Name: Quantificação do impacto potencial dos produtos à base de glifosato em microbiomas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Explore uma metodologia bioinformática para quantificar os efeitos do glifosato em microbiomas de plantas, animais e solo. Este fluxo de trabalho integra experimentos de campo e análises computacionais para avaliar a sensibilidade microbiana.

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Este trabalho foi financiado pela Academia da Finlândia (conceder no. 311077 a Marjo Helander).

Conflitos de interesse: nenhum.

Este protocolo fornece orientação geral sobre como quantificar o efeito do GBP em microbiomas com base na análise da proteína EPSPS. O protocolo tem três grandes etapas críticas: (i) Quantificação da proteína EPSPS a partir de dados de microbioma. Esta etapa é fundamental porque o EPSPS é a enzima alvo direta do herbicida. Assim, as espécies que possuem uma cópia do gene EPSPS podem ser impactadas pelo uso de GBP. No entanto, mesmo espécies que não possuem cópia do gene EPSPS podem ser impactadas pelo herbicida através de mecanismos alternativos não-alvo43,44. (ii) Se a análise do gene EPSPS não estiver incluída no desenho do estudo, é possível obter uma boa estimativa analisando o rRNA 16S (bactérias) ou ITS (fungos). Neste caso, é essencial contar com uma tabela de referência abrangente (por exemplo, o banco de dados ATGC fornece sequências da proteína EPSPS de várias espécies intimamente relacionadas). (iii) A proteína EPSPS é dividida em potencialmente sensível ou resistente ao glifosato, dependendo de certos resíduos de aminoácidos do local ativo do EPSPS. No entanto, mutações que afetam um único aminoácido podem alterar essa classificação45 e transições entre as classes podem ocorrer em um período relativamente curto detempo 14.
A sensibilidade potencial dos organismos ao glifosato pode ser determinada por genomas de referência, marcadores de aminoácidos e alinhamentos de sequências. (i) Genomas de referência: A enzima EPSPS pode ser classificada como potencialmente sensível (classe I [alfa ou beta]46,47) ou resistente (classes II48,49, III50 e IV51) ao glifosato com base na presença de marcadores e motivos de aminoácidos (no caso da classe III). Estes marcadores e motivos de aminoácidos baseiam-se na localização de resíduos de aminoácidos na proteína EPSPS de Vibrio cholerae (vcEPSPS, classe I), Coxiella burnetii (cbEPSPS, classe II), Brevundimonas vesicularis (bvEPSPS, classe III) e Streptomyces davawensis (sdEPSPS, classe IV). (ii) Marcadores de aminoácidos: O glifosato interage com a enzima EPSPS e compete com fosfoenolpyruvate (PEP, o segundo substrato da enzima EPSPS)52,53. Em certas espécies, pequenas alterações de aminoácidos na sequência de EPSPS proporcionam maior afinidade para o PEP e uma resistência ao glifosato 12,14,52,54,55. Em outras sequências, o glifosato liga a sequência EPSPS em uma conformação não inibitória 45. Embora muitas sequências resistentes de 12,14,48,49,52,54,55 e tolerantes 56,57 sequências de EPSP ao glifosato tenham sido descritas, o sistema de classificação atual para o EPSPS é dividido em quatro classes principais (I-IV )12 (Tabela 5 ). (iii) Alinhamentos de sequência: Para classificar uma enzima EPSPS, realizamos alinhamentos em pares, com um alinhamento de sequência múltipla de parâmetros padrão do programa35-, da sequência de consulta contra cada uma das sequências de referência (vcEPSPS, cbEPSPS, bvEPSPS e sdEPSPS). Esses alinhamentos são necessários para identificar as posições dos marcadores de aminoácidos na sequência de consulta. Como resultado, uma enzima é classificada como descrita de12 classes I, II e/ou IV com base na presença de marcadores de aminoácidos e marcadores de motivos baseados na classe III.
O protocolo é baseado em quatro tipos conhecidos de EPSPS: um tipo é sensível, os outros três são resistentes). No entanto, aproximadamente 10% das sequências de EPSPS em procariotes ainda não são classificadas (16% em archaea e 8% em bactérias)12. Assim, novas pesquisas devem analisar essas sequências para determinar a sensibilidade do glifosato. O servidor EPSPSClass oferece uma opção para testar novos marcadores genéticos. A identificação de classes conhecidas do EPSPS é simples, como mostrado na seção 4.4. e Figura 5. Além disso, nos casos em que os usuários querem comparar suas próprias proteínas de consulta e referência, o servidor oferece uma opção para incluir manualmente uma sequência de referência e um conjunto de marcadores de aminoácidos (Figura 11). Esta opção pode ser utilizada para identificar novas classes do EPSPS, bem como para testar outros herbicidas e sequências de destino.
A análise da classe EPSPS é determinada pela análise de sequência e pela presença/ausência de marcadores de aminoácidos. Esta é uma estimativa preliminar que pode ser usada para testes de hipóteses no campo. Os marcadores de aminoácidos foram determinados na literatura com base em estudos empíricos e observacionais 46,47,48,49,50,51. No entanto, sequências proteicas de referência para determinar a classe EPSPS foram testadas apenas em um número limitado de espécies e podem ocasionalmente não explicar a resistência ao glifosato. O efeito de mutações compensatórias e domínios associados ao EPSPS (principalmente em fungos) também podem afetar a sensibilidade ao glifosato58. A análise deste artigo é baseada em quatro classes EPSPS. Um levantamento de bactérias no microbioma intestinal humano mostrou que cerca de 30% delas não foram classificadas (ou seja, proteínas EPSPS dessas espécies não pertencem a nenhuma das classes conhecidas), e estudos adicionais são necessários para identificar outras classes EPSPS. Além disso, deve-se notar que a sequência de proteínas EPSPS em bactérias e plantas é unidomain, enquanto as proteínas Fúngicos EPSPS contêm vários domínios59. Assim, uma proteína dobrável em fungos pode levar a uma resposta diferente da enzima EPSPS ao glifosato. Além disso, não são considerados mecanismos adicionais de resistência não-alvo (por exemplo, bombas efflux e superexpressão do gene EPSPS 13) ou sensibilidade ao glifosato (por exemplo, o efeito do glifosato na cadeia de transporte mitocondrial12).
Embora os GBPs existam como um herbicida desde 1974 e tenham sido amplamente utilizados desde 1991, este é o primeiro método bioinforático a determinar a sensibilidade potencial dos organismos ao glifosato. O método baseia-se na identificação de resíduos conhecidos de aminoácidos na sequência alvo. Assim, nosso método fornece uma estimativa de linha de base do efeito potencial do glifosato na espécie. Em um futuro próximo, novos métodos de bioinformática devem incluir classes adicionais da proteína EPSPS para determinar a sensibilidade potencial ao glifosato de sequências não classificadas 12,54,55. Além disso, dado que o comportamento exato da enzima EPSPS pode variar de acordo com as alterações únicas de aminoácidos 12,14,52,54,55, mais adiante nos experimentos de silico devem levar em conta pequenas variações na dobra da proteína EPSPS, bem como o efeito dos domínios associados ao EPSPS na estrutura proteica em fungos 58 . Além disso, mostrou-se que a tolerância ao glifosato pode ser produzida pela superexpressão da proteína EPSPS56,57; assim, análises bioinformáticas baseadas na amenização do uso decodon 60 podem ser utilizadas para identificar novas sequências de EPSPS que maximizam ou minimizam a expressão genética.
Agricultores, políticos e tomadores de decisão precisam urgentemente de uma compreensão completa dos riscos associados ao uso pesado de pesticidas. Assim, ambas as ferramentas bioinformáticas que revelam a sensibilidade potencial dos organismos a pesticidas e estudos experimentais bem replicados, randomizados e realistas de campo realizados em diferentes ambientes são necessários. O método bioinforático apresentado projetado para examinar a sensibilidade dos organismos ao glifosato pode ser modulado para outros pesticidas. Da mesma forma, os métodos de ecologia experimental podem ser aplicados para estudar quaisquer questões ecológicas relacionadas. Juntos, os métodos podem ser usados para demonstrar baixas entre observações de campo, dados genômicos e uso de pesticidas. Todos os métodos apresentados são inestimáveis na avaliação de riscos. Métodos bioinforáticos podem ser utilizados, por exemplo, no monitoramento de adaptações microbianas a agrotóxicos e para fornecer um método quantitativo para testar os potenciais outros riscos associados, como o aumento da resistência de patógenos a agrotóxicos, efeitos negativos sobre micróbios usados como agentes de controle biológico no manejo integrado de pragas (IPM) e resistência a antibióticos em bactérias.

