Aplicação do movimento passivo da cabeça para gerar acelerações definidas nas cabeças dos roedores
21 de julho de 2022
O presente protocolo descreve um sistema personalizado de "movimento passivo da cabeça", que reproduz acelerações mecânicas nas cabeças dos roedores geradas durante a corrida em esteira a velocidades moderadas. Permite dissecar fatores/elementos mecânicos dos efeitos benéficos do exercício físico.
Nosso protocolo ajuda a responder às perguntas de como o exercício físico suporta a homeostase do organismo. Os sistemas nos permitiram dissecar efeitos mecânicos diretos no cérebro a partir de consequências complexas de atividades físicas, como caminhar e correr. Para começar, fixe o acelerômetro no topo da cabeça de um rato usando fita cirúrgica.
Após a recuperação completa da anestesia, coloque o rato na máquina da esteira. Ajuste a esteira para uma velocidade moderada a 20 metros por minuto. Use o software aplicativo para medir a magnitude das acelerações verticais ao longo dos eixos X, Y e Z quando o rato estiver executando a esteira.
Corresponder os valores obtidos a partir do software com a magnitude em frequência de aceleração vertical no sistema PHM. Predefina a amplitude de oscilação da plataforma e a velocidade de rotação do cames em forma de hélice. Em seguida, coloque o mouse em uma posição prona com a cabeça localizada no oscilável e o resto do corpo nas plataformas estáticas.
Ligue o motor para oscilar a plataforma verticalmente e aplique PHM no mouse. Na caixa de plástico transparente, configure a câmera de vídeo a uma taxa de quadros de 24 FPS para gravar todo o espaço. Em seguida, administrar por via intraperitoneal cinco hidroxitriptofano a um rato.
Coloque o mouse na gaiola transparente e comece a gravar por 30 minutos. Revise o vídeo gravado a uma velocidade de 0,5x e conte a cabeça se contorcendo manualmente. Recupere as criosecções do cérebro do rato a partir da caixa de diapositivos.
Deixe as lâminas em toalhetes limpos à temperatura ambiente até que as amostras desidratem completamente. Use uma caneta bloqueadora de líquido para desenhar um círculo ao redor do tecido criosseccionado. Em seguida, adicione a solução TBS-T.
Na parte inferior de uma bandeja, coloque lenços umedecidos para criar um ambiente úmido para os slides. Após uma permeablização com TBS-T, adicionar soro de burro a 4% para bloqueio e incubar à temperatura ambiente por uma hora. Enxaguar as lâminas uma vez por imersão em TBS-T por cinco minutos.
Em seguida, aplique 100 microlitros de anticorpo primário adequadamente diluído e mistura de dappy em cada lâmina. Cubra a bandeja e incube à temperatura ambiente durante a noite. Após a incubação, enxaguar com TBS-T três vezes por cinco minutos cada.
Aplicar 100 microlitros de espécies adequadamente diluídas em combinação com o anticorpo secundário fluorescente e incubar à temperatura ambiente durante uma hora. Pós-lave com TBS-T três vezes por cinco minutos cada, monte as lâminas com meio de montagem e cubra as lâminas com deslizamentos de cobertura. Após a montagem, veja a amostra sob um microscópio de fluorescência.
O sistema PHM foi ajustado para produzir picos de aceleração vertical de aproximadamente 1,0 vezes G, o que foi equivalente aos das cabeças dos ratos durante a corrida em esteira. A aplicação de PHM em camundongos atenuou significativamente sua resposta de contração da cabeça em comparação com os camundongos de controle que representam um efeito supressor do PHM na sinalização do receptor 5-HT2A nos neurônios do córtex pré-frontal. A corrida em esteira em PHM aumentou significativamente a internalização do receptor 5-HT2A e os neurônios do córtex pré-frontal do rato.
A quantificação de áreas positivas para o receptor 5-HT2A internalizado e associado à membrana em relação à área nova e positiva confirmou essa observação. A imunocoloração e quantificação da expressão de c-Fos em neurônios positivos para o receptor 5-HT2A mostraram que a corrida em esteira em PHM regulou negativamente a expressão de 5-HTP induziu c-Fos. Este é o evento celular a jusante da ativação do receptor 5-HT2A e dos neurônios PFC do rato.
A intervenção mecânica pode ser aplicada a outras partes do corpo além da cabeça para investigar os aspectos mecânicos dos efeitos do exercício.
