Transplante intracerebral e rastreamento de bioluminescência in vivo de células progenitoras neurais humanas no cérebro do camundongo
27 de janeiro de 2022
Descrevemos o transplante intraparenquimal de células progenitoras neurais transduzidas com um vetor de repórter duplo expressando proteína fluorescente verde-luciferase (GFP) no cérebro do camundongo. Após o transplante, o sinal de luciferase é repetidamente medido usando bioluminescência in vivo e células enxertadas expressas por GFP identificadas em seções cerebrais usando microscopia de fluorescência.
A terapia baseada em células tem um enorme potencial para a regeneração cerebral. O protocolo que demonstramos aqui é valioso, pois permite imagens longitudinais in vivo de células transplantadas no cérebro do camundongo. Este protocolo é especialmente útil para obter insights sobre a migração e a sobrevivência do enxerto no mesmo animal durante um período de tempo.
Este procedimento pode ser aplicado a qualquer linha celular que expresse a luciferase transplantada no cérebro do camundongo. No entanto, a força do sinal pode variar dependendo da profundidade do transplante ou da expressão da luciferase na respectiva linha celular. Demonstrando o procedimento estará Rebecca Weber, uma excelente doutoranda em nosso laboratório.
Comece coletando um frasco de células a partir de menos 150 graus Celsius de armazenamento e transfira-o para o laboratório. Transfira rapidamente o frasco para um banho de água temperado a 37 graus Celsius por dois a três minutos até que os cristais de gelo se dissolvam. Em seguida, transfira o frasco para o armário de biossegurança e pipeta todo o conteúdo em um tubo cônico estéril de 15 mililitros.
Adicione nove mililitros de PBS estéreis e centrífuga a 300 G por cinco minutos à temperatura ambiente. Remova o supernatante por aspiração sem perturbar a pelota e conte as células antes do giro final usando um contador celular automatizado. Transporte o animal da câmara de indução para o quadro estereotaxic, mantendo anestesia usando uma máscara facial.
Aplique lubrificante oftálmico para evitar que os olhos sequem. Raspe o couro cabeludo do rato com uma navalha elétrica e desinfete a pele com solução de 5% betadina usando cotonetes de algodão. Fixar a cabeça do mouse e inserir as barras de ouvido no meatus externo.
Faça um buraco com um diâmetro de dois a três milímetros através do crânio com uma broca dentária cirúrgica. Resuspenque as células preparadas no tubo e desenhe dois microliters de suspensão celular em uma seringa. Coloque a seringa acima do local alvo e mova lentamente a agulha para a superfície da dura e calcule as coordenadas de profundidade.
Clique duas vezes no ícone do software Living Image e selecione um ID do usuário na lista suspensa. Em seguida, clique em Inicializar no Painel de Controle que aparece. No software Living Image, verifique as caixas Luminescent e Photograph no Painel de Controle e selecione exposição automática.
Selecione um campo de visão. Digite a altura do assunto e selecione a opção de foco de altura do assunto de uso. Defina manualmente os parâmetros de filtragem, incluindo binning grande, F/Stop, filtro de excitação bloqueado e filtro de emissão aberto.
Injete a luciferina intraperitonealmente, e após cinco minutos, anestesia os animais com um suprimento contínuo de isoflurane. Raspe os animais sedados na região da cabeça usando um barbeador convencional de cabelo. Coloque o animal na câmara de imagem e comece a fotografar 15 minutos após a injeção de luciferina clicando em Adquirir no Painel de Controle.
Antes de transplantar células progenitoras neurais no cérebro do camundongo, as células foram testadas para transdução bem sucedida por expressão de EGFP in vitro. O transplante bem sucedido foi confirmado pela presença do sinal de luciferase firefly vermelho. Após o transplante de 6.000 a 180.000 células no córtex motor sensorial certo do camundongo, o sinal de bioluminescência foi detectável em todas as concentrações.
As células sobreviveram por pelo menos cinco semanas após o transplante. As células transplantadas foram detectadas com sucesso ex vivo em uma análise histológica subsequente através do repórter EGFP e imunostaining com núcleos anti-humanos. É muito importante calcular cuidadosamente as coordenadas de injeção para evitar perder o local alvo.
E também, deixe a seringa no lugar por pelo menos cinco minutos após o transplante para evitar qualquer refluxo. Após a imagem bioluminescente in vivo, o tecido cerebral pode ser preparado para análise histológica, ou as células transplantadas podem ser isoladas usando FACS e caracterizadas com tecnologias diferentes ou mistas. No geral, essa técnica fornece um rastreamento quantitativo e contínuo de células transplantadas no cérebro, e pode ser aplicada a um grande número de doenças neurológicas, incluindo derrame e lesão cerebral traumática.
Visão Geral
Este estudo demonstra o transplante intraparenquimatoso de células progenitoras neurais humanas no cérebro de camundongo, utilizando um vetor duplo repórter que expressa luciferase e proteína verde fluorescente (GFP). A metodologia permite a imagem longitudinal in vivo das células transplantadas, fornecendo informações sobre sua migração e sobrevivência ao longo do tempo.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Terapia baseada em células
- Regeneração neural
- Imagem in vivo
Antecedentes
- As terapias baseadas em células são promissoras para a regeneração cerebral.
- A imagem longitudinal permite o acompanhamento de células enxertadas.
- Esta técnica é aplicável a diversas linhagens celulares que expressam luciferase.
- A variabilidade da intensidade do sinal depende da profundidade do transplante e da expressão de luciferase.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo para rastrear células progenitoras neurais transplantadas.