O uso intenso de agrotóxicos na agricultura moderna é claramente um dos principais contribuintes para o declínio da biodiversidade1. Este artigo se concentra no glifosato porque os produtos à base de glifosato (GBPs) tornaram-se os pesticidas mais utilizados globalmente devido à sua eficiência e preço acessível 2,3. Além de matar ervasdas em campos agrícolas, os GBPs são comumente usados em silvicultura, ambientes urbanos e hortas domésticas; além disso, eles foram proclamados como nãotóxicos para organismos não-alvo se usados de acordo com as instruções do fabricante. No entanto, um número crescente de estudos recentes revelou que os resíduos de glifosato e seus produtos de degradação podem ser retidos e transportados em solos, tendo efeitos em cascata em organismos não-alvo 4,5,6,7,8 . Os efeitos do glifosato não se limitam apenas às plantas - o caminho shikimate está presente em muitos fungos e procariotes também. O glifosato tem como alvo a enzima 5-eolpyruvylshikimate-3-fosfato synthase (EPSPS) no caminho shikimate, também conhecido como aroA9. Esta enzima está no centro do caminho shikimate na síntese dos três aminoácidos aromáticos essenciais (fenilalanina, tyrosina e triptofano), e está presente na maioria dos procariotes, plantas e fungos10,11. Algumas espécies microbianas desenvolveram resistência parcial ou absoluta ao glifosato por meio de vários mecanismos, incluindo mutações nas sequências de EPSPS. Assim, tem sido sugerido que o uso de GBPs pode ter um efeito direto sobre microbiomas vegetais e animais, incluindo o microbioma intestinal humano 12,13,14. No entanto, o uso de GBP pode ter um impacto adverso em praticamente qualquer função e serviço do ecossistema que dependem de micróbios e processos facilitados por micróbios. As ameaças consequentes podem estar em processos bioquímicos do solo, biologia da polinização e bem-estar animal e humano. Isso exige uma compreensão mais abrangente de como o glifosato afeta caminhos e métodos shikimate para avaliar a sensibilidade dos micróbios ao glifosato.
Neste protocolo, apresentamos um pipeline para testar o efeito do glifosato e do GBP no microbioma, desde experimentos de campo até análises bioinformáticas. Descrevemos em detalhes um método bioinforático recentemente publicado que pode ser usado para determinar a sensibilidade potencial dos organismos ao glifosato12. Para o conhecimento dos pesquisadores, esta é a primeira e até agora, a única ferramenta bioinformática para avaliar a sensibilidade intrínseca da enzima EPSPS ao componente ativo dos GBPs. Este método bioinformática baseia-se na detecção de marcadores de aminoácidos conhecidos na enzima alvo do glifosato (EPSPS)12. O gasoduto é dividido em cinco fases principais de trabalho (Figura 1): 1) uma breve introdução a dois experimentos de campo para testar o efeito de GBPs, 2) um breve resumo das análises de microbioma (16S rRNA, ITS e gene EPSPS ), 3) coletando sequências EPSPS de repositórios públicos, 4) determinando a sensibilidade potencial dos organismos ao glifosato e 5) avaliando a classe EPSPS a partir de marcadores microbianos universais (16S rRNA e ITS).

