Name: Imagem 3D da Matriz Extracelular Hepática em Modelo de Esteatohepatite Não Alcoólica em Camundongos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Aprenda a visualizar a remodelação da matriz extracelular em modelo de esteatohepatite não alcoólica usando perfusão hepática in situ e microscopia de dois fótons. Este método avançado permite estudar a fibrose hepática em camundongos.

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Agradecemos ao Hyesuk Park pela ajuda técnica. Esta pesquisa foi apoiada pelo financiamento do Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais (NIDDK), NIH (R01 2DK083283, para NJT), o Instituto Nacional de Envelhecimento (NIA), NIH (1R01AG060726, para NJT). Agradecemos a Jon Mulholland e Kitty Lee, do Cell Sciences Imaging Facility do Beckman Center, pela assistência técnica com a imagem de microscopia de dois fótons.

Os experimentos com animais são realizados de acordo com os procedimentos experimentais aprovados pelos comitês institucionais de cuidados e uso de animais (IACUCs) da Universidade de Stanford e do Hospital de Assuntos de Veteranos em Palo Alto. Camundongos C57BL/6J machos de 6-8 semanas de idade foram alimentados com ração ou dieta fast-food suplementada com 4,2% de xarope de milho com alto teor de frutose (ver Tabela de Materiais) em água potável por 14 semanas5. Os camundongos foram mantidos em gaiolas padrão em um ciclo escuro/claro de 12 horas.
1. Preparo cirúrgico e procedimentos de perfusão hepática
<ol><li>Pese o rato antes do procedimento.</li>
	<li>Anestesiar o rato administrando cetamina (90 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) (ver Tabela de Materiais) através de uma injeção intraperitoneal. Certifique-se de que o mouse esteja totalmente anestesiado pelo pinçamento dos dedos dos pés antes de prosseguir para a próxima etapa. NOTA: O isoflurano não é necessário aqui, uma vez que esta é uma cirurgia de não-sobrevivência.</li>
	<li>Raspar a área ventral usando um cortador de cabelo e desinfetar a pele com etanol 70%. Coloque o mouse nas costas e imobilize as pernas na prancha cirúrgica com fita adesiva.</li>
	<li>Depois de reconfirmar a profundidade da anestesia por uma pinça nos dedos, use uma tesoura Mayo e pinça de Adson (ver Tabela de Materiais) para fazer uma incisão de 3 cm lateralmente no abdome inferior e, em seguida, uma incisão de 5 cm verticalmente do abdome baixo até o processo xifoide. Tenha cuidado para não abrir a cavidade torácica.</li>
	<li>Depois de abrir o peritônio, coloque suavemente os intestinos à esquerda do animal e eleve o lobo direito do fígado com um aplicador com ponta de Rayon (ver Tabela de Materiais) para expor a veia porta.</li>
	<li>Cateterizar a veia porta com cateter IV de 24 G. Introduzir o cateter na extremidade distal da veia porta. Coloque a ponta do cateter antes que a veia porta se ramifica para os lobos hepáticos.</li>
	<li>Retire a agulha imediatamente quando o cateter entrar na veia. Verifique se o cateter está corretamente posicionado dentro da veia perfundindo o fígado com PBS usando uma seringa de 1mL através do cateter. NOTA: Após a perfusão PBS, todos os lóbulos devem imediatamente embranquecer. Se o cateter for colocado corretamente, o sangue venoso fluirá rapidamente através do cateter.</li>
	<li>Utilizar micropinça Dumont, suporte para microagulha Castroviejo e sutura 4-0 (ver Tabela de Materiais) para colocar um ponto abaixo da ramificação da veia porta e um segundo ponto 1 cm abaixo para fixar o cateter.</li>
</ol>2. Descelularização tecidual
<ol><li>Conecte o cateter a um tubo de silicone (~1 m de comprimento, 3 mm de diâmetro interno e 4,1 mm de diâmetro externo) com um conector Luer. Conecte a tubulação de silicone a uma bomba peristáltica e a um reservatório contendo água deionizada (consulte a Tabela de Materiais).</li>