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Visão Geral
Este estudo investiga como o exercício físico, especificamente a corrida em esteira, influencia a homeostase do organismo por meio de um sistema recém-desenvolvido de movimento passivo da cabeça (PHM). Ao simular as acelerações mecânicas experimentadas por ratos, o protocolo isola efetivamente os fatores mecânicos e seus efeitos específicos na função cerebral.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Exercício físico e homeostase
- Neurociência da mecanotransdução
- Impacto de fatores mecânicos nas vias de sinalização cerebral
Contexto
- O papel da atividade física na regulação fisiológica
- Impactos mecânicos nas respostas neuronais
- Importância de compreender a resposta do cérebro ao exercício
Métodos Utilizados
- Sistema passivo de movimento da cabeça (PHM) personalizado
- Roedores (ratos e camundongos) como modelos biológicos
- Coloração fluorescente e imuno-histoquímica para análise cerebral
Resultados Principais
- PHM atenuou significativamente as respostas de movimento brusco da cabeça em camundongos
- Internaização aumentada de receptores 5-HT2A em neurônios do córtex pré-frontal
- Regulação negativa da expressão de c-Fos após intervenção mecânica
Conclusões
- O estudo demonstra um método válido para examinar as influências mecânicas sobre o cérebro.
- Os achados contribuem para uma compreensão mais profunda da fisiologia do exercício e da sinalização neuronal.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Dissecar os efeitos mecânicos diretos do exercício na sinalização cerebral é essencial para reduzir os riscos associados a alvos neurobiológicos e esclarecer hipóteses mecanicistas na fase inicial de descoberta. O sistema de movimento passivo da cabeça (PHM) permite a aplicação controlada e reprodutível de acelerações mecânicas definidas nas cabeças de roedores, reforçando a confiança preditiva em estudos de mecanotransdução. Essa capacidade contribui para a validação de alvos e a continuidade translacional em programas terapêuticos relacionados a transtornos neuropsiquiátricos e ao exercício físico.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação de vias de mecanotransdução implicadas na homeostase cerebral induzida pelo exercício.
- Apóia a validação funcional da sinalização do receptor de serotonina em populações neuronais definidas.
- Facilita a desvinculação mecanicista dos efeitos mecânicos dos efeitos sistêmicos do exercício.
- Fornece parâmetros quantitativos para ativação de vias e internalização de receptores.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prepara modelos de roedores validados para triagem neurofarmacológica subsequente.
- Padroniza parâmetros de estimulação mecânica para o desenvolvimento reprodutível de ensaios.
- Gera saídas quantitativas, como perfis de aceleração da cabeça e métricas de localização de receptores.
- Permite avaliação confiável dos efeitos de compostos sobre vias mecanossensíveis.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha modelos pré-clínicos a estímulos mecânicos relevantes para a doença observados no exercício humano.
- Apoia a continuidade do descobrimento mecanicista à validação pré-clínica orientada por biomarcadores.
- Informa o avanço ajustado ao risco de candidatos neuropsiquiátricos e miméticos do exercício.
- Oferece uma plataforma para avaliação de biomarcadores translacionais de mecanotransdução.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O sistema PHM se integra ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir testes baseados em hipóteses de sinalização mecânica em modelos de roedores, apoiando tanto a validação de alvos quanto o desenvolvimento de biomarcadores translacionais.
- Biologia da Descoberta: Apoia testes de hipótese nula para a ativação mecânica de vias de sinalização cerebral.
- Triagem: Fornece estimulação mecânica quantitativa e reprodutível para padronização de ensaios.
- Análises: Fornece saídas mensuráveis, como perfis de aceleração, internalização de receptores e expressão de c-Fos.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas mecanicistas a modelos pré-clínicos relevantes para pesquisa de exercício e neuropsiquiatria.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma reutilizável para diversos estudos de mecanotransdução e neurobiologia.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva em hipóteses mecanicistas e na validação de alvos.
- Valor Operacional: Permite protocolos padronizados, escaláveis e reprodutíveis de estimulação mecânica.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou não prosseguir ao esclarecer os efeitos mecânicos diretos sobre alvos cerebrais.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de programas neuropsiquiátricos e miméticos do exercício.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em manejo de roedores, neurobiologia e imagem quantitativa.
- Exige instrumentação para estimulação mecânica controlada e microscopia de fluorescência de alta resolução.
- Exige padronização entre equipes dos parâmetros de estimulação e dos pontos finais analíticos.
- A adaptação entre espécies de roedores e paradigmas de exercício pode exigir otimização do protocolo.
- A intervenção mecânica é limitada a regiões corporais acessíveis e pode não recapitular completamente os efeitos sistêmicos do exercício.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:35
Measurement of Magnitudes of Accelerations and Adjustment of the PHM System
1:33
Quantification of Mouse Head-Twitch Response
2:03
Immunohistochemical Analysis of Prefrontal Cortex (PFC) Collected from Euthanized Mouse Brain
3:22
Results: Effect of Treadmill Running and PHM Application in Mouse PFC Neurons
4:37
Conclusion