<table><tbody><tr><td>2100 Bioanalyzer Instrument</td><td>Agilent</td><td>G2939B</td><td>Para verificar a concentração e a qualidade dos produtos de PCR</td></tr>, <tr><td>mistura dNTP (10 mM cada)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0192</td><td>Para reações de PCR</td></tr>, <tr><td>kit de DNA polimerase GoTaq G2</td>, <td>tampão de PCR Promega</td><td>M7848</td><td>e DNA polimerase para amplificação de PCR,</td></tr><tr><td>Mini Kit de Planta de Spin Invisorb</td>, <td>1037100300 Molecular INVITEK</td><td></td><td>Extração de DNA genômico de tecidos vegetais</td></tr><tr><td>Ion Chip Minifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4479672</td><td>Para sequenciamento direcionado de produtos de PCR microbiano</td></tr><tr><td>Sistema Ion PGM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4462921</td><td>Para sequenciamento direcionado de produtos de PCR microbiano</td></tr><tr><td>Ion PGM Torrent Server</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4483643</td><td>Para sequenciamento direcionado de produtos de PCR microbiano</td></tr><tr><td>Pippinprep</td><td>SageScience</td><td>PIP0001</td><td>Para fracionamento de tamanho de amplicons de PCR</td></tr><tr><td>Tanque de pressão</td><td>Berthoud</td><td>102140</td><td>Para pulverização de produtos à base de glifosato no campo</td></tr><tr><td>Primers</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Feito sob medida</td><td>Para amplificação de PCR</td></tr><tr><td>Enxada rotativa</td><td>Grillo</td><td>984511</td><td>Para lavrar o solo em parcelas experimentais</td></tr><tr><td>S1000 ThermalCycler</td><td>1852196 BIO-RAD</td><td></td><td>para amplificação de PCR</td></tr></tbody></table>

quantificação do impacto potencial dos produtos à base de glifosato em microbiomas

Quantification of the Potential Impact of Glyphosate-Based Products on Microbiomes