	<li>Remova cuidadosamente as bolhas de ar dentro do tubo e evite gerar novas bolhas durante a perfusão. Ajuste a bomba peristáltica em uma saída de fluxo de 0,2 mL/min (ou seja, 288 mL/24 h).</li>
	<li>Perfundir primeiro com água deionizada (~50 mL/rato) durante 2 h. A cor do fígado mudará de vermelho para amarelo durante a perfusão. OBS: O animal expirará após 10 minutos de perfusão.</li>
	<li>Troque a solução de perfusão para desoxicolato de sódio a 0,5% (m/vol) (DOC, ver Tabela de Materiais) e continue durante a noite (18 h, ~250mL/mouse). O fígado ficará esbranquiçado ao final da perfusão (Figura 1).</li>
	<li>Troque a solução de perfusão por água deionizada (~50 mL/mouse) e perfunda por 2 h.</li>
	<li>Use micropinças Dumont e tesouras de micromola (ver Tabela de Materiais) para coletar o fígado decelularizado e lavá-lo cuidadosamente em uma placa de Petri com PBS.</li>
	<li>Corte o tecido decelularizado em pequenos pedaços para aquisição imediata de imagens ou congele a -80 °C para análises bioquímicas adicionais, como espectrometria de massa em tandem, ELISA ou western blot.</li>
</ol>3. Preparo da lâmina para obtenção de imagens (com microscópio multifóton/confocal de fluorescência)
<ol><li>Transfira um pequeno pedaço de fígado decelularizado (<3 x 3 x 3 mm) para uma lâmina de microscópio e coloque o tecido no meio.</li>
	<li>Adicionar 10 μL de meio de montagem antifade (ver Tabela de Materiais) ao tecido com uma pipeta para evitar o ressecamento do tecido.</li>
	<li>Cubra o tecido com um vidro de cobertura e aplique uma pequena força para achatar a amostra. Selar as bordas do vidro da tampa com esmalte incolor e transparente (Figura 2). OBS: Devido à fixação dos dois fótons verticais através do microscópio, um vidro de cobertura foi utilizado na amostra. No entanto, as amostras podem ser colocadas de forma diferente se um microscópio invertido for usado.</li>
</ol>4. Aquisição de imagens
<ol><li>Coloque uma gota de óleo de imersão na parte superior do vidro da tampa e coloque a lâmina no suporte da lâmina do microscópio. Abaixe a objetiva de óleo de 20x até entrar em contato com o óleo de imersão.</li>
	<li>Mude para o canal violeta (405 nm), ligue o obturador e concentre-se na amostra. Navegue e posicione a área de interesse para geração de imagens. Desligue o obturador antes de passar para a aquisição de imagens usando luz laser.</li>
	<li>Mude para o controle do computador e inicie o laser de dois fótons. Ligue primeiro o laser de dois fótons (Figura 3A), depois ligue o controlador de laser de dois fótons (consulte Tabela de Materiais) e o obturador (Figura 3B,C). Certifique-se de que a potência de saída é superior a 2,5 W. Reduza a potência do laser para evitar a têmpera da fluorescência. Selecione e ajuste os detectores (fotomultiplicadores e híbridos) para acomodar os fluoróforos escolhidos. NOTA: Imagens de dois fótons foram realizadas em um comprimento de onda de excitação de 860 nm. Dois canais foram selecionados para imagens de SHG de colágeno e fluorescência excitada de dois fótons (TPEF), respectivamente. Um canal correspondente à faixa de comprimento de onda de 415-445 nm detectou a estrutura detalhada do colágeno a partir de sinais de SHG. Outro canal cobria a faixa de 465-669 nm para coletar sinais TPEF.</li>
	<li>Escolha aquisições de imagens simultâneas ou sequenciais. Ajuste o orifício para o valor mais alto. Ajuste os comprimentos de onda do laser, ganho, potência e deslocamento. Ajuste o tempo de permanência do pixel, o tamanho do pixel, a média e o zoom (Figura 4A).</li>
	<li>Role o z-controller do computador e defina as z-dimensions, defina os pontos de início e fim e escolha o número de imagens fornecidas dentro de um volume (z-stack). Adquirir imagens. NOTA: Aqui, um volume Z de 20 μm e um tamanho de passo Z de 1 μm foram escolhidos (Figura 4B).</li>
</ol>

