição da mistura ao Matrigel e do meio e o acesso ao instrumento de imagem de células vivas.

Este método pode ser implementado pelo uso de dois ou mais reagentes de marcação distintos e anticorpos para investigar a interação celular DMG mediada por células diretas e contato. Nosso método oferece novas ferramentas para investigar em 3D os mecanismos celulares e moleculares de migração e invasão de DMG, fornecendo novas direções para inibir seu fenótipo infiltrativo.