Os produtos à base de glifosato (GBP) são os herbicidas de amplo espectro mais comuns em todo o mundo. O alvo do glifosato é a enzima 5-eolpyruvylshikimate-3-fosfato synthase (EPSPS) no caminho shikimate, que é virtualmente universal nas plantas. A inibição da enzima interrompe a produção de três aminoácidos essenciais: fenilalanina, tyrosina e triptofano. O EPSPS também está presente em fungos e procariotes, como arqueias e bactérias; assim, o uso de GBP pode ter impacto na composição do microbioma de solos, plantas, herbívoros e consumidores secundários. Este artigo tem como objetivo apresentar diretrizes gerais para avaliar o efeito do GBP em microbiomas, desde experimentos de campo até análises bioinformáticas e fornecer algumas hipóteses testáveis. Dois experimentos de campo são apresentados para testar o GBP em organismos não-alvo. Primeiro, micróbios associados a plantas de 10 lotes de tratamento replicados e GBP simulando o plantio não-até o plantio são amostrados e analisados. No segundo experimento, foram obtidas amostras de parcelas experimentais fertilizadas por estrume de aves contendo resíduos de glifosato ou estrume de controle não tratado. A análise bioinformática das sequências proteicas EPSPS é utilizada para determinar a sensibilidade potencial dos micróbios ao glifosato. O primeiro passo para estimar o efeito do GBP nos microbiomas é determinar sua sensibilidade potencial à enzima alvo (EPSPS). Sequências microbianas podem ser obtidas a partir de repositórios públicos ou por meio de amplificação pcr. No entanto, na maioria dos estudos de campo, a composição do microbioma tem sido determinada com base em marcadores universais de DNA, como o rRNA 16S e o espaçador transcrito interno (ITS). Nestes casos, a sensibilidade ao glifosato só pode ser estimada através de uma análise probabilística das sequências de EPSPS utilizando espécies intimamente relacionadas. A quantificação da sensibilidade potencial dos organismos ao glifosato, com base na enzima EPSPS, fornece uma abordagem robusta para novos experimentos para estudar mecanismos de alvo e não-alvo resistentes.