<ol><li>Friedman, S. L., Pinzani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+fibrosis%3A+2022+unmet+needs+and+a+blueprint+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic fibrosis: 2022 unmet needs and a blueprint for the future.</a> Hepatology. 75 (2), 473-488 (2021).</li>
<li>Ye, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+prevalence%2C+incidence%2C+and+outcomes+of+non-obese+or+lean+non-alcoholic+fatty+liver+disease%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Global prevalence, incidence, and outcomes of non-obese or lean non-alcoholic fatty liver disease: A systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Gastroenterology and Hepatology. 5 (8), 739-752 (2020).</li>
<li>Schwabe, R. F., Tabas, I., Pajvani, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+fibrosis+development+in+non-alcoholic+steatohepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of fibrosis development in non-alcoholic steatohepatitis.</a> Gastroenterology. 158 (7), 1913-1928 (2020).</li>
<li>Arteel, G. E., Naba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+liver+matrisome+-+looking+beyond+collagens%5BTitle%5D)+AND+%22JHEP+Reports%22%5BJournal%5D)">The liver matrisome - looking beyond collagens.</a> JHEP Reports. 2 (4), 100115(2020).</li>
<li>Jiang, J. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonphagocytic+activation+of+NOX2+is+implicated+in+progressive+non-alcoholic+steatohepatitis+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Nonphagocytic activation of NOX2 is implicated in progressive non-alcoholic steatohepatitis during aging.</a> Hepatology. 72 (4), 1204-1218 (2020).</li>
<li>Dehnad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AGER1+downregulation+associates+with+fibrosis+in+non-alcoholic+steatohepatitis+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">AGER1 downregulation associates with fibrosis in non-alcoholic steatohepatitis and type 2 diabetes.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (8), 4320-4330 (2020).</li>
<li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+and+antibody+staining+of+mouse+tissues+to+map+native+extracellular+matrix+structures+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D.</a> Nature Protocols. 14 (12), 3395-3425 (2019).</li>
<li>Mazza, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cirrhotic+human+liver+extracellular+matrix+3D+scaffolds+promote+smad-dependent+tgf-beta1+epithelial+mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Cirrhotic human liver extracellular matrix 3D scaffolds promote smad-dependent tgf-beta1 epithelial mesenchymal transition.</a> Cells. 9 (1), 83(2019).</li>
<li>Klaas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alterations+in+the+extracellular+matrix+composition+guide+the+repair+of+damaged+liver+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The alterations in the extracellular matrix composition guide the repair of damaged liver tissue.</a> Scientific Reports. 6, 27398(2016).</li>
<li>Mattei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanostructure+and+composition+of+highly+reproducible+decellularized+liver+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Mechanostructure and composition of highly reproducible decellularized liver matrices.</a> Acta Biomaterialia. 10 (2), 875-882 (2014).</li>
<li>Ren, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+two+decellularization+methods+in+the+development+of+a+whole-organ+decellularized+rat+liver+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+International%22%5BJournal%5D)">Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold.</a> Liver International. 33 (3), 448-458 (2013).</li>
<li>Piersma, B., Hayward, M. K., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrosis+and+cancer%3A+A+strained+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Reviews+on+Cancer%22%5BJournal%5D)">Fibrosis and cancer: A strained relationship.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1873 (2), 188356(2020).</li>
<li>Cox, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+matrix+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The matrix in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 21 (4), 217-238 (2021).</li>
<li>Mirdamadi, E. S., Kalhori, D., Zakeri, N., Azarpira, N., Solati-Hashjin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+tissue+engineering+as+an+emerging+alternative+for+liver+disease+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Liver tissue engineering as an emerging alternative for liver disease treatment.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (2), 145-163 (2020).</li>
<li>Mazza, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+human+liver+as+a+natural+3D-scaffold+for+liver+bioengineering+and+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Decellularized human liver as a natural 3D-scaffold for liver bioengineering and transplantation.</a> Scientific Reports. 5, 13079(2015).</li>
<li>Jia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+culture+system+for+liver+tissue+mimicking+hepatic+plates+for+improvement+of+human+hepatocyte+%28C3A%29+function+and+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">3D culture system for liver tissue mimicking hepatic plates for improvement of human hepatocyte (C3A) function and polarity.</a> BioMed Research International. 2020, 6354183(2020).</li>
<li>Shimoda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+liver+scaffolds+promote+liver+regeneration+after+partial+hepatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Decellularized liver scaffolds promote liver regeneration after partial hepatectomy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12543(2019).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse referentes a este artigo.