- Obter informações sobre a migração celular e a sobrevivência ao longo de períodos prolongados.
- Fornecer uma ferramenta para o estudo de doenças neurológicas.
Métodos Utilizados
- Utilizou imagens in vivo com microscopia de bioluminescência e fluorescência.
- Transplantou células progenitoras neurais humanas no cérebro de camundongos.
- As células foram testadas quanto à transdução bem-sucedida in vitro antes do transplante.
- O protocolo cirúrgico detalhado incluiu anestesia, perfuração do crânio e injeção de células.
- Os sinais de bioluminescência foram medidos após o transplante para rastreamento.
Resultados Principais
- A transplante bem-sucedido de células progenitoras neurais foi confirmado por meio de sinais de luciferase e GFP.
- As células mostraram sobrevivência por pelo menos cinco semanas após o transplante.
- Células transduzidas foram identificáveis por meio de análise histológica.
- O rastreamento quantitativo das células transplantadas foi realizado, destacando sua viabilidade.
Conclusões
- O procedimento permite o rastreamento contínuo de células progenitoras neurais in vivo.
- Este protocolo é aplicável a diversos modelos de doenças neurológicas.
- Os conhecimentos obtidos neste estudo poderiam aprimorar a compreensão dos mecanismos de regeneração cerebral.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O rastreamento longitudinal de células transplantadas aborda uma lacuna crítica no desenvolvimento de terapias neuro-regenerativas, permitindo a avaliação quantitativa da sobrevivência e migração do enxerto ao longo do tempo. Essa capacidade apoia a desmistificação mecanicista em modelos pré-clínicos, fornecendo leituras contínuas e não terminais que aumentam a confiança na validação de alvos. O método aprimora a continuidade translacional desde a fase de descoberta até as etapas pré-clínicas em programas para doenças neurológicas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio do rastreamento da enxertia funcional e da persistência de células progenitoras neurais humanas in vivo.
- Valor Operacional: Oferece uma plataforma padronizada para avaliar intervenções baseadas em células em diversos modelos de doenças neurológicas.
- Valor Preditivo: Apoia decisões de continuidade ou interrupção por meio de dados quantitativos de sobrevivência coletados em intervalos definidos (dias 0, 3, 14, 21, 35).
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera leituras reprodutíveis de bioluminescência com limite de detecção de 6.000 células, permitindo a avaliação da resposta à dose da viabilidade de células transplantadas.
- Valor Operacional: Estabelece um ensaio de imagem quantitativo compatível com linhagens celulares que expressam luciferase, para fluxos de trabalho escalonáveis de triagem.
- Prontidão do Ensaio: Facilita a preparação de sistemas biológicos validados para caracterização posterior por meio de histologia e imunofluorescência.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Relaciona resultados de imagem in vivo com validação ex vivo mediante confirmação histológica de células enxertadas utilizando GFP e marcação com anti-núcleos humanos.
- Continuidade Translacional: Apoia decisões de avanço com ajuste de risco ao demonstrar a sobrevivência das células por pelo menos cinco semanas após o transplante.
- Relevância para Modelos de Doença: Aplicável a condições neurológicas como acidente vascular cerebral e lesão cerebral traumática, nas quais a migração e o enxerto celular são pontos finais mecanicistas fundamentais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao continuum de descoberta ao permitir o monitoramento não invasivo desde o enxerto inicial até a sobrevivência de longo prazo, fornecendo informações para as etapas de identificação de compostos promissores e validação pré-clínica.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre a dinâmica de migração e sobrevivência celular no cérebro de camundongo ao longo de um período de cinco semanas.
- Triagem: Fornece sinais padronizados e quantitativos de bioluminescência que permitem a comparação de condições de transplante e doses celulares (6.000 a 180.000 células).
- Análise: Oferece dados de imagem longitudinal em pontos temporais definidos, possibilitando a análise estatística da persistência do enxerto e sua distribuição espacial.
- Pesquisa Translacional: Conecta o rastreamento in vivo à validação histológica, criando um fluxo contínuo de dados desde a imagem em vida até a caracterização final.
- Reutilização Empresarial: Funciona como uma plataforma reutilizável para avaliar diversas linhagens celulares expressando luciferase na pesquisa de neuroregeneração.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva em candidatos à terapia celular ao reduzir a dependência de medições apenas no ponto final e permitir uma compreensão mecanicista do comportamento do enxerto.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de coordenadas estereotáxicas, dosagem padronizada de luciferina e parâmetros de imagem controlados (exposição automática, agrupamento e configurações de filtro).
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao identificar enxertos não viáveis precocemente, reduzindo investimentos em preparações celulares ineficazes.
- Impacto na Carteira: Permite a priorização baseada em risco de linhagens celulares com base em perfis demonstrados de sobrevivência e migração in vivo.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em cirurgia estereotáxica, manipulação asséptica de células e operação de sistema de imagem in vivo (software Living Image).
- Depende de instrumentação para imagem de bioluminescência com filtros de excitação/emissão configuráveis, controle de F/Stop e binning.
- Necessita padronização entre equipes quanto às coordenadas de injeção, ao tempo de administração da luciferina (5 min antes da aquisição de imagem) e aos protocolos de anestesia.
- A adaptação entre modelos exige validação da intensidade do sinal em relação à profundidade do transplante e aos níveis de expressão da luciferase na linhagem celular.
- Limitação prática: A detecção do sinal é limitada por um limite de resolução de 6.000 células, o que pode afetar a sensibilidade em condições de baixo enxerto.