O objetivo deste protocolo é fornecer um pipeline geral, desde experimentos de campo até análises bioinformáticas, que quantifique a sensibilidade potencial dos organismos ao glifosato de herbicida. No Experimento 2, a concentração média de glifosato na ração de codorna foi de 164 mg/kg e a concentração média de glifosato das amostras de excreta (urina e matéria fecal combinada) foi de 199 mg/kg. As camas coletadas de codornas alimentadas com ração contaminada por GBP tinham, em média, 158 mg/kg e roupas de cama de controle medindo 0,17 mg/kg de glifosato (Tabela 3). Nos experimentos de campo, as espécies vegetais responderam de forma diferente aos resíduos de glifosato nos solos (seção 1). A biomassa de estupro de aveia e nabo foi maior em solos de controle em comparação com solos tratados com GBP. No entanto, o feijão faba e a batata pareciam se beneficiar do tratamento gbp no final da temporadade cultivo 15. O glifosato no estrume avícola diminuiu o crescimento vegetal na grama (Pratensis Festuca) e morango (Fragaria x vescana) (seção 1). As análises de microbiota dos experimentos de campo ainda não foram totalmente analisadas e não são apresentadas aqui (seção 2). Os resultados deste protocolo, quando lidos diretamente (como mostrado nas seções 3 e 4) ou indiretamente (seção 5), fornecem uma medida da proporção de organismos potencialmente sensíveis e resistentes ao glifosato em um conjunto de dados (Figura 9). O uso deste método foi testado com uma coleção de sequências proteicas EPSPS de espécies microbianas do microbioma intestinal humano núcleo que foram obtidos a partir de repositórios públicos12. No estudo, foram analisadas 890 cepas das 101 espécies bacterianas mais abundantes com o método EPSPSClass para quantificar a proporção de bactérias sensíveis e resistentes. Os resultados mostraram que 54% das espécies do microbioma intestinal humano são potencialmente sensíveis ao glifosato12. Essa tendência também é observada na maior parte do mundo procariótico; além disso, em eucariotes (principalmente plantas e fungos), a proporção de espécies potencialmente sensíveis é ainda maior12. Além disso, utilizamos este método para quantificar mudanças de sensibilidade na proteína EPSPS a um nível microevolucionário (Figura 10)14. Identificamos alterações no estado de sensibilidade em 12 dos 32 grupos intimamente relacionados de procariotes analisados (Tabela 4)14. Assim, o uso contínuo dos GBPs pode produzir disbiose microbiana (ou seja, um desequilíbrio de espécies bacterianas sensíveis e resistentes) em microbiomas vegetais, animais e solo. Além disso, tem-se hipótese de que um aumento das bactérias resistentes ao glifosato pode promover microbiomas multidroga resistentesa multidrogas 14,41,42. Assim, este protocolo lança luz sobre a interpretação de todos esses cenários, uma vez que o método de classificação EPSPS fornece uma estimativa direta da sensibilidade intrínseca dos microbiomas ao glifosato. Devido à sensibilidade intrínseca da proteína EPSPS ao glifosato é filogeneticamente conservada14, é possível extrapolar os resultados dos conjuntos de dados existentes em microbiomas desconhecidos (Figura 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig01.jpg"> Figura 1: Pipeline geral Este é um pipeline geral para analisar a sensibilidade ao GBP desde experimentos de campo até análises bioinformáticas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig02.jpg"> Figura 2: Experimento de campo 1 para testar os efeitos dos resíduos de GBP em micróbios associados à cultura. O campo experimental consiste em alternar 10 parcelas de controle e parcelas de tratamento de 10 GBP (23 m x 1,5 m) com tiras tampão de 1,5 m entre as parcelas. Duas vezes por ano desde 2014, as parcelas gbp foram tratadas com GBP comercial (concentração de glifosato 450 g L-1, taxa de aplicação 6,4 L ha-1 em 5 L de água da torneira por parcela) e os lotes de controle com a mesma quantidade de água da torneira sem glifosato. Os tratamentos foram aplicados com um tanque de pressão operado à mão usando um capuz plástico na ponta do aspersor para proteger os GBPs de se espalharem fora das parcelas de tratamento. Após um período de segurança de duas semanas após a aplicação do GBP, foram semeadas aveia (Avena sativa), faba beans (Vicia faba) e nabo (Brassica rapa subsp. oleifera) e batatas (Solanum tuberosum) foram plantadas nas parcelas. Amostras de microbiota das plantas, folhas e raízes estudadas foram coletadas várias vezes desde o início do experimento, em 2014. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig03.jpg"> Figura 3: O experimento de campo 2 testou as consequências dos resíduos de GBP em fertilizantes de estrume para duas culturas perenes e sua microbiota associada. Roupas de cama coletadas de um experimento aviário de 12 meses com codornas japonesas alimentadas com controle ou ração contaminada por GBP foram usadas como fertilizante de estrume em um experimento de campo. O campo experimental consistia de 18 lotes de controle e 18 GBP (1 m x 1 m) dispostos em uma grade de tabuleiro de xadrez 6 x 6. As camas foram espalhadas no campo experimental duas vezes, em agosto de 2018 e maio de 2019 (25 L/enredo). As parcelas de controle foram fertilizadas com roupas de cama coletadas de codornas alimentadas com alimentação de controle e parcelas GBP com camas de codornas alimentadas com ração contaminada por GBP. Os resíduos de glifosato nas roupas de cama de controle foram de 0,17 mg/kg de glifosato e na cama GBP, a quantidade foi de 158 mg/kg de glifosato. Dois endofito-simbióticos (E+), dois sem endofito (E-) Festuca pratensis e dois Fragaria x vescana foram plantados por parcela em setembro de 2018, aproximadamente um mês após a propagação das primeiras camas. As medições do desempenho e da aptidão da planta, bem como a amostragem para microbiota associada à raiz e à folha foram realizadas durante duas estações de crescimento consecutivas (2019 &amp; 2020). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig04.jpg"> Figura 4: Análise da taxa microbiana utilizando 16S rRNA gene/REGIÃO ITS e sensibilidade de microbiomas para glifosato utilizando o gene EPSPS . (A) Análise das sequências de rRNA ou ITS 16S para identificar taxas microbianas. (B) Análise das sequências de EPSPS para identificar sensibilidade de micróbios ao glifosato (sensível ao gs-glifosato/gr-glifosato resistente) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig05.jpg"> Figura 5: Algoritmo para identificar a classe de sequências proteicas EPSPS. A entrada é uma sequência de proteínas EPSPS no formato FASTA. O algoritmo realiza comparações com marcadores conhecidos de aminoácidos em sequências proteicas de referência que determinam a sensibilidade potencial ao glifosato. O algoritmo foi implementado no servidor web epspsclass29 de acesso livre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig06.jpg"> Figura 6: Entradas e saídas básicas do servidor web EPSPSClass. (A) Entrada: uma sequência de proteínaS EPSPS no formato FASTA. (B) Saída 1 - identidade: fração de marcadores de aminoácidos presentes nas sequências de consulta (Classes I-IV)e motivos (Classe III). (C) Saída 2 - identidade: alinhamentos das sequências de consulta e referência. (D) Saída 3 - alinhamentos em pares das sequências de consulta e referência. (E) Referência sequências de EPSPS: Vibrio cholerae (vcEPSPS, classe I), Coxiella burnetii (cbEPSPS, classe II), Brevundimonas vesicularis (bvEPSPS, classe III), Streptomyces davawensis (sdEPSPS, classe IV). (F) Links para realizar pesquisas de blastp de adição e identificação de domínios conservados <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig07.jpg"> Figura 7: Acesso a conjuntos de dados pré-computados de sequências EPSPS. Siga as indicações na figura para acessar o conjunto de dados pré-computado das sequências EPSPS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig08.jpg"> Figura 8: Exemplo de como estimar a sensibilidade potencial em projetos de microbioma sem sequências de EPSPS. O exemplo usa valores do banco de dados de Clusters Genômicos Apertados Alinhados30, que contém sequências de espécies procarióticas. Espécies hipotéticas de um projeto de microbioma são Staphylococcus aureus, Corynebacterium difhtheriae, Campylobacter jejuni, Chlamydia psittaci e Sulfolobus islandicus. O escore de sensibilidade ao glifosato é calculado como Number_Sensitive_Sequences/Total_Number_Of_Sequences. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig08large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig09.jpg"> Figura 9: Esquema de interpretação dos resultados deste protocolo e cenários evolutivos hipotéticos. (A) Em um microbioma, a proporção de sensibilidade potencial (em verde) e resistência (em vermelho) bactérias é de aproximadamente 50:50. Pontos negros denotam espécies microbianas não classificadas; assim, sua sensibilidade ao glifosato é desconhecida. Em alguns microbiomas, a proporção de bactérias sensíveis é ligeiramente maior, como no microbioma intestinal humano12. (B) Com o tempo, o uso do glifosato pode levar à disbiose microbiana (ou seja, um desequilíbrio na proporção de bactérias sensíveis e resistentes) levando a diferentes cenários hipotéticos. (C) Caso hipotético 1 (sem seleção): O uso do glifosato não influencia o microbioma; assim, a proporção de bactérias sensíveis e resistentes permanece constante. (D) Caso hipotético 2: O uso do glifosato remove bactérias sensíveis ao glifosato da população. Especulamos que este cenário pode ser dependente de doses. (E) Caso hipotético 3: A pressão de seleção do uso do glifosato aumenta as mutações no gene EPSPS que alteram o estado de sensibilidade das bactérias. Assim, toda a população microbiana torna-se resistente ao glifosato. Além disso, neste cenário, pode haver um aumento de bactérias multirresistentes. (F) Caso hipotético 4: o uso de glifosato altera a composição de determinadas espécies bacterianas, produzindo um desequilíbrio em relação às bactérias resistentes, enquanto algumas espécies bacterianas permanecem sem alterações, possivelmente devido a mecanismos resistentes adicionais, como bombas de efflux ou por superexpressão do gene EPSPS 13. Esse cenário também pode levar a um aumento de bactérias resistentes ao glifosato, bem como um aumento da resistência bacteriana a antibióticos adicionais. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig09large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig10v2.jpg"> Figura 10: Distribuição da sensibilidade prevista ao glifosato em toda a árvore da espécie. Gráficos de tortas indicam a proporção de espécies que são putativamente sensíveis (verde) ou resistentes (vermelho) ao glifosato, e não classificadas (pretas). Este valor foi adaptado com permissão de Rainio et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig10largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig10.jpg"> Figura 11: Entradas e saídas do servidor web EPSPSClass para testar a sequência de referência do próprio usuário. (A) Entrada 1: sequência de consulta. (B) Entrada 2: sequência de referência. (C) Entrada 3: marcadores de aminoácidos nas sequências de referência. (D) Saída: identidade: fração de marcadores de aminoácidos nas sequências de consulta (classe I-IV e sequências de referência do próprio usuário). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig10large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: Lista de primers para amplificação pcr de 16S ração e região ITS na análise de microbioma <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/Table%201-63109R2.xlsx" target="_blank">Por favor clique aqui para baixar esta Tabela.</a>
Tabela 2: Códigos da enzima 5-enolpyruvylshikimate-3-fosfato synthase (EPSPS) em diferentes bancos de dados <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/Table%202_63109R2.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta Tabela.</a>
Tabela 3: Concentração média de glifosato <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/Table%203-63109R2.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta Tabela.</a>
Tabela 4: Tabela sumária da porcentagem de espécies sensíveis/resistentes ao glifosato. Esta tabela foi adaptada com permissão de Rainio et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/Table%204-63109R2.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta Tabela.</a>
Tabela 5: Posições dos marcadores de aminoácidos nas sequências de referência <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/Table%205-63109R2.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta Tabela.</a>