O presente protocolo mostra que a decelularização através de uma perfusão in situ de COD de baixa taxa de fluxo preserva as estruturas frangíveis de colágeno fibrilar triplo-helicoidal e nativo, fornecendo uma plataforma confiável e econômica para capturar o remodelamento dinâmico da MEC na fibrose hepática da EHNA. Embora a descelularização tenha sido realizada em fígados normais e fibróticos antes da identificação dos componentes da MEC ou da geração de scaffolds biológicos para cultura celular, a dinâmica do ...

A doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) é a doença hepática mais comum, afetando 20%-25% da população adulta. 25% dos pacientes com DHGNA evoluem para esteato-hepatite não alcoólica (EHNA), onde o risco de cirrose, insuficiência hepática e carcinoma hepatocelular aumenta1. Nos próximos 20 anos, estima-se que a EHNA será responsável por 2 milhões de mortes relacionadas ao fígado nos EUA2. Como não existem tratamentos aprovados, há uma necessidade urgente de decifrar os mecanismos que causam fibrose hepática em pacientes com EHNA e desenvolver tratamento direcionado3.
A matriz extracelular (MEC) é um microambiente dinâmico e complexo que exerce comunicação bidirecional com as células para regular a homeostasetecidual4. A MEC hepática é composta por elementos estruturais como proteoglicanos, colágenos, fibronectina, elastina e outras proteínas não estruturais (por exemplo, olfactomedina e trombospondina) para fornecer suporte físico e estrutural4.
A fibrose hepática é uma resposta crônica da cicatrização de feridas ao dano hepático de várias etiologias, incluindo a EHNA3. Resulta de um desequilíbrio no processo dinâmico de remodelamento da matriz da MEC e é caracterizada pelo excesso de proteínas estruturais no fígado lesado4. A fibrogênese depende da comunicação dinâmica célula-célula entre diferentes tipos de células hepáticas. As células estreladas hepáticas (CTHs), quando ativadas, diferenciam-se em células do músculo liso alfa 2 que expressam, migram e proliferam miofibroblastos como células e sintetizam proteínas da MEC como uma ação de fechamento da ferida. As CTHs ativadas são as células centrais produtoras de colágeno no fígado1.
O mecanismo molecular do remodelamento da MEC, os padrões de fibrose e sua relação com eventos celulares não estão claros. Um melhor entendimento da estrutura tridimensional (3D) da MEC ainda é necessário, embora técnicas de espectrometria de massa tenham ajudado a analisar a composição proteica da MEC4. Tradicionalmente, a coloração tricrômico de Masson, as colorações Picro Sirius Red e a imagem de segunda geração harmônica (SHG) têm sido realizadas em cortes bidimensionais (2D) finos do fígado. O padrão típico de fibrose da EHNA é denominado "fio de galinha", que se estende até a zona 3 e é fibrose perissinusoidal/pericelular5,6. No entanto, há uma carência de estudos enfocando a estrutura 3D do fígado nativo, particularmente aqueles que não envolvem secção tecidual. Abordagens de imagem robustas para identificar padrões e características da fibrose ao longo do remodelamento dinâmico da MEC na fibrose hepática fortaleceriam significativamente a compreensão dos mecanismos da EHNA e identificariam novos alvos terapêuticos.
Para enfrentar esses desafios, um protocolo rápido e eficiente foi otimizado para obtenção de imagens da MEC hepática nativa via decelularização7. A descelularização do fígado total é uma abordagem para remover o conteúdo celular hepático enquanto mantém a rede nativa de MEC 3D através da perfusão em detergente. Os camundongos foram alimentados com ração ou dieta fast-food (FFD) por 14 semanas. A decelularização foi realizada após perfusão in situ da veia porta com detergente neutro e baixo fluxo, para preservar estruturas de colágeno fibrilar triplo-helicoidal e nativo. A microscopia de dois fótons foi aplicada para analisar as alterações nas estruturas do colágeno na MEC. As imagens 3D da estrutura da MEC nativa em fígados normais e NASH foram reconstituídas e analisadas. A realização da decelularização da perfusão in situ e a análise do arcabouço por microscopia de dois fótons fornecem uma plataforma prática e acessível para visualizar o remodelamento dinâmico da MEC no fígado.

