Isolamento de células musculares lisas aórticas específicas do paciente primário e medidas de contração em tempo real semiquantitativas in vitro

Este método permite que os pesquisadores estudem a contração celular da linha celular múltipla do paciente simultaneamente. Permite estudar doenças de forma mais rápida e eficiente. Esta técnica nos permite quantificar a contração celular em tempo real.

Dentro de uma hora, podemos obter os valores de contração de dezenas de células. Demonstramos pela primeira vez que a contração celular muscular é diminuída em um grupo de pacientes com aneurismas de aoórtico. Este pode ser um novo biomarcador ou alvo para a terapia médica.

Comece esterilizando dois pares de fórceps cirúrgicos e um bisturi, imergindo-os em 70% de etanol e, posteriormente, limpando-os secos. Em seguida, pipeta dois mililitros de meio SMC em uma placa de Petri em que a dissecção tecidual será realizada. Em seguida, pipeta 2,5 mililitros de meio SMC em dois frascos T-25.

Gire os frascos ao redor para que o pequeno volume de meio cubra toda a superfície. Inspecione visualmente a biópsia, identificando as três camadas aórticas pela presença de placas ateroscleróticas no lado intimado e tecido conjuntivo viscoso no lado aventureiro para distinguir as camadas. Para isolar os SMCs da mídia, remova as outras duas camadas colocando o tecido com placa intima para cima primeiro, em seguida, remova a placa sólida puxando-a para longe do tecido com fórceps enquanto empurra o tecido para baixo com o segundo par de fórceps até que a camada medial uniforme rosa seja visível.

Agora vire o tecido e repita o mesmo procedimento puxando a camada aventur se aventuralo, certificando-se de remover todas as partes visíveis em quantas tentativas for necessário, pois essa camada não se desprenderá da mídia facilmente. Uma vez que a camada de mídia esteja isolada, corte o tecido em cubos pressionando a mídia para baixo com fórceps e cortando o tecido em uma direção usando o bisturi fazendo cortes unidirecionais limpos para minimizar os danos. Coloque de 10 a 20 desses pedaços de tecido no quarto superior do frasco T-25 usando fórceps.

Após a esterilização de dois pares de fórceps cirúrgicos e um bisturi como descrito anteriormente, pipeta dois mililitros de meio fibroblasto em uma placa de Petri na qual a dissecção tecidual será realizada. Em seguida, pipeta 2,5 mililitros de meio fibroblasto em dois frascos T-25 e redemoinho os frascos ao redor de modo que o pequeno volume de médio cobre toda a superfície. Inspecione visualmente a biópsia para identificar a epiderme com uma superfície de pele reconhecível, às vezes com cabelos visíveis, em seguida, procure por gordura subcutânea amarela e viscosa no lado oposto.

A camada entre a epiderme e a gordura subcutânea é a derme, a fonte de fibroblastos viáveis. Para isolar os fibroblastos da dermis, remova as outras duas camadas colocando o tecido no lado da dermis para tornar as três camadas visíveis. Em seguida, segure o tecido com fórceps e corte toda a epiderme em uma linha limpa sem danificar o tecido.

Agora vire o tecido e repita o mesmo procedimento cortando dentro da dermis paralela à borda com a gordura subcutânea. Uma vez que a dermis esteja isolada, corte o tecido em cubos pressionando o tecido com fórceps e cortando o tecido em uma direção usando o bisturi. Em seguida, coloque 10 a 20 desses pedaços de tecido no quarto superior do frasco T-25 usando os fórceps.

Conte as células usando um contador celular automatizado e semee os SMCs em triplicado a uma densidade de semeadura de 30.000 células por poço em 200 microliters de meio SMC na placa ECIS revestida de gelatina. Coloque a placa com os SMCs no suporte de 96 poços do ECIS na incubadora de cultura celular. Clique duas vezes no software BioPhysics aplicado pelo ECIS para abrir o programa e pressionar o botão Configuração.

Verifique se todos os eletrodos têm contato com o suporte no painel inferior esquerdo rotulado de Configuração de Poço. Se os eletrodos não estiverem conectados corretamente, ajuste a placa no suporte antes de iniciar a medição. Agora selecione o tipo de placa no mesmo painel clicando no tipo Array.

Em seguida, prepare duas pipetas definidas em dois microliter e 150 microliter volume. Antes de iniciar a estimulação, pressione Mark no software e coloque um comentário. Para estimular as células, remova a tampa e coloque-a em uma superfície estéril dentro da incubadora.

Em seguida, induzir a contração do SMC, pipetando dois microliters da solução de trabalho de ionomicina em cada um bem o mais rápido possível. Uma vez estimuladas todas as células, misture o meio nos poços usando a segunda pipeta. Para determinar a reprodutibilidade de medição interexperimental, duas medidas independentes de todas as linhas de controle e células do paciente foram traçadas como um enredo de Bland-Altman, demonstrando que este método não mostrou variabilidade fora do intervalo de confiança, exceto por uma linha celular outlier.

Dois poços semeados com o mesmo experimento e estimulados simultaneamente mostraram praticamente a mesma curva de resposta contratual. Para validar se a resposta mostrada foi uma contração e não estresse osmótico por causa da estimulação da ionomicina, o meio foi substituído após a estimulação e o comportamento das células foi registrado, o que mostrou que as células estimuladas começaram a se espalhar sobre o eletrodo novamente. A resposta contratil em SMCs derivada de aortas saudáveis e não dilatadas mostrou uma resposta mediana de 61% em comparação com a resposta mediana de 52% de pacientes com aneurisma de aorta abdominal.

A resposta contraída média do grupo controle foi utilizada para identificar quatro pacientes com valores de contração inferiores aos valores normais. A análise da mancha ocidental e a quantificação subsequente confirmaram que as células expressam marcadores SMC. Para determinação da capacidade proliferativa do SMC, foi realizada qPCR para Ki67.

A expressão ki67 foi detectável em todas as células, mas não se correlaciona com a saída de aparelhos. Ao estimular as células para contração, lembre-se de não encanar muitos poços ao mesmo tempo e tentou encanar o mais rápido possível. Este procedimento pode precisar de alguma prática.

Usando esse método, dividimos os pacientes com base em sua contração e para diminuir a contração normal que nos permitiu investigar esses pacientes e as ligações com suas características clínicas, como o tabagismo.