Os produtos à base de glifosato (GBP) são os herbicidas de amplo espectro mais comuns em todo o mundo. Neste artigo, introduzimos diretrizes gerais para quantificar o efeito do GBP nos microbiomas, desde experimentos de campo até análises bioinformáticas.

Quantificação do impacto potencial dos produtos à base de glifosato em microbiomas

Glyphosate-based products (GBP) are the most common broad-spectrum herbicides worldwide. The target of glyphosate is the enzyme ...

Aqui, fornecemos um fluxo de trabalho que inclui o melhor método bioinforático para conduzir os experimentos para avaliar o efeito do glifosato nos microbiomas. A principal vantagem é que ele fornece uma hipótese testável robusta para futuros experimentos de campo e laboratório. A metodologia descrita pode ser aplicada a uma variedade de sistemas, incluindo plantas, animais e micróbios.Cada parte da metodologia é bastante simples. Talvez a parte mais desafiadora seja integrar uma equipe multidisciplinar capaz de realizar diferentes partes do trabalho. Demonstrando o procedimento estará Suni Matthew, uma pesquisadora do meu laboratório.Para começar, comece a experimentar um dividindo o campo experimental em 10 réplicas de controle e tratamento GBP com tiras tampão de vegetação entre as parcelas. Trate os lotes de controle com água da torneira e os lotes GBP com GBP comercial para imitar a dosagem máxima permitida de glifosato nas práticas agrícolas. Prove a microbiota de plantas experimentais.Colete 10 réplicas das amostras da planta do campo, coloque-as imediatamente no gelo e leve-as ao laboratório para posterior processamento. Para o experimento dois, colete roupas de cama, incluindo aparas de madeira, fezes e alguma ração derramada de codornas alimentadas com rações contaminadas ou de controle de GBP em um experimento aviário de 12 meses. Envie as amostras de cama para um laboratório credenciado para as medidas de concentração de glifosato diretamente após sua disseminação.Plante plantas perenes de grama e morango em cada parcela para estudar sua microbiota raiz e folha. Identifique e remova os micróbios endofíticos lavando e esterilizando as amostras da planta. Uma vez que as amostras sejam esterilizadas, extraia DNA genômico usando um kit de extração de DNA vegetal comercialmente disponível seguindo o protocolo do fabricante.Utilizando uma abordagem aninhada, amplie as regiões variáveis V6 a V8 do gene rRNA 16S e faça mistura mestre pcr para o número necessário de amostras conforme descrito no manuscrito do texto. Para a primeira rodada de PCR, use primers 799 para a frente e 1492 reverso. Configure o perfil de amplificação no termociclador para 35 ciclos.Para verificar a amplificação, realize a eletroforese utilizando cinco microlitres do produto amplificado e, em seguida, dilua os outros 25 microliters do produto PCR em água ultrapura autoclavada na proporção de um a 10. Utilizando os primers universais 1062 para a frente e 1390 invertidos, realize a segunda rodada de amplificação com 25 ciclos. Diluir os produtos PCR resultantes em água ultrapura autoclavada em uma proporção igual.Realize a terceira rodada de amplificação com oito ciclos para marcar os produtos com os códigos de barras e a sequência do adaptador P1. Verifique a concentração na qualidade dos produtos PCR em um bioanalíquio e acumule os volumes que constituem 30 nanogramas de DNA de cada amostra em um tubo de 1,5 mililitro para preparar uma biblioteca equimolar. Selecione os amplicons de tamanho 350 a 550 pares base por fracionamento de tamanho usando um sistema automatizado de seleção de tamanho de DNA em um de gel agarose.Colete o elto contendo os amplicons do tamanho especificado em um frasco no resultando em uma biblioteca genética de rRNA purificada de 16S. Transfira o eluente coletado em um tubo de 1,5 mililitro e verifique a pureza e concentração no bioanalífero. Diluir a biblioteca de DNA usando água ultrauso autoclavada para uma concentração final de 26 picomolar.Para amplificar a região DES, após configurar a reação com os primers ITS, defina o perfil de amplificação no termociclador. Em seguida, analise cinco microliters do produto amplificado em gel de 1,5% agarose e dilua os 25 microlitadores restantes do produto na proporção de um a 10 utilizando água ultrapura autoclavada. Faça mix mestre pcr para o número necessário de amostras com primers avançados marcados por código de barras e primers reversos marcados pelo adaptador P1.Usando o produto PCR diluído como modelo, conduza a segunda rodada de amplificação. Semelhante à preparação da biblioteca para o gene rRNA 16S, prepare a biblioteca para a região ITS purificada. Inicie as análises bioinformáticas da sequência de proteínas EPSPS.Avalie a sensibilidade potencial da sequência de consulta ao glifosato do servidor fornecido saídas onde a saída mostra a fração de marcadores de aminoácidos presentes nas sequências de consulta e o número de motivos. A saída dois mostra alinhamentos da consulta e sequências de referência baseadas em resíduos de marcadores. A saída três mostra alinhamentos completos em pares das sequências de consulta e referência.A saída quatro mostra sequências de referência EPSPS de Vibrio cholerae, Coxiella burnetii, Brevundimonas vesicularis e Streptomyces davawensis. No final da página de saída, encontre links para ferramentas externas como BLASTp e domínios conservados para analisar melhor a sequência de EPS de consulta. Depois de identificar as sequências de EPSPS a partir dos repositórios públicos, acesse esses conjuntos de dados da página principal do servidor da classe EPSPS contendo informações taxonomicas e a classe EPSPS de mais de 50.000 sequências.Pesar a biomassa acima do solo das plantas no final da temporada de campo para comparar o crescimento das plantas em GBP e parcelas de controle. Em uma planilha, mapeie as OTUs bacterianas para experimentos de microbioma em conjuntos de dados pré-computados. E baseado em um escore probabilístico, calcule a sensibilidade intrínseca ao glifosato.Este método foi utilizado para quantificar alterações na sensibilidade da proteína EPSPS em um nível micro evolutivo. Identificamos alterações no estado de sensibilidade em 12 dos 32 grupos intimamente relacionados de procariotes analisados. Assim, o uso contínuo contínuo dos produtos à base de glifosato pode produzir disbiose microbiana nos microbiomas vegetais, animais e solo.Garanta a qualidade dos procedimentos pré e pós-PCR para obter bibliotecas de amplicon ideais. Certifique-se também de que a sequência de proteínas EPSPS não é parcial antes de usar o software. Em experimentos de campo, certifique-se de evitar a contaminação de controles com glifosato.