<table><tbody><tr><td>4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18" P-3</td><td>MONOCRYL</td><td>Y494G</td><td></td></tr><tr><td>4-0 sutura</td><td>fisher scientific</td><td>10-000-649</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true</td></tr><tr><td>AnaSed Injection (xilazina)</td><td>AnaSed</td><td>NDC 59399-110-20</td><td>este medicamento para uso por ou por ordem de um veterinário licenciado.</td></tr><tr><td>BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATETER COM TECNOLOGIA BC</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr> 382612 <tr><td>Chow diet</td><td>Envigo</td><td># 2918</td><td>Dieta de controle. Uma fórmula fixa, dieta não autoclavável fabricada com ingredientes de alta qualidade e projetada para apoiar a gestação, lactação e crescimento de roedores.</td></tr><tr><td>Dieta de fast-food (AIN76A Dieta Ocidental)</td> <td>Teste</td><td>de Dieta 1810060</td><td>https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf</td></tr><tr><td>Kit de Coloração de Hematoxilina e Eosina</td><td>vectorlabs</td><td>H-3502</td><td>https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html</td></tr><tr><td>Kent Scientific Kit Cirúrgico de Rato</td><td>fisher scientific</td><td>13-005-205</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit</td></tr><tr><td>INJEÇÃO DE CLORIDRATO DE CETAMINA</td><td>Vedco</td><td>NDC 50989-996-06 - frasco de 10 mL.</td><td>KetaVed foi clinicamente estudado em primatas subumanos, além das espécies listadas em Administração e Dosagem.</td></tr><tr><td>Leica SP5 vertical Confocal, multifóton</td><td>Conector Leica</td><td>SP5</td><td></td></tr><tr><td>Luer (torneira de três vias com SPIN-LOCK&reg;)</td><td>bbraun</td><td>D300</td><td>https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html</td></tr><tr><td>Kit de Mancha Vermelha Picrosirius</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>24901</td><td>https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771</td></tr><tr><td>aplicador com ponta de rayon</td><td>puritano</td><td>25-806 1PR</td><td></td></tr><tr><td>Desoxicolato de sódio</td><td>sigmaaldrich</td><td>D6750-100G</td><td></td></tr><tr><td>Xarope</td><td>www.target.com</td><td>24 fl oz</td><td>https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801</td></tr><tr><td>Bomba Peristáltica de Velocidade Variável</td><td>INTLLAB</td><td>BT100</td><td>https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Meio de Montagem Antifade</td><td>vectorlabs</td><td>H-1000-10</td><td>https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html</td></tr></tbody></table>

imagem 3d da matriz extracelular hepática em modelo de esteatohepatite não alcoólica em camundongos

3D Imaging of the Liver Extracellular Matrix in a Mouse Model of Non-Alcoholic Steatohepatitis

A esteatohepatite não alcoólica (EHNA) é a doença hepática crônica mais comum nos Estados Unidos, afetando mais de 70 milhões de americanos. A EHNA pode evoluir para fibrose e, eventualmente, para cirrose, um importante fator de risco para carcinoma hepatocelular. A matriz extracelular (MEC) fornece suporte estrutural e mantém a homeostase hepática via sinais matricelulares. A fibrose hepática resulta de um desequilíbrio no processo de remodelamento dinâmico da MEC e é caracterizada pelo acúmulo excessivo de elementos estruturais e alterações associadas nos glicosaminoglicanos. O padrão típico de fibrose da EHNA é chamado de "fio de galinha", que geralmente consiste em fibrose perissinusoidal/pericelular da zona 3, com base nas características observadas pela coloração tricrômico de Masson e pelo vermelho de Picrosirius. No entanto, essas técnicas tradicionais de imagem em lâminas de tecido fino bidimensional (2D) não podem demonstrar as alterações estruturais detalhadas da MEC tridimensional (3D), limitando a compreensão do remodelamento dinâmico da MEC na fibrose hepática.
O trabalho atual otimizou um protocolo rápido e eficiente para obter imagens da estrutura nativa da MEC no fígado via decelularização para enfrentar os desafios acima. Os camundongos foram alimentados com ração ou dieta fast-food por 14 semanas. A descelularização foi realizada após perfusão in situ da veia porta, e as técnicas de microscopia de dois fótons foram aplicadas para imagear e analisar as alterações na MEC nativa. As imagens 3D dos fígados normal e NASH foram reconstituídas e analisadas. A realização da decelularização in situ da perfusão e a análise do arcabouço por microscopia de dois fótons forneceram uma plataforma prática e confiável para visualizar o remodelamento dinâmico da MEC no fígado.

As fibras colágenas foram detectadas com segunda geração harmônica e microscopia de dois fótons. O sinal é proveniente das estruturas frangíveis de colágeno fibrilar triplo-helicoidal e nativo. Não foram utilizados anticorpos específicos para analisar os subtipos de colágeno; no entanto, isso poderia ser adicionado à técnica de imagem.
Quando o tecido hepático é estudado sem descelularização, é difícil obter imagens de alta resolução da rede de colágeno (Figura 5A<...

O presente protocolo otimiza os métodos de perfusão/decelularização hepática in situ e microscopia de dois fótons para estabelecer uma plataforma confiável para visualizar a dinâmica do remodelamento da matriz extracelular (MEC) durante a esteato-hepatite não alcoólica (EHNA).

Imagem 3D da Matriz Extracelular Hepática em Modelo de Esteatohepatite Não Alcoólica em Camundongos

Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is the most common chronic liver disease in the United States, affecting more than 70 million Americans. NASH can ...

A EHNA é uma das mais importantes doenças hepáticas crônicas do mundo. Pode evoluir para fibrose, cirrose e, eventualmente, câncer de fígado. Estudar a alteração dinâmica da MEC na EHNA pode ajudar a entender melhor a fibrose.Tradicionalmente os exames de imagem não conseguem demonstrar alterações estruturais da MEC 3D, limitando a compreensão do processo de remodelamento dinâmico da MEC na fibrose hepática. Para começar, pese o mouse antes do procedimento. Após anestesiar o camundongo, raspe a área ventral com um cortador de cabelo e desinfete a pele com etanol 70%.Coloque o mouse nas costas e imobilize as pernas na prancha cirúrgica com fita adesiva. Use tesoura Mayo e pinça Adson para fazer uma incisão de três centímetros lateralmente no abdômen inferior. E então uma incisão de cinco centímetros verticalmente do abdome baixo para o processo xifoide sem abrir a cavidade torácica.Após a abertura do peritônio, coloque suavemente os intestinos à esquerda do animal e eleve o lobo direito do fígado com um aplicador com ponta de rayon para expor a veia porta. Para cateterizar a veia porta, induzir um cateter IV de calibre 24 na extremidade distal da veia porta. Coloque a ponta do cateter antes que a veia porta se ramifica para os lobos hepáticos.Retire a agulha imediatamente quando o cateter entrar na veia. Verifique se o cateter está corretamente posicionado dentro da veia perfundindo o fígado com PBS usando uma seringa de um mililitro através do cateter. Utilizar micropinça Dumont, microagulha Castroviejo e sutura 4-0 para colocar um ponto abaixo da ramificação da veia porta e um segundo ponto um centímetro abaixo para fixar o cateter.Conecte o cateter a um tubo de silicone de um metro de comprimento, três milímetros de diâmetro interno e 4,1 milímetros de diâmetro externo com um conector de isca. Conecte a tubulação de silicone a uma bomba peristáltica e a um reservatório contendo água deionizada. Remova cuidadosamente as bolhas de ar dentro do tubo e evite gerar novas bolhas durante a perfusão.Ajuste a bomba peristáltica a uma saída de fluxo de 0,2 mililitros por minuto. Examine primeiro com água deionizada por duas horas e a cor do fígado mudará de vermelho para amarelo durante a perfusão. Troque a solução de perfusão para desoxicolato de sódio a 0,5% e continue durante a noite e o fígado ficará branco no final da perfusão.Troque a solução de perfusão por água deionizada e perfunda por duas horas. Use micropinças Dumont e tesouras de mola micro para coletar o fígado descelularizado e lavá-lo cuidadosamente em uma placa de Petri com PBS. Transfira um pequeno pedaço de fígado descelularizado para uma lâmina de microscópio e coloque o tecido no meio.Adicione 10 microlitros de meio de montagem antifade ao tecido com uma pipeta para evitar o ressecamento do tecido. Cubra o tecido com um vidro de cobertura e aplique uma pequena força para achatar a amostra. Sele as bordas do vidro da tampa com esmalte incolor e transparente.Coloque uma gota de óleo de imersão na parte superior do vidro da