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Consórcios microbianos dentro bumble colmeias enriquecem e preservar o pólen para larvas de abelha. Usando o sequenciamento de próxima geração, juntamente com o laboratório e experiências no terreno, este manuscrito descreve protocolos usados para testar a hipótese de que resíduos do fungicida alteram o pólen microbiome e demografia de colônia, finalmente levando à colônia perda.

Técnicas empíricas, metagenômicas e computacionais iluminam os mecanismos pelos quais os fungicidas comprometem a saúde das abelhas

Escavação de raízes de plantas do campo, bem como processamento de amostras em endosphere, rizosfera e solo são descritas em detalhes, incluindo os métodos de análise de dados e extração de DNA. Este papel é projetado para permitir que outros laboratórios de usar essas técnicas para o estudo do solo, endosphere e microbiomes da rizosfera.

Isolamento e análise de comunidades microbianas na rizosfera, solo e raízes em experiências de grama perene

Aqui nós fornecemos protocolos detalhados para a administração oral de antibióticos para ratos, coleta de amostras fecais, extração de DNA e quantificação de bactérias fecais por qPCR.

Polimerase quantitativos baseados na reação em cadeia análises de murino Microbiota Intestinal após o tratamento antibiótico Oral

Este protocolo descreve um sistema de fermentação em lote-cultura in vitro de microbiota fecal humana, utilizando inulina (um prebiótico bem conhecido e um dos moduladores de microbiota mais amplamente estudados) para demonstrar o uso deste sistema na estimativa de efeitos de intervenções sobre a composição da microbiota fecal e atividades metabólicas.

Um modelo de cultura em lote in vitro para estimar os efeitos dos regimes intervencionistas na microbiota fecal humana

A secreção de exsudatos radiculares é geralmente uma estratégia de desintoxicação externa para plantas sob condições de estresse. Este protocolo descreve como avaliar o impacto de xenobióticos na alfafa através de análise metabolômica não direcionada.

Coleta de exsudatos radiculares de alfafa para estudo do impacto do ftalato de di(2-etilhexil) na produção de metabólitos

Caenorhabditis elegans é um modelo poderoso para examinar os determinantes moleculares que conduzem as interações hospedeiro-microbioma. Apresentamos um pipeline de alto rendimento traçando o perfil dos níveis de colonização do microbioma intestinal em um único animal, juntamente com os principais aspectos da fisiologia de C. elegans.

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Apresenta-se um protocolo para a determinação da absorção, translocação e distribuição do imidaclopride em trigo sob condições hidropônicas usando cromatografia líquida-espectrometria de massas em tandem (LC-MS-MS). Os resultados mostraram que o imidaclopride pode ser absorvido pelo trigo, e o imidaclopride foi detectado tanto nas raízes quanto nas folhas do trigo.

Determinação da absorção, translocação e distribuição do imidaclopride em trigo

O presente protocolo descreve um método simples e eficiente para a identificação de metabólitos do 2,4-dibromofenol em plantas.

Elucidando o metabolismo do 2,4-dibromofenol em plantas

O protocolo descreve um novo método para avaliar a citotoxicidade integral de metabólitos de pesticidas triazólicos em plantas.

Avaliação da citotoxicidade de metabólitos de pesticidas triazólicos típicos em plantas

Para medir as taxas potenciais de atividade das enzimas extracelulares de solo, substratos sintéticos que são obrigados a um corante fluorescente são adicionados a amostras de solo. A actividade enzimática é medida como o corante fluorescente é libertado do substrato por meio de uma reacção catalisada por enzimas, onde mais elevado de fluorescência indica mais a degradação do substrato.

De alta capacidade Fluorometric Medição do Potencial dos Solos extracelulares atividades enzimáticas

Explore uma metodologia bioinformática para quantificar os efeitos do glifosato em microbiomas de plantas, animais e solo. Este fluxo de trabalho integra experimentos de campo e análises computacionais para avaliar a sensibilidade microbiana.

Quantificação do impacto potencial dos produtos à base de glifosato em microbiomas

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