tampa e coloque a lâmina no suporte da lâmina do microscópio. Abaixe a lente objetiva de óleo 20X até entrar em contato com o óleo de imersão. Mude para o canal violeta de comprimento de onda de 405 nanômetros.Ligue o obturador e concentre a amostra. Navegue e posicione a área de interesse para geração de imagens. Desligue o obturador antes de passar para a aquisição de imagens usando luz laser.Para iniciar o laser de dois fótons, alterne para o controle do computador e ligue o laser de dois fótons primeiro. Em seguida, ligue o controlador de laser de dois fótons e o obturador, garantindo que a potência de saída seja superior a 2,5 watts. Reduza a potência do laser para evitar a têmpera da fluorescência.Selecione e ajuste os detectores, tanto os multiplicadores de fotos quanto o híbrido para acomodar os fluoróforos escolhidos. Escolha aquisições de imagens simultâneas ou sequenciais. Ajuste o orifício para o valor mais alto.Ajuste os comprimentos de onda do laser, ganho, potência, deslocamento do tempo de permanência do pixel, média do tamanho do pixel e zoom. Role o controlador Z do computador e defina as dimensões Z. Defina os pontos de início e fim e escolha os números de imagens fornecidos dentro de um volume.Adquirir imagens. Após a realização da microscopia dos dois fótons, as fibras colágenas sem descelularização revelaram uma imagem de baixa resolução da rede colágena. Na matriz extracelular decelularizada, diferenças aparentes foram observadas na morfologia e distribuição espacial entre fígados de ração e dieta fast food.Fibras colágenas e camundongos em dieta com ração exibiram uma rede entrelaçada e bem organizada, enquanto os camundongos em dieta fast food apresentaram feixes de colágeno com menor conectividade. A estrutura tridimensional da matriz extracelular hepática mostra que as fibras colágenas em camundongos na dieta chow mostraram uma rede bem organizada, mas não em camundongos dieta fast food. Para confirmar a qualidade do colágeno fibrilar na matriz extracelular decelularizada, as lâminas foram coradas com Hematoxilina Eosina e Picrosirius red.A hematoxilina e a eosina mostram que todas as células foram removidas. Nas imagens de coloração vermelha do Picrosirius, a matriz extracelular dos camundongos alimentados com ração revelou uma rede bem organizada. E, em contraste, camundongos em dieta de fast food mostraram fibras de colágeno mais densas.Remova cuidadosamente a bolha dentro de um tubo antes da perfusão. A bolha bloqueará o vaso no fígado e afetará a perfusão.

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Medicine

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A imagem intravital estável de alta resolução de células imunes no fígado é um desafio. Aqui, fornecemos um método altamente sensível e confiável para estudar a migração e as interações célula-célula de células imunes no fígado de camundongo por longos períodos (cerca de 6 horas) por microscopia de varredura a laser multifotônica intravital em combinação com monitoramento de terapia intensiva.

Long Term Intravital Multiphoton Microscopia de imagem de células imunes no saudáveis ​​e doentes do fígado por meio CXCR6.Gfp Reporter Mice

Apresentado aqui é um protocolo para o isolamento de hepatócitos de camundongos de fígados de camundongos adultos usando uma técnica de perfusão de colagem modificada. Também é descrita a cultura de longo prazo dos hepatócitos em um ambiente de sanduíche de colágeno 3D, bem como imunorotulagem dos componentes citoesqueléticos para estudar a formação canalicular biliar e sua resposta ao tratamento.

Isolamento e cultura sanduíche de colágeno 3D de hepatócitos de camundongos primários para estudar o papel do citoesqueleto na formação bile canalicular in vitro

Este protocolo apresenta um modelo biomimético 3D com compartimento estrommal fibroso que acompanha. Preparado com hidrogéis fisiologicamente relevantes em proporções que imitam as propriedades biofísicas da matriz extracelular estrominal, mediador ativo de interações celulares, crescimento tumoral e metástase.

Um modelo biomimético para câncer de fígado para estudar interações tumorais-estroma em um ambiente 3D com propriedades biofísicos incapazes

Este protocolo descreve o uso de uma técnica de ultrassom aprimorada para observar e quantificar invasivamente as alterações nos tecidos hepáticos em modelos de roedores de doença hepática gordurosa não alcoólica.

Aplicação de Ultrassom e Elastografia de Ondas de Cisalhamento em um modelo de rato de NAFLD/NASH

Doenças hepáticas são induzidas por muitas causas que promovem fibrose ou cirrose. O transplante é a única opção para recuperar a saúde. No entanto, dada a escassez de órgãos transplantáveis, alternativas devem ser exploradas. Nossa pesquisa propõe a implantação de andaimes de colágeno no tecido hepático a partir de um modelo animal.

Implantação de andaimes de matriz de colágeno tridimensional como estratégia de regeneração hepática

Usando um modelo de camundongo com doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) induzida por dieta, descrevemos o uso de novas técnicas de microtomografia computadorizada in vivo como um método não invasivo para avaliar os estágios de progressão da DHGNA, enfocando predominantemente a rede vascular hepática devido ao seu envolvimento significativo na desregulação hepática relacionada à DHGNA.

Novas Técnicas de Imagem por Microtomografia Computadorizada In Vivo para Avaliação da Progressão da Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica

O objetivo deste estudo foi desenvolver um novo modelo digital tridimensional para o diagnóstico precoce da fibrose hepática, que inclua a rigidez de cada voxel no fígado do paciente e possa, assim, ser usado para calcular a razão de distribuição do fígado do paciente em diferentes estágios de fibrose.

Modelo digital tridimensional para diagnóstico precoce de fibrose hepática baseado em elastografia por ressonância magnética

Aqui, descrevemos uma plataforma que permite imagens in vivo não invasivas de esferoides hepáticos enxertados na câmara anterior do olho do camundongo. O fluxo de trabalho abrange desde a geração de esferoides de células hepáticas primárias até o transplante para o olho do camundongo e imagens in vivo em resolução celular por microscopia confocal.

Imagens in vivo de esferoides hepáticos enxertados na câmara anterior do olho do camundongo

Modelo de camundongo de doença hepática esteatótica associada à disfunção metabólica (MASLD) com disfunção metabólica, alterações na expressão gênica hepática e alterações histopatológicas hepáticas que se assemelham à MASLD humana, incluindo fibrose que progride para fibrose avançada estágio 3. Esse modelo pode ser usado em estudos de fisiopatologia da MASLD e em estudos pré-clínicos de novas terapias.

Modelo de camundongo de doença hepática esteatótica associada à disfunção metabólica com fibrose

Esse protocolo introduz uma Ferramenta de Imagem Hepática Reutilizável (RHIT) de ponta para microscopia intravital (IVM) de camundongos vivos, que aprimora a estabilidade dos tecidos para experimentos rápidos e agudos. O design impresso em 3D do RHIT oferece produção, escalabilidade e versatilidade com custo-benefício, permitindo observação prolongada dos processos metabólicos em camundongos de vários tamanhos.

Ferramenta Reutilizável de Imagem Hepática: Uma Ferramenta Reutilizável Impressa em 3D para Microscopia Intravital Hepática

Este protocolo apresenta um pipeline abrangente de imagem para visualizar e modelar a morfologia das células estreladas hepáticas em tecido hepático intacto. Essa abordagem combina marcação fluorescente de fibroblastos usando genética de camundongos, preparação de tecidos baseada em perfusão hepática in situ e um método modificado de limpeza de tecidos iDISCO para alcançar transparência óptica.

Mapeamento da morfologia das células estreladas hepáticas em modelos camundongos de fibrose hepática

Aprenda a visualizar a remodelação da matriz extracelular em modelo de esteatohepatite não alcoólica usando perfusão hepática in situ e microscopia de dois fótons. Este método avançado permite estudar a fibrose hepática em camundongos.

Imagem 3D da Matriz Extracelular Hepática em Modelo de Esteatohepatite Não Alcoólica em Camundongos

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